Name: אפיון של הרתי יישוב אבות בעובר העכבר באמצעות In vivo ו במבחנה מבחני (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: למדו אפיון של תאי אב טימיים בעוברי עכברים באמצעות שיטות in vivo ו-in vitro. השיטה משלבת בידוד אונות טימיות, קרינה ושתלים כדי לחקור התפתחות תאי T וקינטיקת ייצורם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

נתמך על ידי המכון פסטר, INSERM, סוכנות הידיעות הלאומית דה משוכלל ונדיר ANR (&#39;Lymphopoiesis&#39; גרנט), להחיות עתיד תכנית השקעות ו&quot; לה ליגת העל contre le הסרטן &quot;.

הצהרת אתיקה: כל הניסויים בוצעו על פי המכון פסטר אתיקת האמנה, שאושרה על ידי משרד החקלאות הצרפתי, ולהנחיות של האיחוד האירופי. מניפולטור עם הכשרה בניתוח מכרסם קטן, מאושר על ידי משרד החקלאות הצרפתי, מבצע את כל ההתערבות כירורגית. הערה: ראה בטבלה נספח 1 המציגה את הליך תכנית 5 שלבים. 1. בחירה של העוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 36 נקבות / 6 CD45.2 C57BL, CD45.1 נקבות 12, 12 C57BL / 6 זכרים CD45.1 ו -12 C57BL / 6 זכרים CD45.2. חוצה את הנקבות עם או גנוטיפ הזכר לייצר עוברי CD45.1 / 2 וCD45.1 משמשים כמקור לכפית או CD45.2 משמש כמקור לאונות הרתי נמען. בית כל הגברים בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג עובר לבידוד E18 TSP, מקום 2 נקבות בכלוב עם CD45.1 אחד גברים בשעה 6, 21 ימים לפני ניסוי ההשתלה. בדוק את הנוכחות של תוסף נרתיק למחרת, לפני הצהריים. SEPAלדרג את הנקבות מחוברות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג עוברי E14 שהתיישב בו כפית, לחזור על התהליך לעיל (1.2), באמצעות CD45.2 גברים, 17 ימים לפני ניסוי ההשתלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג עוברים לבודד E13 TSP, לחזור על התהליך לעיל (1.2), תוך שימוש בזכרים C57BL / 6 CD45.1, 16 ימים לפני ניסוי ההשתלה. </li></ol> 2. Dissection של העוברים תחת אופקי זרימה למינרית הוד הערה: יומיים לפני ניסוי ההשתלה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את הנשים בהריון על ידי נקע בצוואר הרחם או על ידי ממשל מתקדם של גז CO 2 בלפחות 5 דקות, בתא סגור להרוות. ודא מוות על ידי מעצר מוחלט של תנועות אירובית-נשימתי. להרטיב את הבטן עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך אורכי בעור בבטן קו האמצע ולפתוח אותו על ידי משיכת העור לגזרים. פתח את הצפק עם מלקחיים ומספריים בלי לגעת במערכת העיכול. משוך את uter bifidשלנו ולהפריד אותו מהנרתיק עם המספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הרחם ב90 x 15 מ&quot;מ צלחת פטרי המכילה 40-50 מיליליטר DPBS ולחתוך transversally בין decidua של כל עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג מספריים טיפ נאה ומלקחיים בסדר להסיר את קרום שריר הרחם, להוציא את העוברים על ידי חיתוך בין השליה וצק החלמון, ולהסיר את amnios, ששמירה על העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העוברים בצלחת פטרי 90 x 15 מ&quot;מ המכיל HBSS + 1% בסרום עגל עוברי (FCS). לעוברים מבוגרים מE15, להסיר את הראשים עם זוג המספריים לפני כל נתיחה נוספת. </li></ol> 3. בידוד של קורנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת זכוכית המגדלת המשקפת, למקם את העובר, שוכב במצב שכיבה (צפה בגחון), על מצע גזה רטוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס אחד מלקחיים longitudinally לאורך הסחוס של עצם החזה, לצבוט ולפתוח את רשת בית החזה. עם מלקחיים מעוקלים, למשוך את קיר בית החזה בצד כדי להמחיש את tאונות hymic בכל צד של קנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיק בזהירות כל אונה ידי צובט מתחת עם מלקחיים עדינים ומניח אותם בצלחת פטרי המכילה FCS 1 מיליליטר HBSS + 1%. לבודד את האונות ולהסיר רקמת חיבור המקיפה עם שני מזרקים 1 מיליליטר + 26 G ⅜ &quot;מחטים, מבלי לפגוע בכמוסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את האונות ב 3 מיליליטר של FCS + 1% HBSS לחסל תאי דם. הערה: לפני E15, אונות הרתי נמצאות בכל צד של קנה הנשימה והנתיך מאוחר יותר באמצע להוות איבר דו-אוֹנִי. </li></ol> 4. השעיות תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפריד אונות תחת זכוכית המגדלת המשקפת, עם שתי 26 מחטי G רכובים על 1 מיליליטר מזרקים, בFCS + 1% HBSS. סנן את ההשעיה התא דרך רשת ניילון. </li></ol> מכתים 5. עם נוגדנים ניאון ומיון תא הערה: כל הנוגדנים טיטרציה בעבר להשיג הגדרה אופטימלית של האוכלוסיות (titratיון יכול להשתנות עם אצווה הנוגדן). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה thymocytes (E13 או E18) במשך 15-30 דקות ב 4 ° C עם של קוקטייל של נוגדני biotinylated להכתים תאים חיוביים שושלת 100 μl (אנטי-CD19, אנטי-Gr1, אנטי-Ter119, אנטי-NK1.1 , CD11c אנטי, אנטי-CD3, אנטי CD4, CD8 אנטי, אנטי CD25). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את העודף של נוגדני ספין למטה הצינורות עם FCS 4 מיליליטר HBSS + 1% ב 280 XG במשך 7 דקות, לחסל את supernatant והגלול בFCS + 1% הטריים HBSS מתלים-מחדש. חזור על צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאי שכותרתו ביוטין E18 עם microbeads streptavidin במהלך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולשטוף את התאים פעמיים בFCS 1% HBSS. להשעות מחדש את התאים 2 מיליליטר HBSS + 1% FCS. רוב thymocytes E13 הוא שושלת שלילית ולכן לא צריך העשרת MACS לפני מיון תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התאים בעמודה LS, על פי הוראות היצרן. כאשר כל ההשעיה התא נכנסה לטור להוסיף FCS + 1% 2 מיליליטר HBSS. להתאושש4 מיליליטר של הטור לזרום דרך צנטריפוגות התאים ל7 דקות ב 280 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש להשעות את גלולה של שני E18 המדולדל או thymocytes E13 כולל בμl 50 של תערובת נוגדני TSP (אנטי-CD117 APC, אנטי-CD135 PE, אנטי-CD127 PECy7, אנטי CD24 FITC, אנטי CD44 APCCy7 ואוקיינוס ​​השקט הכחול streptavidin ) ו דגירה של 20 דקות ב 4 ° C בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם 4 מיליליטר HBSS + 1 FCS% ומחדש להשעות את התאים 1 מיליליטר HBSS FCS 1% + עם יודיד propidium. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין לין TSPs - CD127 הנמוך CD44 + CD117 + CD24 + CD135 + תאים בFACS (עם 4 לייזרים) על 1.5 מיליליטר צינורות המכילים 200 μl FCS + 20% בינוניים מלא. השער ראשון התאים בהתאם לגודלם והגרעיניות בFSC וערוצי SSC. לחסל את התאים מתים (צביעה עם יודיד propidium), שער החוצה כפילויות ולהבקיע את הקרינה בקשקשי מעריכי. ניתן להשיג בסביבות 100 או 600 TSPs מE13 אחד או אחת התימוס E18, respectivאיליי. </li></ol> 6. הרתי אונות עם אבות ההתיישבות של E14: טכניקת גלילת תליה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקרין (30 אפורים = 30 Gy) אונות הרתי E14 מעוברי CD45.2, 3 שעות לפני התרבות. הערה: אונות הרתי E14 או E15 שימשו בהצלחה כנמען של אבות תא T. שימוש באונות הרתי נמען של תוצאות ימי הריון מאוחר יותר בנימק מוקדם בשל הגודל גדול יותר של האיבר תוך אונות הרתי בימי הריון מוקדם יותר לפתח גרועה, ככל הנראה בשל פיתוח שלם של תאי האפיתל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מסודרים TSPs מחדש להשעות את התאים במדיום התרבות (בינוני מלא OPTI-ממ עם FCS 10%, פניצילין (50 יחידות / מיליליטר), סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) ו2β-mercaptoethanol (50 מיקרומטר)) באופן ש-35 μl מכיל 500 TSP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ירידת 35 μl של השעיה תא כל גם אחרים של צלחת גם Terasaki 60. הערה: 35 טיפות μl יכולות לאחות אם הם ממוקמים בבארות רציפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח אונה אחת מוקרנת על פני השטח של כל טיפה. סגור את צלחת Terasaki ולהפוך את הצלחת הפוכה לתת התאים להגיע לקוטב הפסגה של הירידה על ידי כוח הכבידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכה בעדינות בצד העליון של הצלחת ההפוכה כדי לאלץ את האונות להחליק לקצה הקודקוד של הירידה. דגירה את צלחת Terasaki ההפוכה בחממה humidified במשך 48 שעות על 37 מעלות צלזיוס + 5% CO 2. לאחר ההתיישבות, או תרבות thymi E14 ב -7 FTOC, או שתל תחת הקפסולה הכליות של עכבר בוגר נמען 8. </li></ol> 7. עוברי הרתי איברים תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 3 מיליליטר של מדיום שלם בצלחת פטרי 35 מ&quot;מ. מניחים מסנן קרום isopore צף על המדיום. מניחים את האונות מחדש על הקצה של הקרום עם מלקחיים (לא יותר מ -8 אונות על קרום אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחות פטרי המכילות את האונות הרתי בתוך צלחת פטרי 90 מ&quot;מ, יחד עם מנה 35 מ&quot;מ, ללא כיסוי, המכיל 2 מיליליטר של water, כדי להבטיח לחות אופטימלית. דגירה 12 ימים ב 37 ° C + 5% CO 2. </li></ol> 8. שתלי תחת הקפסולה הכליות בתנאים סטריליים הערה: parenchyma הכליות מוקף רקמת חיבור יוצרת כמוסה. האזור תת-קופסית הוא עשיר במיוחד בדם וכלי הלימפה ובכך לספק סביבה מתאימה לפיתוח שתלים (למשל אונות הרתי, איי לבלב או לבבות שזה עתה נולד). שתלי נעשים בדרך כלל על הכליה השמאלית משום שהוא נגיש יותר מהכליה הימנית. CD3 - / - עכברי זכרים שמשו כמקבלים וכך למנוע שתל לעומת תגובת מארח בשל אנטיגנים histocompatibility קטין הצמודים לכרומוזום Y, כי קביעת מין לפני E15 היא לא לעשות בקלות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את המכשירים וללבוש כפפות סטריליות לאורך הניתוח. להרדים את העכבר על ידי הזרקה תוך הצפק של פתרון של קטמין 10 מ&quot;ג / מיליליטר + 1 מ&quot;ג Xylazine /מיליליטר מדולל PBS: (50 עד 100 μl לכל 10 גרם משקל גוף), תוך שימוש במזרק 1 מיליליטר. ודא הרדמה על ידי בדיקת חוסר רפלקסים interdigital. מניחים ירידה של ג&#39;ל הידרו-Optimune על כל עין כדי למנוע יובש במהלך הרדמה. הערה: הפתרון צריך להיות מוכן מראש, חימם בטמפרטורת חדר לפני ההזרקה. ההרדמה נמשכת לפחות 20 דקות. התואר של הרדמה צריך להיות מבוקר לאורך כל הניתוח. ההרדמה יכולה להיות ממושכת על ידי הזרקה תוך הצפק של מחצית מנה בכל 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר בצד הימני שלה, תחת זרימת lamina מכסה המנוע אופקי. לעקר את שדה הניתוח עם 70% אתנול ו -10% פתרון dermic יודיד. עם חלק מלקחיים שיער העכבר לאורך אורך 2 סנטימטר מעל המשותף של הרגל האחורית. לגלח את אזור הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם אזמל, להפוך סנטימטר אורך חתך 1.5, הרקמה עורית הראשונה, ולאחר מכן עם מספריים לחתוך את רקמת השריר. החל לחץ קל לשני הצדדים של החתך, שיאלץ את הכליות מתוך חלל הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מלוח עם כותנה-ניצן לשמור הכליות לחות. אם יש לך קשיים בחשיפת האיבר, להשתמש במלקחיים שטוחים לשלוף את רקמת adipocyte מסביב שלכליות מחוברת. לשמור על הכליות מתוך חלל retroperitoneal ידי ניצן כותנה ממוקם מתחת לאיבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם שני מלקחיים עדינים, לעשות חור 2-3 מ&quot;מ בכמוסה (להימנע מלגעת parenchyma כדי למנוע דימום). במהלך ההליך הכירורגי כל לשמור על הקפסולה הכליות החשופה הטבולה ברציפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס בזהירות את האונות תחת הקפסולה הכליות, על ידי שמירה על הקיר של הקפסולה נפתחה והחלק את השתל מתחת לכמוסה לכיוון קוטב הקצה. הנח עד 6 אונות לכליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את הכליות בחלל רטרו הצפק. לתפור את aponeuroses השריר, אז עור עם קשרים מנתח בודדים. להרטיב את הפצע עם 10% פתרון povidone יודיד. מניחים את העכבר על הרשות הפלסטינית מחוממתד ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סקר העכבר המושתל עד להחלמה מלאה מן ההרדמה על ידי שליטה על תנועות לב, נשימה וזיף, צבעי רירית עד להחלמה מוחלטת נתפסה על ידי עצמי כלולה תנועות. הערה: אנו ממליצים הזרקה של פתרון כאבים שרירים פנים (Buprenorphin, 0.1 מ&quot;ג / קילוגרם) רק לאחר הניתוח ולאחר ניתוח 2 ימים כדי למנוע כאב שלאחר הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את החיה פעלה בבידוד עד התאושש לחלוטין. בדוק בכל יום אחר התפרים של הפצע כדי לוודא ולמנוע זיהום. מעולם לא נצפה זיהום פצע הבא בהליך זה. הערה: ניתוח שבועי של תאי דם היקפיים מCD3 - / - עכברים מורכבים מאפשרים לנו לזהות את הרתי אוכלוסיות נובעות מקור משני אבות E13 או E18 באמצעות סמן CD45 allotypic ושושלת תא T נוגדנים ספציפיים (איור 3). </li></ol> 9. ניתוח של צאצאי TSP על ידי cytometry הזרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; להקניט FTOCs בנפרד כדי להשיג השעיות תא בודדות (ראה סעיף פרוטוקול 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעיות תא כתם מאונות בודדות עם תערובת נוגדנים המכילה נוגדני הכרת CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4 APCCy7, CD8 APC, CD3 פסיפיק בלו, Vγ5 FITC, Vδ1 PE והדגירה כאמור בסעיף 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות מחדש את התאים בHBSS יודיד FCS + 1% + propidium ולנתח בcytometer זרימה (ראה תוצאות באיור 2). </li></ol>

<ol><li>Rodewald, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymus organogenesis.</a> Annu Rev Immunol. 26, 355-388 (2008).</li>
<li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Journey+through+the+thymus%3A+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).</li>
<li>Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-positive+epithelium+and+mesenchyme+cells+are+both+required+for+T-cell+development+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus.</a> Nature. 362, 70-73 (1993).</li>
<li>Douagi, I., Andre, I., Ferraz, J. C., Cumano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+T+cell+precursor+activity+in+the+murine+fetal+thymus%3A+evidence+for+an+input+of+T+cell+precursors+between+days+12+and+14+of+gestation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of T cell precursor activity in the murine fetal thymus: evidence for an input of T cell precursors between days 12 and 14 of gestation.</a> Eur J Immunol. 30, 2201-2210 (2000).</li>
<li>Calderon, L., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic%2C+context-dependent%2C+and+hierarchical+functions+of+epithelial+components+in+thymic+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Synergistic, context-dependent, and hierarchical functions of epithelial components in thymic microenvironments.</a> Cell. 149, 159-172 (2012).</li>
<li>Adolfsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Flt3%2B+lympho-myeloid+stem+cells+lacking+erythro-megakaryocytic+potential+a+revised+road+map+for+adult+blood+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of Flt3+ lympho-myeloid stem cells lacking erythro-megakaryocytic potential a revised road map for adult blood lineage commitment.</a> Cell. 121, 295-306 (2005).</li>
<li>Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clonogenic+common+lymphoid+progenitors+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow.</a> Cell. 91, 661-672 (1997).</li>
<li>Bhandoola, A., von Boehmer, H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commitment+and+developmental+potential+of+extrathymic+and+intrathymic+T+cell+precursors%3A+plenty+to+choose+from%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from.</a> Immunity. 26, 678-689 (2007).</li>
<li>Ramond, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+waves+of+distinct+hematopoietic+progenitor+cells+colonize+the+fetal+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Two waves of distinct hematopoietic progenitor cells colonize the fetal thymus.</a> Nat Immunol. 15, 27-35 (2014).</li>
<li>Allison, J. P., Havran, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunobiology+of+T+cells+with+invariant+gamma+delta+antigen+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunobiology of T cells with invariant gamma delta antigen receptors.</a> Annu Rev Immunol. 9, 679-705 (1991).</li>
<li>Anderson, G., Jenkinson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+thymus+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fetal thymus organ culture.</a> CSH Protoc. , (2007).</li>
<li>Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T+cell+development+from+hematopoietic+progenitor+cells+by+delta-like-1+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro.</a> Immunity. 17, 749-756 (2002).</li>
<li>Barbee, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skint-1+is+a+highly+specific%2C+unique+selecting+component+for+epidermal+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Skint-1 is a highly specific, unique selecting component for epidermal T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 3330-3335 (2011).</li>
<li>Douagi, I., Colucci, F., Di Santo, J. P., Cumano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+earliest+prethymic+bipotent+T%2FNK+progenitor+in+murine+fetal+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of the earliest prethymic bipotent T/NK progenitor in murine fetal liver.</a> Blood. 99, 463-471 (2002).</li>
<li>Malissen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+T+cell+development+in+mice+with+a+targeted+mutation+of+the+CD3-epsilon+gene%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Altered T cell development in mice with a targeted mutation of the CD3-epsilon gene.</a> EMBO J. 14, 4641-4653 (1995).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

שני מבחני עיקריים ניתן להשתמש כדי לנתח התמיינות תאי T vivo לשעבר. דיווח לאחרונה היא התרבות המשותפת של אבות hematopoietic עם תאי סטרומה בע&quot;מ, OP9, המבטא את ligands של Noth1, דלתא כמו 1 או 4 12. Assay 2-D זה קל לביצוע, יעיל ורגיש מאוד, המאפשר ניתוח ב רמת התא הבודד. עם זאת, זה לא תומך בפיתוח תאי T מעבר לשלב של DP ולא הדור של γδ DETC 13, שניהם דורשים אינטראקציות ישירות עם אפיתל הרתי. <p class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl...

לימפוציטים מסוג T, הנושא את αβ או γδ קולט תא T (TCR), להבדיל באיבר מיוחד, התימוס. התימוס מפותח מאורגן בשני אזורים נפרדים: הקליפה, שבו אבות הרתי לפתח ובי thymocytes שפרודוקטיבית לסדר מחדש את β TCR וגני שרשרת α הם הצילו ממוות מתוכנת (תהליך המכונה סלקציה חיובית); והלשד, שבו נבחר thymocytes עם תגובתיות חזקה מדי לligands העצמי נמחקים (סלקציה שלילית) 1,2. התימוס מקור שכבת endodermal של כיס בלוע השלישי שהוא מוקף מאוחר יותר על ידי תאי mesenchymal 3. הוא יישב על ידי אבות hematopoietic מתחילים ביום עוברי E12 ו, לאחר מכן, גיוס רציף נדרש לפיתוח תא T הרגיל 4. עולים הרתי להתפתח דרך שלבי התפתחות רצופים, בניצוחו של תכנית בחוזקה מוסדרת, יזם ומאיntained על ידי ההפעלה של מסלול האיתות של Notch על thymocytes על אינטראקציה עם ליגנד, דלתא כמו 4, הביע בתאי אפיתל הרתי (Tecs) 5. פיתוח Thymocyte מתחיל בCD4 שנקרא - CD8 - שלילי כפול שלבים (DN). thymocytes DN ניתן מחולק חלוקה נוסף על פי הביטוי של CD25 וCD44 לDN1 (CD25 - CD44 +), DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) וDN4 (CD25 - CD44 -). CD24 (HSA) וCD117 (c-kit) subdivides נוסף תא DN1 ל -5 תת בי DN1a וב מתאים לאבות המוקדמים הרתי (ETP). Thymocytes לסדר מחדש את רשתות δ, β α וTCR בשלב DN ולעבור בחירה מראש TCR (שלבי DN3-DN4). הם עוד מעבר לCD4 + CD8 + התא החיובי כפול (DP) שבו שרשרת α TCR מארגנת מחדש לפני Sele גודל חיובי והשליליסיפורת. בשלב זה רוב thymocytes בוטלו ורק אחוז קטן (3-5%) להגיע + CD4 או CD8 + T תא בוגר תא. מסלול בידול הלימפה מתקדם בשלבים של HSCs שיוצרים אבות multipotent (MPP) ואבות-דרוך הלימפה multipotent (LMPP) שאיבדו כדורית אדומה וmegakaryocyte פוטנציאל 6. LMPP מוגדר phenotypically בהעדר סמנים של תאי דם מובחנים (שושלת שלילית, לין -), הביטוי של c-kit (CD117), SCA-1 וFLT3 / Flk2 (CD135) והעדר הרמות לזיהוי של אינטרלוקין ( IL) -7 קולט α שרשרת (IL-7rα או CD127). LMPPs נוסף להבדיל לאבות משותפים הלימפה (CLP) 7 כי על ידי השלב שאיבדו את היכולת לייצר תאי מיאלואידית. CLP לשמור הלימפוציטים (B ותאי T), תא NK, DC ותא הלימפה המולדת פוטנציאלי (ILC), ושונה מLMPP על ידי הביטוי של CD127 והעדר הרמות גבוהות של SCA-1. למרות שהטבע של אבות הרתי יישוב (TSP) כבר התווכח 8 בהרחבה, זה הפך לאחרונה ברור ששינוי TSP פנוטיפ, פוטנציאל התמיינות ותפקוד, בכל פיתוח 9. ביצענו במבחנה ובמבחני vivo לאפיין את כפית, מבודדת על ידי תא FACS מיון משני E13 (הגל הראשון) או E18 (גל שני). תרבויות עוברית הרתי איבר (FTOC) עם אונות הרתי מוקרנת יישבו על ידי מספר שווה של אבות E13 וE18, הנושאים סמני allotypic שונים, אפשרו הבא צאצאיהם בסביבת התפתחותית דומה וגילו מאפיינים פנימיים תא, שונים בין שני הסוגים של אבות. אונות הרתי יישבו גם על ידי E13 או E18 TSP אפשרו פיתוח ללא בחירה בשל תחרות בין שני האבות. השתלת vivo של האונות הרתי מתנחלות, הראתה עוד, כי גם לאיש לו צאצאים בוגרים של E13 וE18 TSP מאפיינים ביולוגיים שונים בגוף חי. TSPs מהגל הראשון במהירות לייצר תאי T אבל להצמיח מספרים נמוכים של αβ וγδ תאי T. בקרב האחרון זיהינו תאים דנדריטים Vγ5Vδ1 אפיתל T (DETC), שיש לי TCR משתנה, להגר לעור שבו הם מפעילים פונקציה בריפוי פצעים ומיוצרים רק במהלך התפתחות עוברית 10. לעומת זאת, כפית מהגל השני תיקח זמן רב יותר כדי ליצור מספרים גבוהים של תאי TCR + T ולא מצליחה ליצור DETC.

<table><tbody><tr><td>90 x 15 מ"מ ו- 35 x 15 מ"מ תרבית רקמות פלסטיק צלחות פטרי.</td><td>TPP</td><td>T93100/T9340</td><td>דגימה</td></tr><tr><td>26 גרם ו-frac38; " מזרקים בגודל 0.45 x 10 מ"מ עם מחטים</td><td>BD Plastipak</td><td>300015</td><td>מתלה תאים</td></tr><tr><td>בד הברגה רשת ניילון מעוקר 50/50 מ"מ חתיכות.</td><td>SEFAR NITEX</td><td>03-100/32</td><td>סינון תאים</td></tr><tr><td>אתנול 70%.</td><td>VWR</td><td>83801.36</td><td>פעולות סטריליות</td></tr><tr><td>יודיד פובידון 10% (בטאדין)</td><td>MEDA Pharma</td><td>314997.8</td><td>פעולות סטריליות</td></tr><tr><td>קטמין 100 מ"ג/מ"ל (תמיסת מלאי)</td> <td>MERIAL</td><td></td><td>Anesthesic</td></tr><tr><td>קסילזין 100 מ"ג/מ"ל ב-PBS (תמיסת מלאי)</td><td>Sigma</td><td>X1251-1G</td><td>חומר הרדמה והרפיית שרירים</td></tr><tr><td>בופרנורפין 0.3 מ"ג/מ"ל תמיסת מלאי</td><td>AXIENCE</td><td></td><td>משכך כאבים מורפיני</td></tr><tr><td>ג'ל אופטלמוסי (0.2% ציקלוספורין)</td><td>Schering-Plough Animal Health</td><td></td><td>הגנת העיניים</td></tr><tr><td>DPBS (+ CaCl2, MgCl2)</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>14040-174</td><td>לבידוד עוברים</td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת HBSS Hanks' (+ CaCl2, MgCl2)</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>24020-091</td><td>לשטיפת הדם ו לנתח את העוברים</td></tr><tr><td>OPTI-MEM I GlutaMAX I</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>51985-026</td><td>מדיום לתרבויות</td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי</td><td>EUROBIO</td><td>CVFSVF00-0U</td><td>תוסף לתרביות</td></tr><tr><td>פניצילין וסטרפטומיצין</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>15640-055</td><td>אנטיביוטיקה לתרביות</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>תוסף 31350010</td><td>לתרביות</td></tr><tr><td>LEICA MZ6 דיסקציה מיקרוסקופ</td><td>LEICA</td><td>MZ6 10445111</td><td>Occular W-Pl10x/23</td></tr><tr><td>מקור מנורה קרה</td><td>SCHOTT VWR</td><td>KL1500 קומפקטי</td><td>שני סיבי צוואר אווז מותאמים</td></tr><tr><td>סיליקון אלסטומר</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>SYLG184</td><td>כרית חיתוך</td></tr><tr><td>כף, עגול ומחורר</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>10370-18</td><td>כלי חיתוך</td></tr><tr><td>בסדר מספריים קשתית</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>14090-09</td><td>כלי חיתוך</td></tr><tr><td>Vannas מספריים קפיציים</td> כלי <td>מדע עדינים</td><td>15018-10</td><td>כלי חיתוך</td></tr><tr><td>מלקחיים: Dumont #5/45 Inox 11 ס"מ</td><td>FST</td><td>11253-25</td><td>כלי חיתוך</td></tr><tr><td>2 זוגות מלקחיים עדינים של שענים ישרים Dumont #5 11 ס"מ קצות עדינים.</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>11295-20</td><td>כלי חיתוך</td></tr><tr><td>חוט פולימיד עם מחט 6-0 C-3 3/8c</td><td>ETHICON</td><td>F2403</td><td>לתפרים</td></tr><tr><td>מחזיק מחט</td><td>MORIA/F.S.T.</td><td>12060-02</td><td>לתפרים</td></tr><tr><td>כרית חימום</td><td>VWR</td><td>100229-100</td><td>לשמירה על טמפרטורת העכבר במהלך הרדמה</td></tr><tr><td>ממברנה איזופור RTTPO2500</td><td>DUTSCHER</td><td>44210</td><td>עבור FTOC</td></tr><tr><td>Terasaki 60 צלחות בארות</td><td>FISHER</td><td>1x270 10318801</td><td>לתליית טכניקת טיפה</td></tr><tr><td>ספוגיות גזה סטריליות 7.5 x 7.5 ס"מ</td><td>Hydrex</td><td>11522</td><td>למריחת תמיסת חיטוי</td></tr><tr><td>נוגדנים פלואורסצנטיים או ביוטין</td><td>BD Biosciences, Biolegend או e-Biocsiences&nbsp;</td><td>מספר שיבוט ראה טבלה למטה</td><td>תאי צביעה</td></tr><tr><td>עמודות MACS / מיקרו-חרוזי סטרפטווידין</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401/130-048-101</td><td>עכברי דלדול תאים</td></tr><tr><td></td><td>מעבדות צ'ארלס ריברס (CD45.1) ומעבדות Janvier&nbsp; (CD45.2)</td><td>C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2</td><td>מקור תאים ואונות תימוס</td></tr><tr><td>עכברים</td><td>CDTA Orl&eacute; ans, צרפת</td><td>CD 3 epsilon Ko CD45.2</td><td>ניסוי השתלה</td></tr></tbody></table>

אפיון של הרתי יישוב אבות בעובר העכבר באמצעות<em&gt; in vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחני

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

אפיון אבות הרתי יישוב חשוב להבין השלבים טרום-הרתי של פיתוח תאי T, חיוני לתכנן אסטרטגיות להחלפת תאי T בחולי lymphopenic. למדנו הרתי יישוב אבות מיום עכברי עוברי 13 ו -18 thymi ידי שני משלימים במבחנה ובטכניקות vivo, שני מבוססים על השיטה &quot;טיפה תלויה&quot;. שיטה זו אפשרה התיישבות אונות הרתי עובריות מוקרנת עם E13 ו / או E18 אבות הרתי המאופיין בסמני CD45 allotypic וכך הבאים צאצאיהם. התיישבות עם אוכלוסיות מעורבות מאפשרת ניתוח הבדלים אוטונומיים תא בנכסים ביולוגיים של האבות בעוד התישבות גם עם אוכלוסייה מסירה לחצים סלקטיביים תחרותיים אפשריים. יכולות גם להיות מורכבים אונות הרתי יישבו בעכברי immunodeficient זכר נמען מאפשרים הניתוח של צאצאי תא T הבוגרים in vivo, כגון דינמיקת אוכלוסייה של tהוא היקפי מערכת וקולוניזציה של רקמות ואיברים שונים חיסוניות. תרבויות איבר הרתי עוברית גילו כי אבות E13 התפתחו במהירות לכל בוגרים CD3 + תאים והולידו את קבוצת המשנה של תאי T γδ הקנונים, המכונה תאי T אפיתל הדנדריטים. לשם השוואה, יש לי אבות E18 בידול מושהה ולא הצליחו לייצר תאי T אפיתל הדנדריטים. הניטור של דם ההיקפי של CD3-מורכבים התימוס - / - עכברים הראה עוד, כי אבות הרתי E18 יישוב ליצור, עם זמן, מספר גדול יותר של תאים הבוגרים T מאשר עמיתיהם E13, תכונה שלא ניתן הייתה להערכה בהרתי העוברי לטווח הקצר תרבויות איברים.

כדי לבחור שיטה לרוקן אונות הרתי של thymocytes אנדוגני המאפשר הפיתוח הטוב ביותר של אבות התיישבות, השווינו את הרמות של הכינון מחדש של תאי T באונות הרתי יישבו לאחר הקרנה או deoxy-guanosine 5 ימים טיפול (ד-גואה). התוצאות מראות כי בעוד שאין הבדל ביום 9 של תרבות, אונות מוקרנים הכילו יותר תאי T מאלה שטופלו בד-גואה, ביום 12. לפיכך, קרינה היא יותר מתאימה מאשר טיפול ד-גואה להשיג פיתוח תא T אחרי קולוניזציה הרתי (איור 1). כדי לחקור את הפוטנציאל ההתפתחותי של E13 וE18 TSP, אנחנ...

מאמר זה מתאר מתודולוגיה in vivo ו-in vitro לאפיון אבות התיישבות תימית על ידי ניתוח הקינטיקה של הדור, הפנוטיפ והמספרים של צאצאי תאי ה-T שלהם.

אפיון של הרתי יישוב אבות בעובר העכבר באמצעות<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחני

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לנתח את קינטיקת הפנוטיפ של היווצרות ומספר תאי ה-T המופקים על ידי פרוגניטורים שהתיישבו בתימוס ביום העוברי E 13 או E 18. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד האונות של התימוס מעוברי עכבר בימים E 13, E 14 ו-E 18. בשלב השני, מקרינים את אונות התימוס מיום E 14 ולאחר מכן מזריעים אותן עם תאי E 13 או E 18 שעברו מיון באמצעות זרימה (flow sorted) למשך 48 שעות בשיטת טיפה תלויה (hanging drop).בשלב הסופי, האונות המיושבות מושתלות תחת קפסולת הכליה של עכברים בוגרים מסוג CD three knockout. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בציטומטריה של זרימה כדי להעריך את נוכחותם של צאצאי תאי הפרוגניטור של התיישבות התימוס משלבים E 13 ו-E 18 בדם של בעלי החיים הכימריים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תרבית T cells in vitro על תאי ine so, הוא שטכניקה זו משלבת שיטות המאפשרות הבשלה מלאה של T-cell מפרוגניטורים מוגדרים במערך תלת-ממדי עם השתלה של תרביות איברי תימוס בעכברי רקפיה שלמים, מה שמאפשר להעריך את הדיפרנציאציה והתפקוד של פרוגניטורי התימוס וצאצאיהם.כמהנדסת מחקר עם מומחיות בניתוחים במכרסמים, אדגים את הפרוצדורה. יומיים לפני ניסוי ההשתלה, בתוך מapay flow hood, נחטא את בטנה של נקבת עכבר הרַיה עם 70% ethanol ונבצע חיתוך אורכי בעור בקו האמצע, נרחיק את העור כדי לפתוח את החתך ולאחר מכן נשתמש בפינצטה ובמספריים כדי לפתוח את הפריטונאום מבלי לגעת במערכת העיכול. לאחר מכן, נוציא את הרחם הדו-קרני ונשתמש במספריים כדי להפרידו מהנרתיק. לאחר מכן נניח את הרחם בצלחת פטרי של 90 על 15 מילימטר המכילה 40 עד 50 מיליליטר של DPBS ונבצע חיתוך רוחבי בין הדצידואה של כל עובר.השתמשו במספריים בעלי קצה דק ובפינצטה עדינה כדי להסיר את קרום השריר של הרחם, תוך גזירה בין השליה לשקיק החלמון כדי להוציא כל עובר. לאחר מכן, הסירו את השקיק העמוני תוך שמירה על העוברים, והעבירו את העוברים לכלי פטרי חד המכיל HBSS בתוספת 1% FCS. כדי לבודד את התימוס, הניחו את העוברים אחד אחד במצב שכיבה (supine) תחת זכוכית מגדלת בינוקולרית.לאחר מכן, הכניסו פינצטה לאורכה לאורך סחוס העצם הסטרנום, וצבטו ופתחו את כלוב בית החזה באמצעות פינצטה קמורה. הזיזו את דופן בית החזה הצידה כדי לדגום את האונות של התימוס בכל צד של הקנה. לאחר מכן, צבטו מתחת לתימוס עם פינצטה עדינה כדי להוציא בזהירות כל אונה ולהניח אותן בצלחת פטרי המכילה 1 mL של HBSS בתוספת 1% FCS.בשלב הבא, השתמשו בשתי פינצטות עדינות כדי להסיר את רקמת החיבור שמסביב מבלי לפגוע באונות. לאחר מכן, שטפו את האונות בשלושה מיליליטר של HBSS בתוספת 1%FCS כדי להסיר את תאי הדם האדומים לצורך תחילת תרבית של איבר תימוס עוברי. אונות תימוס של E 14 בודדו מעוברים מסוג CD 45.2 כפי שהודגם כעת.השאירו את האונות למנוחה למשך כשלוש שעות. לאחר מכן, סובבו במערכת צנטריפוגה פרוגניטורים של תימוס שמופרים טריים משלב E 13 או E 18. השעיקו את המשקע במצע תרבית לריכוז סופי של 500 תאים ל-35 µL של מצע.לאחר מכן, הניחו טיפה של 35 µL של סספנסיות תאים בכל באר שנייה בתוך פלטת terasaki בעלת 60 בארות, והניחו אונה אחת שהוקרנה על פני השטח של כל טיפה. סגרו את הפלטה והפכו אותה כדי לאפשר לתאים להגיע לקוטב האפיקלי של הטיפה באמצעות כוח הכבידה, והקישו בעדינות על הצד העליון של הפלטה ההפוכה כדי לדחוף את האונות להחליק אל הקצה האפיקלי של הטיפה. לאחר מכן, דגרו את הפלטה ההפוכה באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide למשך 48 שעות.לאחר שהאונויות של הבלוטה התימיאית קולונסו, ודאו את רמת ההרדמה של החיה המקבלת על ידי בדיקת היעדר תגובה רפלקסיבית. לאחר מכן, מרחו טיפה של פומדת עיניים בכל עין והניחו את העכבר על צדו הימני תחת מ𒋻 זרימה למינרית. לאחר מכן, גלחו את אזור הניתוח מעל למפרק הרגל האחורית.לאחר מכן, חבשו זוג כפפות סטריליות והסדירו את שטח הניתוח באמצעות 70% ethanol ותמיסת 10% IOD DY DER. השתמשו בסקאלפל כדי לבצע חתך של 1.5 סנטימטר דרך רקמת העור, ולאחריו חתך דרך רקמת השריר. כעת הפעילו לחץ קל משני צידי החתך כדי לדחוף את הכליה מחוץ לחלל הבטן, ושמרו על לחות הכליה באמצעות תמיסת saline.החזיקו את הכליה בעזרת מקלוני צמר之外 של חלל הרטרו-פריטונאום (retroperitoneal cavity), והשתמשו בשתי פינצטות עדינות כדי ליצור חור של שני עד שלושה מילימטרים בקפסולה. לאחר מכן, תוך כדי החזקת דופן הקפסולה פתוחה, החליקו בזהירות עד שישה שתלים של לובי תימה (thymic lobe) לכיוון קוטב הכליה והחזירו את הכליה לחלל הרטרו-פריטונאום. תפרו את השריר בתפר רציף, ולאחר מכן תפרו את העור באמצעות קשרי כירורג בודדים.לאחר מכן, הרטב את הפצע בתמיסת פובידון-יודיד 10%, והנח את העכבר על פלטת חימום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, תוך ניטור בעל החיים והפצע הניתוחי עד להחלמה מלאה של שניהם, כדי לקבוע את השיטה הטובה ביותר לדילול תימocytes אנדוגניים לצורך פיתוח של פרוגניטורים מתנחלים. בניסוי זה, הושוו רמות השחזור של תאי T באונה תימית שהתנחלו בה לאחר הקרנה או טיפול של חמישה ימים ב-deoxy guine. בעוד שלא נצפתה הבדל במספר הלימפוציטים המתנחלים ביום התשיעי של התרבית, האונות המוקרנות הכילו יותר תאי T מאשר אלו שטופלו ב-deoxy guine ביום 12, מה שהופך את ההקרנה לטיפול המועדף להשראת התפתחות תאי T לאחר התנחלות תימית. כדי לבחון כאן את הפוטנציאל ההתפתחותי של פרוגניטורים מתנחלים בתימהס ב-E 13 ו-E 18, אונות תימיות מוקרנות ב-E 14 הושגחו עם מספר שווה של שני סוגי הפרוגניטורים; כפי שנצפה, הפרוגניטורים המתנחלים בתימהס ב-E 13 הולידו פחות תימocytes ותאי T כפולי-חיוביים מאשר הפרוגניטורים המתנחלים בתימהס ב-E 18.עם זאת, שכיחות התאים הבשלים החיוביים ל-CD3 עלתה, והפקת תאי T אפיתליים דנדריטיים זיהתה רק בצאצאים של תאי פרוגניטורים של התיישבות תימוסית מהשלב E13. כדי לנתח את הפוטנציאל in vivo של תאי פרוגניטורים של התיישבות תימוסית מהשלבים E13 ו-E18, אונונות תימוס שיושבו עם כל סוג של פרוגניטורים הושתלו תחת קפסולת הכליה של מקבלים עם CD3 knockout. כפי שהודגם זה עתה, וכפי שניתן היה לצפות, תאי הפרוגניטורים של התיישבות תימוסית מהשלב E13 הולידו תאי T במהירות רבה יותר מאשר הפרוגניטורים מהשלב E18, אם כי מספר תאי ה-T במחזור הדם היה נמוך משמעותית באופן כללי בבעלי החיים שיושבו על ידי פרוגניטורים של התיישבות תימוסית מהשלב E13. לאחר פיתחו, סלל פיתוח זה את הדרך עבור חוקרים בתחום האימונולוגיה ההתפתחותית לחקור את התכונות של תתי-אוכלוסיות של תאי T, שחלקן הן ממקור עוברי מובהק במודל של יונקים.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה בידכם הבנה טובה של אופן המעקב אחר נתיבי הבידול והתפקוד של תאי פרוגניטורים שוקעים של Timex וצאצאיהם, הן בסביבה טבעית והן בתנאים תחרותיים.

characterization-thymic-settling-progenitors-mouse-embryo-using-vivo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנו מציגים צעד אחר צעד הוראות עבור הדור של מפלצות הילוד וכן לנתיחה והכנת התימוס עבור vivo לשעבר הדמיה על ידי מיקרוסקופית 2-פוטון.

בתחום ההדמיה באתרו של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

פיתחנו במעבדה רומן כלים ופרוטוקולים לרכישת הדמיה intravital של התימוס. הטכניקה שלנו אמור לעזור בזיהוי של "נישות" בתוך התימוס שבו התפתחות תא T מתרחשת.

הדמיה Intravital של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

סרטון זה מדגים פרוטוקול ליצירת תאי T פונקציונליים ספציפיים לאנטיגן מתאי T לא בוגרים שמקורם ב-iPSC באמצעות מערכת תרבית תימית תלת-ממדית. תרבית משותפת של תאי T לא בוגרים שמקורם ב-iPSC עם עכברים אנדוגניים מדולדלי לימפוציטים, אונות תימיות עובריות, הביאה להבשלה מוצלחת של תאי T ליצירת CD8αβ+ MHC class I+ iPSC שמקורם במהגרים תימיים (iTEs).

מערכת תרבות תימית תלת-ממדית ליצירת מהגרים תימיים שמקורם ב-iPSC

ניתן להתמיין בתאי גזע עובריים של עכבר לתאי T במבחנה באמצעות מערכת התרבות המשותפת OP9-DL1. הצלחה בהליך זה דורשת תשומת לב קפדנית לתחזוקת ריאגנט/תאים, ושלבים רגישים לטכניקה מרכזית. כאן אנו דנים בפרמטרים קריטיים אלה ומספקים פרוטוקול מפורט לעידוד אימוץ טכנולוגיה זו.

גזירה של תאי T במבחנה מתאי עכבר גזע העובריים

חקר תאי אפיתל תימיים מדולריים במבחנה לא הצליח ברובו, מכיוון שמערכות התרבית הדו-ממדיות הנוכחיות אינן מחקות את תרחיש in vivo. מערכת התרבית התלת-ממדית המתוארת כאן - מודל תרבית אורגנוטיפית של עור שונה - הוכיחה את עצמה כעדיפה בסיכום התפשטות mTEC, התמיינות ותחזוקה של ביטוי גנים מופקר.

דגם 3D Organotypic משותף תרבות תמיכה למניעת הפצת נשק מדולרי הרתי אפיתל תאים, התמיינות וביטוי גנים מופקר

פרוטוקול זה מציג שיטה לבצע מתחיל מתא בודד כמותי, בניתוח באתרו של ביטוי חלבון ללמוד מפרט השושלת בעוברים preimplantation העכבר. הנהלים הדרושים לאיסוף blastocysts, כל הר זיהוי immunofluorescent של חלבונים, הדמיה של דגימות על מיקרוסקופ confocal, ופילוח גרעיני וניתוח תמונה מתוארת.

ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים

בעוד מחלחלים מקרופאגים הם גויסו ללא הרף רקמות מבוגר מ מבשר במחזור, מקרופאגים תושב זרע הרקמה שלהם במהלך הפיתוח, שם הם מתוחזקים ללא קלט נוסף של אבות. אבות של מקרופאגים תושב זוהו לאחרונה. כאן, אנו מציגים שיטות למיפוי גורל גנטי של אבות מקרופאגים תושב.

זיהוי של אבות אריתרומיאלואידים צאצאיהם בעובר עכבר על ידי זרימת cytometry

בנייר זה, אנו מתארים פרוטוקול לאפיין תלויי-T ו- T-עצמאית אימונוגלובולינים (Ig) תגובות isotype בעכברים באמצעות אליסה. בשיטה זו נעשה שימוש לבד או בשילוב עם זרימה cytometry יאפשר לחוקרים לזהות הבדלים בתגובות isotype איג B תאית בעכברים בעקבות חיסון אנטיגן תלויי-T ו- T-עצמאית.

אפיון של אימונוגלובולינים התימוס תלוית ועצמאי התימוס תגובות Isotype בעכברים באמצעות אנזים-מקושרים Immunosorbent Assay

המטרה של הפרוטוקול היא להציג האורך intravital מעקב בזמן אמת אחר thymocytes על-ידי סריקת מיקרוסקופ ב שתלים הרתי בתא הקדמי של העין עכבר לייזר. את השקיפות של הקרנית, אמוניה השתל מאפשר הקלטה ברציפות קדמון תא גיוס ויציאה T-cell בוגרת.

בזמן אמת In Vivo המעקב של Thymocytes בתא הקדמי של העין על ידי סריקת מיקרוסקופ לייזר

מאמר זה מתאר את השיטה הרומן לייצר אנטיגן הגידול-ספציפי המושרה ביותר תאים גזע מהגרים הרתי (iTE) על ידי תלת מימדי (3D) מערכת התרבות הרתי. iTE הינם תת-קבוצה הומוגנית של תאי T הקשורים היטב לתאי T תמימים עם יכולת התפשטות, היווצרות הזיכרון ודיכוי הגידול.

תלת מימדי הרתי תרבות מערכת לייצר Murine המושרה תא גזע Pluripotent-הגידול הנגזר אנטיגן-מהגרים ספציפיים הרתי

מאמר זה מספק שיטה לבודד טהור עובריים רקמות מעוברים שליו ועוף שניתן לשלבם לטופס ex-vivo האיברים chimeric.

בידוד של רקמות עובריים ועל היווצרות האיברים Chimeric שליו-עוף לפי הדוגמה בלוטת התימוס

למדו אפיון של תאי אב טימיים בעוברי עכברים באמצעות שיטות in vivo ו-in vitro. השיטה משלבת בידוד אונות טימיות, קרינה ושתלים כדי לחקור התפתחות תאי T וקינטיקת ייצורם.

אפיון של הרתי יישוב אבות בעובר העכבר באמצעות

גלה סרטונים נוספים