Athymic עכברוש מודל להערכת הנדסי קדמי צולב גידים שתלי

המטרה הכללית של הפרוצדורה הבאה היא להשתמש במודל של מכרסמים כדי להעריך שתלים של רקמה מהונדסת להחלפת הרצועה הצולבת הקדמית. מטרה זו מושגת תחילה על ידי ייצור פיגום פולימרי מתכלה, ובשלב השני, השתלת הפיגום בברכו של חולדה.

לאחר 16 שבועות, הרצועות החדשות שהתגבשו מהפיגום נאספות לצורך אנליזה היסטולוגית. לבסוף, נבחנת החוזקה הביומכנית של הקולגן כדי להעריך את איכותן של השתלים המהונדסים מרקמה זו לשימוש בשחזור של ACL. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות אחרות להערכת פיגומים הם שדגם זה חושף את הפיגום לסביבה מורכבת in vivo, בעודו נותר יעיל מבחינה כלכלית וקל יותר לטיפול מאשר דגמים של בעלי חיים גדולים יותר.

מודל זה יכול לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הנדסת הרקמות, כגון כיצד ישתלב פיגום מהונדס עם הסביבה in vivo ליצירת רצועה חדשה (neo ligament)? טכניקה זו עשויה להוביל לטיפולים חדשים ולשחזור של ה-ACL. כיוון שמודלים של בעלי חיים קטנים מהווים את השלב הראשון בדרך לתרגום קליני, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להעריך את הפיגום הספציפי שלנו.

ניתן ליישם זאת גם על מבני רקמה מהונדסים אחרים, כגון כאלה המכילים תאים וגורמי גדילה. אנו מבצעים אופטימיזציה לטכניקה הכירורגית על ידי התאמת השיטות שנעשה בהן שימוש על ידי ד"ר Scott Rodeo ועמיתיו בבית החולים לכירורגיה מיוחדת (Hospital for Special Surgery) בניו יורק. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן את שלבי האלקטרו-ספינינג והשלבים הכירורגיים עשוי להיות קשה ללמוד מהוראות כתובות בלבד.

בעת ביצוע אלקטרוספינינג של פיגומים מפוליקפרולקטון, תידרש קופסת אקריל גדולה עם נקודות כניסה עבור תמיסת הפוליקפרולקטון המקורית. תהיה דרוש מנדריל איסוף המופעל על ידי מנוע ויציאת ואקום המופעלת על ידי מקור מתח, כאשר אלו ימוקמו בתוך מנדף כימי שישמש כמדיום ואקום מבודד עבור תהליך האלקטרוספינינג. לפני תחילת הפרוצדורה, נקו את הקופסה ביסודיות עם 70% ethanol וכסו את כל המשטחים בגיליונות para film כדי להסיר זיהומים שעלולים לפגוע באיכות המוצר שהופק באלקטרוספינינג.

לאחר מכן, הפעילו את המאוורר והעמיסו שלושה milliliters של פולימר polycaprolactone שהוכן טרי לתוך מזרק של 10 milliliters עם מחט בעלת קצה קהה בכיול 18 gauge. לאחר הסרת בועות אוויר, נעלו את התמיסה במשאבת מזרקים תכנונית והחדירו את המחט אל תוך קופסת האקריליק דרך פתח הכניסה, תוך השארת כחצי אינץ' מהמחט מחוץ לקופסה. לאחר מכן, כסו את ה-mandrel של המחרטה המסתובבת באופן הדוק ברצועה דקה של נייר אלומיניום ונעלו את ה-mandrel למנוע בצדה השני של הקופסה, במרחק של כ-15 centimeters ממחט המזרק כדי שישמש כאספן; החדירו צינור פלסטיק לפתח הוואקום.

לאחר מכן, חברו את הצינור למקור הוואקום של מכן העששים והפעילו אותו. כעת כסו את תיבת האקריליק במכסה והגדירו את קצב ההזרקה של משאבת המזרק התכנותית ל-2.5 milliliters per hour. לאחר מכן, הארקיעו את המוליך השלילי, הפעילו את המנוע כדי להפעיל את המנדרל ב-3,450 RPM, והשתמשו בתפס תנין כדי לחבר את המוליך החיובי של מקור המתח לקצה המחט מחוץ לתיבה.

ברגע שהתחילה הזרקת תמיסת ה-polycaprolactone, הפעילו את מקור המתח והגדירו אותו למתח עבודה של 20 kilovolt. לאחר 12 דקות של הזרקה, תיווצר מעטפת הומוגנית מ-0.5 milliliters של תמיסת ה-Polycaprolactone. כבו את כל הציוד, כולל מקור המתח, המנוע, הוואקום ומשאבת המזרק.

הסר את המנדרל מהמנוע, הסר את שרוול הפולימר מהמנדרל, ובצע חיתוך רוחבי יחיד כדי לקבל רשת אלקטרו-ספינינג (electro spun) מלבנית. לאחר מכן, חתוך את הרשת באמצעות לייזר כדי ליצור מספר דפים קטנים, אשר ייחתכו בהמשך לרצועות, יעמדו בארבעה שכבות וייתפרו יחד ליצירת פיגומים (scaffolds) לפני תחילת הניתוח. ראשית, ודא הרדמה מספקת על ידי היעדר תגובה ללחץ על כף רגל אחורית.

לאחר מכן, בצעו חתך אנכי באורך של שני סנטימטרים מדיאלית לברך, במרכז גובה הפיקה, תוך הרחקה לטרלית של העור במידת הצורך. בשלב הבא, השתמשו בסקלפל כדי לבצע ארטרוטומיה פארה-פטלרית מדיאלית (medial para patella arthrotomy) ממש מדיאלית לפיקה, המתרחבת פרוקסימלית עד לגובה החיבור השריר-גידי של השריר הארבע-ראשי ודיסטלית עד לגובה נקודת ההיצמדות של גיד הפיקה לבליטת השוקה (tibial tubercle). כעת, בצעו חתך אנכי של סנטימטר אחד דרך קפסולת הברך, ממש לטרלית לגיד הפיקה, כדי לשחרר את הפיקה לטרלית.

לאחר מכן, תוך הבטחה שהברך מתוחה, העבירו זוג מספריים עדינים מתחת לפיקה מהצד הלטרלי (החיצוני) לצד המדיאלי (הפנימי), ופתחו את המספריים מספר פעמים כדי שניתן יהיה להסיט את מנגנון הפשיטה לאחד הצדדים תוך כיפוף הברך. הסיטו את הפיקה לטרלית כדי לחשוף את החלק הפנימי של מפרק הברך, וודאו כי קיימת ראות ברורה של הפלג המבצעי (intercondylar notch) ושל קונדילים של הפמור. לאחר מכן, בצעו חיתוך של ה-ACL וה-PCL בתוך השקע.

כעת מקמו את קצהו של סיב K ברוחב 1.6 מילימטר המחובר למקדחה חשמלית בנקודת המקור של ה-ACL בקרסם הבין-מבני (intercondylar notch), וקדחו לכיוון עליון-צדי בעוד עוזר מייצב את הברך. לאחר מכן, העבירו את סיב ה-K פנימה והחוצה מספר פעמים כדי להבטיח מעבר פנוי עבור השתל. זהו את נקודת היציאה בצד הלטרלי של הפמור, והסירו רקמות רכות במידת הצורך באמצעות סכין מנתחים.

כאשר התעלה נקייה, מקמו את סיכת ה-K-wire על טביעת הרגל של ה-ACL על רמת השוקית (tibial plateau) וקדחו לכיוון חיצוני בעוד עוזר מייצב את הברך. לאחר מכן, זהו את נקודת היציאה בחלק הקדמי-צדי הפרוקסימלי של השוקית, והשתמשו בסקלפל כדי לפנות רקמה רכה במידת הצורך, כך שנקודת היציאה של ה-K-wire מהשוקית תהיה גלויה לחלוטין, והעבירו מחט Keith מקוצרת, באורך של לא יותר משני אינץ', דרך תעלת עצם הירך.

לאחר מכן, השתמש במחט כדי להעביר את הקצה השני של הש transplanted דרך התעלת השוק באמצעות תפר Vicryl 4-0. בשלב הבא, קבע את הקצה הפמורלי של הש transplanted לרקמה הרכה שסביבו באמצעות תפר בצורת שמינית, תוך שמירה על הברך במצב פשיטה (extension) כדי ליצור מתיחה ידנית של הש transplanted. השתמש בתפר שמינית נוסף כדי לקבע את קצה השוק של הש transplanted לרקמה הרכה שסביבו, וגזור את עודפי הש transplanted בשני הקצוות באמצעות מספריים, כך שיישארו 1-2 מילימטרים מעבר לתפר בכל קצה.

לבסוף, יישרו את הברך והחזירו את הפיקה למקומה. לאחר מכן, באמצעות תפר Vicryl 4-0, בצעו תפר בודד בצורת שמינית (figure of eight) לסגירת הקפסולה המדיאלית של המפרק, כדי למנוע תת-פריקה לטרלית של הפיקה, וסגרו את העור בתפר רץ תת-עורי באמצעות Monocryl או Vicryl 5-0. בשבוע 16 לאחר השחזור, ניתוח היסטולוגי של חתכי הברך מדגים כי מטריצת הפיגום הופכת למאוכלסת במידה רבה בפיברובלסטים, המפרישים קולגן אאוזינופילי עם אינטגרציה טובה לתוך תעלות העצם.

בניסוי זה, נבחנו התכונות הביו-מכניות של המפרק מיד לאחר ההקרבה. כל הדגימות שנבדקו קרסו במרכז הרקמה, בהתבסס על עקומות העתקה נמוכה שהופקו מבדיקות מתיחה. עומס הכשל והקשיחות חושבו עבור כל קבוצה.

בשבוע ה-16 לאחר ההשתלה, השתל הפולימרי המיוצר במיקרו-סיבים (electro spun) הכפיל בקירוב את עומס השיא והקשיחות של השתל שנבדק מיד לאחר ההשתלה. למרות שערכים אלו היו עדיין נמוכים מאלו של ה-ACL הטבעי, לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע את הניתוח בבעל החיים בתוך כ-15 דקות. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבצע סגירה טובה כך ששום תפר לא יהיה גלוי מבחוץ.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע ניתוחי נקודת סיום נוספים, כגון צביעות נוספות ובדיקות ביוכימיות. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הנדסת הרקמות להערכת אפשרויות השתלה מגוונות לצורך שחזור ה-ACL. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן הייצור של פיגום פולימרי להשתלה במודל מכרסמים לשחזור ACL.

אל תשכחו שעבודה עם בעלי חיים חיים עלולה להיות מסוכנת, ויש לנקוט באמצעי זהירות בכל עת בעת ביצוע הליך זה, כגון הקפדה על המלצות וטרינריות וחבישת ציוד מיגון אישי.