אפיון של הרתי יישוב אבות בעובר העכבר באמצעות In vivo ו במבחנה מבחני

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח את הקינטיקה הפנוטיפית של הדור והמספרים של תאי T המיוצרים על ידי אבות התיישבות תימיים E 13 או E 18. זה מושג על ידי בידוד ראשון של אונות התימוס מעוברי עכברים E 13, E 14 ו-E 18. בשלב השני, אונות התימוס E 14 מוקרנות ולאחר מכן מתיישבות בתאי E 13 או E 18 ממויינים בזרימה למשך 48 שעות בטיפה תלויה.

בשלב האחרון, האונות המושבעות מושתלות מתחת לקפסולת הכליה של עכברי CD בוגרים עם שלושה עכברי נוק-אאוט. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בזרימה ציטומטרית כדי להעריך את נוכחותם של צאצאי האב התימי E 13 ו-E 18 בדם של בעלי החיים הכימריים. היתרון העיקרי של טכניקה זו של השיטות הקיימות שלנו, כמו תרבית תאי T במבחנה על תאי ine so, הוא שטכניקה זו משלבת את השיטות המאפשרות התבגרות מלאה של תאי T מאבות מוגדרים בבדיקה תלת מימדית עם השתלת תרביות איברים של איברים תימיים בעכברים נמענים שלמים, מה שמאפשר להעריך את ההתמיינות והתפקוד של אבות פרוסות התימוס והצאצאים.

כמהנדס מחקר עם מומחיות בניתוחי מכרסמים, אדגים את ההליך יומיים לפני ניסוי ההשתלה במכסה זרימה למינרית, מה הבטן של עכברה בהריון עם 70% אתנול ולעשות חתך אורכי בעור בקו האמצע, למשוך את העור כדי לפתוח את החתך ואז להשתמש במלקחיים ובמספריים כדי לפתוח את הצפק מבלי לגעת במערכת העיכול. לאחר מכן, משוך החוצה את הרחם הדו-צדדי והשתמש במספריים כדי להפריד אותו מהנרתיק. לאחר מכן מניחים את הרחם בצלחת פטרי בגודל 90 על 15 מילימטר המכילה 40 עד 50 מיליליטר DPBS וחותכים לרוחב בין הדצידואה של כל עובר.

השתמש בזוג מספריים עדינים ומלקחיים עדינים כדי להסיר את קרום השריר של הרחם החותך בין השליה לשק החלמון כדי להוציא כל עובר. לאחר מכן יש להסיר את מי השפיר השומרים על העוברים, ולהניח את העוברים בצלחת פטרי חדשה המכילה HBSS בתוספת 1% FCS. כדי לבודד את בלוטת התימוס, הנח את העוברים בזה אחר זה במצב שכיבה מתחת לעדשה מגדלת דו-עינית.

לאחר מכן הכנס מלקחיים אחד לאורך לאורך הסחוס של עצם החזה וצבט ופתח את רשת בית החזה באמצעות מלקחיים מעוקלים. משוך את דופן בית החזה הצידה כדי לדמיין את אונות התימוס בכל צד של קנה הנשימה. לאחר מכן צבטו מתחת לבלוקס בעזרת מלקחיים עדינים כדי להסיר בזהירות כל אונה ולהניח אותם בצלחת פטרי המכילה מיליליטר אחד של HBSS בתוספת 1% FCS.

לאחר מכן, השתמש בשני מלקחיים עדינים כדי להסיר את רקמת החיבור שמסביב מבלי לפגוע באונות. לאחר מכן שטפו את האונות בשלושה מיליליטר של HBSS בתוספת 1% FCS כדי לחסל את כדוריות הדם האדומות כדי להתחיל להקרין את תרבית איברי התימוס של העובר. E 14 אונות תימיות מבודדות מעוברי CD 45.2 כפי שהודגם זה עתה.

תנו לאונות לנוח כשלוש שעות. לאחר מכן סובב את אבות התיישבות התימיים E 13 או E 18 הממוינים טריים. השעו מחדש את הגלולה במדיום תרבית לריכוז סופי של 500 תאים לכל 35 מיקרוליטר מדיום.

לאחר מכן הניחו טיפה של 35 מיקרוליטר של תרחיף תאים בכל באר אחרת של צלחת טרסאקי של 60 בארות וצלחת אונה מוקרנת אחת על פני כל טיפה. סגור את הצלחת והפוך אותה כדי לאפשר לתאים להגיע לקוטב האפיקלי של הטיפה על ידי כוח הכבידה, תוך פגיעה בצד העליון של הצלחת ההפוכה בעדינות כדי לאלץ את האונות להחליק לקצה האפיקלי של הטיפה. לאחר מכן דגרו את הצלחת ההפוכה בחממה לחה למשך 48 שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

לאחר התיישבות האונות התימיות, ודא את רמת ההרדמה של החיה הנמענת על ידי היעדר תגובת רפלקס. לאחר מכן יש להניח טיפה של משחת עיניים על כל עין ולהניח את העכבר על צדו הימני מתחת למכסה זרימה למינרית. לאחר מכן גלח את אזור הניתוח ממש מעל מפרק הרגל האחורית.

לאחר מכן, עשו זוג כפפות סטריליות ועיקרו את השדה הניתוחי עם 70% אתנול ותמיסת 10% IOD DY DER. השתמש באזמל כדי לבצע חתך של 1.5 ס"מ דרך רקמת העור, ולאחר מכן חתך דרך רקמת השריר. כעת הפעל לחץ קל על שני צידי החתך כדי לאלץ את הכליה לצאת מחלל הבטן ולשמור על הכליה לחה בתמיסת מלח.

שמרו על הכליה עם צמר גפן מחוץ לחלל הרטרופריטונאלי, והשתמשו בשני מלקחיים עדינים כדי ליצור חור של שניים עד שלושה מילימטרים בקפסולה. לאחר מכן, החזק את דופן הקפסולה פתוחה, החלק בזהירות עד שישה שתלי אונה תימית מתחת לקצה מוט הכליה והנח את הכליה בחזרה בחלל הרטרופריטונאלי. לתפור את השריר נוירוזה ואחריה תפר עור עם קשרי מנתח בודדים.

לאחר מכן הרטיבו את הפצע בתמיסת פובידון של 10% יודיד, והניחו את העכבר על כרית חימום של 37 מעלות צלזיוס, תוך ניטור החיה והפצע הניתוחי עד ששניהם מתאוששים לחלוטין כדי לקבוע את השיטה הטובה ביותר לדלדול תימוציטים אנדוגניים להתפתחות אבות מתיישבים. בניסוי זה הושוו רמות הבנייה מחדש של תאי T באונה תימית מושבת לאחר קרינה או טיפול בדאוקסי גין בן חמישה ימים. בעוד שלא ניכר הבדל במספר הלימפוציטים המתיישבים ביום התשיעי של התרבית, האונות המוקרנות הכילו יותר תאי T מאלה שטופלו בדאוקסי גין ביום ה-12, מה שהופך את ההקרנה לטיפול המועדף להקלה על התפתחות תאי T לאחר קולוניזציה של בלוטת התימוס כדי לחקור את הפוטנציאל ההתפתחותי של אבות התיישבות תימית E 13 ו-E 18 כאן, אונות תימיות מוקרנות E 14 יושבו עם מספר שווה של שני סוגי האבות כפי שנצפה, אבות התייצבות E 13 הולידו פחות תימוציטים ותאי T חיוביים כפולים מאשר אבות התייצבות E 18.

עם זאת, התדירות של שלושה תאים חיוביים CD בוגרים הוגדלה וייצור תאי T אפיתל דנדריטיים זוהה רק בצאצאים של אבות התיישבות תימית E 13 כדי לנתח את פוטנציאל ה-in vivo של אבות התיישבות תימית E 13 ו-E 18 אונות תימיות שהתיישבו עם כל סוג של אבות הושתלו מתחת לקפסולת הכליה של מקבלי CD שלושה נוק-אאוט. כפי שהודגם כצפוי. אבות התיישבות התימוס E 13 הולידו תאי T מהר יותר מאשר אבות E 18, אם כי מספר תאי ה-T במחזור היה נמוך משמעותית בבעלי החיים המתיישבים E 13 באופן כללי לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האימונולוגיה ההתפתחותית לחקור את התכונות של תת-קבוצה של תאי T, חלקם ממקור עוברי קפדני במודל יונקים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לעקוב אחר המסלולים הדיפרנציאליים והתפקודיים של אבות התיישבות טימקס וצאצאיהם בסביבה טבעית אפילו, ובתנאים תחרותיים.