אפיון של הרתי יישוב אבות בעובר העכבר באמצעות

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לנתח את קינטיקת הפנוטיפ של היווצרות ומספר תאי ה-T המופקים על ידי פרוגניטורים שהתיישבו בתימוס ביום העוברי E 13 או E 18. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד האונות של התימוס מעוברי עכבר בימים E 13, E 14 ו-E 18. בשלב השני, מקרינים את אונות התימוס מיום E 14 ולאחר מכן מזריעים אותן עם תאי E 13 או E 18 שעברו מיון באמצעות זרימה (flow sorted) למשך 48 שעות בשיטת טיפה תלויה (hanging drop).

בשלב הסופי, האונות המיושבות מושתלות תחת קפסולת הכליה של עכברים בוגרים מסוג CD three knockout. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בציטומטריה של זרימה כדי להעריך את נוכחותם של צאצאי תאי הפרוגניטור של התיישבות התימוס משלבים E 13 ו-E 18 בדם של בעלי החיים הכימריים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תרבית T cells in vitro על תאי ine so, הוא שטכניקה זו משלבת שיטות המאפשרות הבשלה מלאה של T-cell מפרוגניטורים מוגדרים במערך תלת-ממדי עם השתלה של תרביות איברי תימוס בעכברי רקפיה שלמים, מה שמאפשר להעריך את הדיפרנציאציה והתפקוד של פרוגניטורי התימוס וצאצאיהם.

כמהנדסת מחקר עם מומחיות בניתוחים במכרסמים, אדגים את הפרוצדורה. יומיים לפני ניסוי ההשתלה, בתוך מapay flow hood, נחטא את בטנה של נקבת עכבר הרַיה עם 70% ethanol ונבצע חיתוך אורכי בעור בקו האמצע, נרחיק את העור כדי לפתוח את החתך ולאחר מכן נשתמש בפינצטה ובמספריים כדי לפתוח את הפריטונאום מבלי לגעת במערכת העיכול. לאחר מכן, נוציא את הרחם הדו-קרני ונשתמש במספריים כדי להפרידו מהנרתיק. לאחר מכן נניח את הרחם בצלחת פטרי של 90 על 15 מילימטר המכילה 40 עד 50 מיליליטר של DPBS ונבצע חיתוך רוחבי בין הדצידואה של כל עובר.

השתמשו במספריים בעלי קצה דק ובפינצטה עדינה כדי להסיר את קרום השריר של הרחם, תוך גזירה בין השליה לשקיק החלמון כדי להוציא כל עובר. לאחר מכן, הסירו את השקיק העמוני תוך שמירה על העוברים, והעבירו את העוברים לכלי פטרי חד המכיל HBSS בתוספת 1% FCS. כדי לבודד את התימוס, הניחו את העוברים אחד אחד במצב שכיבה (supine) תחת זכוכית מגדלת בינוקולרית.

לאחר מכן, הכניסו פינצטה לאורכה לאורך סחוס העצם הסטרנום, וצבטו ופתחו את כלוב בית החזה באמצעות פינצטה קמורה. הזיזו את דופן בית החזה הצידה כדי לדגום את האונות של התימוס בכל צד של הקנה. לאחר מכן, צבטו מתחת לתימוס עם פינצטה עדינה כדי להוציא בזהירות כל אונה ולהניח אותן בצלחת פטרי המכילה 1 mL של HBSS בתוספת 1% FCS.

בשלב הבא, השתמשו בשתי פינצטות עדינות כדי להסיר את רקמת החיבור שמסביב מבלי לפגוע באונות. לאחר מכן, שטפו את האונות בשלושה מיליליטר של HBSS בתוספת 1%FCS כדי להסיר את תאי הדם האדומים לצורך תחילת תרבית של איבר תימוס עוברי. אונות תימוס של E 14 בודדו מעוברים מסוג CD 45.2 כפי שהודגם כעת.

השאירו את האונות למנוחה למשך כשלוש שעות. לאחר מכן, סובבו במערכת צנטריפוגה פרוגניטורים של תימוס שמופרים טריים משלב E 13 או E 18. השעיקו את המשקע במצע תרבית לריכוז סופי של 500 תאים ל-35 µL של מצע.

לאחר מכן, הניחו טיפה של 35 µL של סספנסיות תאים בכל באר שנייה בתוך פלטת terasaki בעלת 60 בארות, והניחו אונה אחת שהוקרנה על פני השטח של כל טיפה. סגרו את הפלטה והפכו אותה כדי לאפשר לתאים להגיע לקוטב האפיקלי של הטיפה באמצעות כוח הכבידה, והקישו בעדינות על הצד העליון של הפלטה ההפוכה כדי לדחוף את האונות להחליק אל הקצה האפיקלי של הטיפה. לאחר מכן, דגרו את הפלטה ההפוכה באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide למשך 48 שעות.

לאחר שהאונויות של הבלוטה התימיאית קולונסו, ודאו את רמת ההרדמה של החיה המקבלת על ידי בדיקת היעדר תגובה רפלקסיבית. לאחר מכן, מרחו טיפה של פומדת עיניים בכל עין והניחו את העכבר על צדו הימני תחת מ𒋻 זרימה למינרית. לאחר מכן, גלחו את אזור הניתוח מעל למפרק הרגל האחורית.

לאחר מכן, חבשו זוג כפפות סטריליות והסדירו את שטח הניתוח באמצעות 70% ethanol ותמיסת 10% IOD DY DER. השתמשו בסקאלפל כדי לבצע חתך של 1.5 סנטימטר דרך רקמת העור, ולאחריו חתך דרך רקמת השריר. כעת הפעילו לחץ קל משני צידי החתך כדי לדחוף את הכליה מחוץ לחלל הבטן, ושמרו על לחות הכליה באמצעות תמיסת saline.

החזיקו את הכליה בעזרת מקלוני צמר之外 של חלל הרטרו-פריטונאום (retroperitoneal cavity), והשתמשו בשתי פינצטות עדינות כדי ליצור חור של שני עד שלושה מילימטרים בקפסולה. לאחר מכן, תוך כדי החזקת דופן הקפסולה פתוחה, החליקו בזהירות עד שישה שתלים של לובי תימה (thymic lobe) לכיוון קוטב הכליה והחזירו את הכליה לחלל הרטרו-פריטונאום. תפרו את השריר בתפר רציף, ולאחר מכן תפרו את העור באמצעות קשרי כירורג בודדים.

לאחר מכן, הרטב את הפצע בתמיסת פובידון-יודיד 10%, והנח את העכבר על פלטת חימום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, תוך ניטור בעל החיים והפצע הניתוחי עד להחלמה מלאה של שניהם, כדי לקבוע את השיטה הטובה ביותר לדילול תימocytes אנדוגניים לצורך פיתוח של פרוגניטורים מתנחלים. בניסוי זה, הושוו רמות השחזור של תאי T באונה תימית שהתנחלו בה לאחר הקרנה או טיפול של חמישה ימים ב-deoxy guine. בעוד שלא נצפתה הבדל במספר הלימפוציטים המתנחלים ביום התשיעי של התרבית, האונות המוקרנות הכילו יותר תאי T מאשר אלו שטופלו ב-deoxy guine ביום 12, מה שהופך את ההקרנה לטיפול המועדף להשראת התפתחות תאי T לאחר התנחלות תימית. כדי לבחון כאן את הפוטנציאל ההתפתחותי של פרוגניטורים מתנחלים בתימהס ב-E 13 ו-E 18, אונות תימיות מוקרנות ב-E 14 הושגחו עם מספר שווה של שני סוגי הפרוגניטורים; כפי שנצפה, הפרוגניטורים המתנחלים בתימהס ב-E 13 הולידו פחות תימocytes ותאי T כפולי-חיוביים מאשר הפרוגניטורים המתנחלים בתימהס ב-E 18.

עם זאת, שכיחות התאים הבשלים החיוביים ל-CD3 עלתה, והפקת תאי T אפיתליים דנדריטיים זיהתה רק בצאצאים של תאי פרוגניטורים של התיישבות תימוסית מהשלב E13. כדי לנתח את הפוטנציאל in vivo של תאי פרוגניטורים של התיישבות תימוסית מהשלבים E13 ו-E18, אונונות תימוס שיושבו עם כל סוג של פרוגניטורים הושתלו תחת קפסולת הכליה של מקבלים עם CD3 knockout. כפי שהודגם זה עתה, וכפי שניתן היה לצפות, תאי הפרוגניטורים של התיישבות תימוסית מהשלב E13 הולידו תאי T במהירות רבה יותר מאשר הפרוגניטורים מהשלב E18, אם כי מספר תאי ה-T במחזור הדם היה נמוך משמעותית באופן כללי בבעלי החיים שיושבו על ידי פרוגניטורים של התיישבות תימוסית מהשלב E13. לאחר פיתחו, סלל פיתוח זה את הדרך עבור חוקרים בתחום האימונולוגיה ההתפתחותית לחקור את התכונות של תתי-אוכלוסיות של תאי T, שחלקן הן ממקור עוברי מובהק במודל של יונקים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה בידכם הבנה טובה של אופן המעקב אחר נתיבי הבידול והתפקוד של תאי פרוגניטורים שוקעים של Timex וצאצאיהם, הן בסביבה טבעית והן בתנאים תחרותיים.