איתור של Axonally המותאם למקום mRNAs בסעיפי מוח באמצעות ברזולוציה גבוהה

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לזהות mRNA הממוקם באופן מקרי בדגימות של מוח בוגר. מטרה זו מושגת על ידי טיפול מקדים של הדגימות באמצעות הרתחה ועיכול בפרוטאז כדי לחשוף את מולקולות ה-mRNA; כשלב שני מבוצע תהליך היברידיזציה, ולאחריו שלבי הגברה וזיהוי, המאפשרים את הוויזואליזציה של ה-mRNA המבוקש.

בשלב הבא צובעים את האקסונים באמצעות נוגדנים או צבעים כדי לוודא שה-mRNA המבוקש ממוקם באקסונים. התוצאות מראות נוכחות של mRNA של TF four בדגימות מוח תוך שימוש בפרוצדורות חשיפה (unmasking) וצביעות שונות, בשיטות צביעה המבוססות על ניתוחים מיקרוסקופיים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות במדעי המוח, כגון אילו mRNA ממוקמים ומתורגמים ללא אקסונים.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי סינתזת חלבונים תוך-נוירונלית, ניתן ליישמה גם על מערכות אחרות כגון דנדריטים ותאים ורקמות שאינם נוירונליים שבהם מתרחש מיקום של mRNA. לאחר קיבוע פרוסות מוח, בהתאם להוראות בפרוטוקול הכתוב, הכינו Copin jar המכיל 60 milliliters של תמיסת שחזור אנטיגן והטבילו את השקופיות בתמיסה. לאחר מכן, מלאו כוס כימית של one liter במים מזוקקים והניחו אותה במיקרוגל כדי למתן את החום.

בעת ביצוע הסרת המסכה (unmasking), יש להניח את צנצנת ה-coplan המכילה את השקופיות ואת תמיסת השחזור לתוך המיקרוגל. הרתח את השקופיות בהספק גבוה למשך חמש דקות. מיד לאחר שהתמיסה הפסיקה לרתוח, חמם את השקופיות שוב בהספק גבוה למשך חמש דקות נוספות.

יש להניח למשטות להתקרר בטמפרטורת החדר. לאחר הקירור, טבול את המשטות במיכל המכיל PBS לשטיפה, וחזור על השטיפה פעמיים נוספות. לאחר השטיפה, הנח את המשטות על משטח שטוח והוסף שתי עד שלוש טיפות או 100 µL של DAP B.Probe לשני או שלושה חתכי מוח כביקורת. כדי להעריך את צביעת הרקע, הוסף שתי עד שלוש טיפות של הגשוש המכוון (targeting probe) לחתכים הניסוייים. כדי לזהות את ה-RNA המבוקש, נעשה שימוש בגשוש המכוון לשאריות 20 עד 1381 של mouse a TF four RNA. השתמש בפינצטה כדי להניח פארפילם מעל המשטות למניעת התאיידות של הגשוש.

לאחר מכן, הניחו את השקופיות בתוך קופסת שקופיות ללחות בתנור ההיברידיזציה והדגירו אותן בטמפרטורה של 40 °C למשך שעתיים. לאחר תום זמן ההדגרה, שטפו את השקופיות בתוך צלחת עם wash buffer בריכוז 1x למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו שתי עד שלוש טיפות של amplification reagent a MP one fl לכל פרוסת מוח.

לאחר מכן, כסו ב-para film טרי, הניחו בקופסת השקופיות והדגירו בטמפרטורה של 40 degrees Celsius למשך 15 דקות בתנור ההיברידיזציה. לאחר שטיפת השקופיות כפי שבוצע קודם לכן, הוסיפו שתי עד שלוש טיפות של ריאגנט הגברה A MP four fl לכל פרוסה של מוח וכסו ב-perfil. הדגירו את השקופיות בקופסת השקופיות בטמפרטורה של 40 degrees Celsius למשך 15 דקות בתנור ההיברידיזציה.

שטפו את השקופיות פעמיים עם תמיסת שטיפה בריכוז 1x למשך שתי דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר. כפי שנעשה קודם לכן, לאחר השטיפה האחרונה, כסו כל פרוסה ב-100 עד 200 µL של תמיסת חסימה המכילה 3 mg/mL BSA, 100 mM glycine ו-0.25% Triton X 100 ב-PBS. כסו כל שקופית ב-Parafilm והדגירו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר ההדגרה, הוסיפו לשקופיות 100 עד 200 µL של נוגדן המדלל בתמיסת חסימה. במקרה זה נעשה שימוש בנוגדן anti-choline acetyltransferase. לאחר כיסוי השקופיות ב-Parafilm, הדגירו למשך יומיים ב-4 °C.

ודאו שפרוסות המוח אינן מתייבשות; במידת הצורך, מרססו שוב תמיסת נוגדן anti CHATT על פרוסות המוח 24 שעות לאחר האינקובציה. לאחר שטיפת השקופיות שלוש פעמים ב-XPBS למשך חמש דקות, הוסיפו לשקופיות בטמפרטורת החדר 100 עד 200 µL של נוגדן שני מתאים המצומד ל-Alexa.

כסו ב-param והדגירו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר תוך הגנה מאור לאחר שתעבור השעה. שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-XPBS למשך חמש דקות בכל פעם כפי שנעשה קודם לכן, ולאחר מכן שטפו פעם אחת במים מזוקקים. רכבו את השקופיות עם תוך רכיבה המכיל DPI ולאחר מכן הדמינו את פרוסות המוח תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה.

לאחר הכנת דגימות מוח אנושי מקובעות בפורמלין ומוטמעות בפראפין, בהתאם להוראות בחלק הכתוב של הפרוטוקול, בצעו חשיפת אנטיגנים בהשראת חום (heat induced antigen unmasking) על ידי טבילת השקופיות בתמיסת קדם-טיפול 2 חמה והרתחה למשך 15 דקות. לאחר שטיפה של שלוש עד חמש פעמים במים מזוקקים ושלוש עד חמש פעמים ב-100% ethanol טרי, הניחו לשקופיות להתייבש למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לבצע חשיפת אנטיגנים בהשראת פרוטאזה. הוסיפו ארבע טיפות של קדם-טיפול 3, כסו ב-perfil והדגירו למשך 30 דקות ב-40 °C בתנור ההכלה (hybridization oven). לאחר מכן שטפו שלוש עד חמש פעמים במים מזוקקים.

כמו קודם לכן, הוסיפו ארבע טיפות של סט הגששים DAP B לפרוסות מוח של ביקורת כדי להעריך את הצביעה ברקע, וארבע טיפות של סט הגששים המכוונים (targeting probe set) לחתכים הניסיוניים. הניחו את זוג השקופיות המכוסות בסרט בתוך קופסת השקופיות והדגירו למשך שעתיים בטמפרטורה של 40 °C בתנור ההיברידיזציה. לאחר ביצוע השלבים המפורטים בפרוטוקול הכתוב לפיתוח אות ה-DAB עבור ה-mRNA הרלוונטי, בדקו את נוכחות האות תחת מיקרוסקופ שדה בהיר (brightfield microscope).

הגדירו אזורי ייחוס בדגימות המוח שבהם תעקבו אחר נוכחות של puncta לאורך הליך הצביעה הנגדית. לצורך הצביעה הנגדית, ראשית הניחו את השקופיות ב-luxal fast blue שחומם מראש ל-60 °C והדגרימו למשך 30 דקות ב-60 °C.

לאחר הדגירה, שטפו את השקופיות מספר פעמים במים מזוקקים ולאחר מכן טבלו את השקופיות מספר פעמים בתמיסת lithium carbonate בריכוז 0.05% כדי להתחיל את הדיפרנציאציה. לאחר מכן, טבלו את השקופיות פעמיים ב-75% ethanol טרי ושטפו במים מזוקקים. בדקו את פרוסות המוח תחת מיקרוסקופ שדה בהיר (bright field microscope).

שימו לב כי החומר האפור והחומר הלבן צריכים להתחיל להיות מובחנים, וגרנולות RNA עדיין צריכות להיראות כנקודות כחולות-שחורות כהות. ודאו כי האקסונים מתחילים להופיע כסיבים כחולים בהירים; חזרו על הליך הצביעה ב-Luxal Blue, תוך דגירה עם Luxal Blue במרווחי זמן של 10 עד 20 דקות ומעקב קפדני אחר צביעת הנגד והנוכחות של גרנולות RNA עד להשגת צביעה אופטימלית. לאחר הדגירה, הניחו את השקופיות לשטיפה בתוך תמיסת Crystal Violet והדגירו למשך 10 דקות.

שטפו את השקופיות במים מזוקקים. טבלו את השקופיות ב-70% ethanol בין חמש ל-10 פעמים, ולאחר מכן בצעו דהידרציה באמצעות שלושה החלפות מהירות של 100% ethanol במנדף כימיים. בצעו שקיפות של פרוסות המוח על ידי אינקובציה פעמיים ב-xylene.

סוכן הבהרה חלופי למשך שתי דקות ופעם שלישית למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר, קבעו את פרוסות המוח בתווך קיבוע קבוע מבוסס xylene ובצעו אנליזה תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. עבור הדג בוצע תהליך חשיפה (unmasking) באמצעות פרוטאז, ולאחריו זיהוי נוגדנים של choline acetyl transferase המופיע בצבע אדום.

הנוגדן לא זיהה את chat כאשר בוצע טיפול בפרוטאז. מוצגים דוגמאות לתוצאות שהתקבלו עם גשושית שאינה מטרתית ועם גשושית המכוונת ל-TF four תוך שימוש באותן הגדרות מיקרוסקופ והתאמות תמונה. גרנולות ירוקות חיוביות ל-ATF four עם לוקליזציה אקסונית לא ברורה מסומנות בסימני שאלה.

אזורים כחולים הם גרעינים שצבעו בשיטה נקודתית כאשר ביצעו את הצביעה באמצעות חשיפת אנטיגן בהשראת חום. חשיפה חוזרת של צביעה אימונופלואורסצנטית, המוצגת שוב באדום, הייתה מוצלחת. גרנולות חיוביות ל-TF four הממוקמות באקסונים מופיעות בכתום ומסומנות כ-okay; האקסונים נצבעו בסימון נגדי באמצעות luxal.

צביעות ב-Fast blue וב-neuronal SOTA נצבעו בצביעה נגדית של crestal violet suboptimal luxal. צביעת Fast blue עשויה להתרחש אם הטמפרטורה יורדת. במקרה זה, הדגימות נצבעו ב-luxal fast blue בטמפרטורה של 40 °C למשך ארבע שעות.

גרגירים ארבעה חיוביים של TF עם לוקליזציה מקרית לא ברורה מסומנים בסימני שאלה. צביעה סוב-אופטימלית מתרחשת גם כאשר עוצמת צביעת הנגד אינה נבדקת לאחר תקופות אינקובציה קצרות, כפי שנראה כאן. דוגמאות לצביעת LFB אופטימלית בשילוב עם ish באמצעות פרובה לא-מטרה או באמצעות פרובה המכוונת ל-TF ארבעה מוצגות כאן.

רכישת התמונות הותאמה באופן אוטומטי כדי להשיג את יחס אות לרעש המיטבי. Axon מיקם ארבעה גרנולות של TF המסומנות כ-okay. לאחר שלב ה-mastering.

ניתן לבצע טכניקה זו בטווח של יום עד שלושה ימים, בהתאם לשיטת הצביעה הנגדית שנבחרה לאחר הפיתוח. טכניקה זו סוללת את הדרך עבור נוירומדענים לחקור תרגום ומיקום של mRNA באופן מפורט.