Name: איתור של Axonally המותאם למקום mRNAs בסעיפי מוח באמצעות ברזולוציה גבוהה באתר הכלאה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: למד לזהות mRNA ממוקמים באקסונים במוח באמצעות הכלאה באתר ברזולוציה גבוהה בשילוב אימונוהיסטוכימיה. שיטה זו מאפשרת למדעני מוח לחקור ביטוי גנים ותרגום בתאי עצב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי אגודת האלצהיימר (NIRG-10-171721; ל-U.H.), המכון הלאומי לבריאות הנפש (MH096702; ל-U.H.), המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי (NS081333; ל-C.M.T.), ופרסי מחקר פיילוט מהמכון הלאומי להזדקנות המרכז לחקר מחלת האלצהיימר באוניברסיטת קולומביה (AG008702; לג'.ב. וי.י.ג'יי) התומך גם בבנק המוח של ניו יורק. אנו מודים לחברי מעבדת Hengst על ההערות והדיונים

<ol><li>Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+mRNA+localization+and+local+protein+synthesis+in+nervous+system+assembly%2C+maintenance+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).</li>
<li>Campbell, D. S., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotropic+responses+of+retinal+growth+cones+mediated+by+rapid+local+protein+synthesis+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation.</a> Neuron. 32, 1013-1026 (2001).</li>
<li>Wu, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+translation+of+RhoA+regulates+growth+cone+collapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Local translation of RhoA regulates growth cone collapse.</a> Nature. 436, 1020-1024 (2005).</li>
<li>Piper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+mechanisms+underlying+Slit2-induced+collapse+of+Xenopus+retinal+growth+cones%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones.</a> Neuron. 49, 215-228 (2006).</li>
<li>Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+%CE%B2-actin+mRNA+localization+and+translation+in+Ca2%2B-dependent+growth+cone+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An essential role for β-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance.</a> Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).</li>
<li>Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+elongation+triggered+by+stimulus-induced+local+translation+of+a+polarity+complex+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein.</a> Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).</li>
<li>Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+translation+of+TC10+is+required+for+membrane+expansion+during+axon+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth.</a> Nat. Commun. 5, 3506(2014).</li>
<li>Preitner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APC+Is+an+RNA-Binding+Protein%2C+and+Its+Interactome+Provides+a+Link+to+Neural+Development+and+Microtubule+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly.</a> Cell. 158, 368-382 (2014).</li>
<li>Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+protein+synthesis+provides+a+mechanism+for+localized+regulation+at+an+intermediate+target%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target.</a> Cell. 110, 223-235 (2002).</li>
<li>Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+receptor+DCC+associates+with+protein+synthesis+machinery+and+regulates+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation.</a> Cell. 141, 632-644 (2010).</li>
<li>Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+axon+guidance+by+compartmentalized+nonsense-mediated+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay.</a> Cell. 153, 1252-1265 (2013).</li>
<li>Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-axonal+translation+and+retrograde+trafficking+of+CREB+promotes+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival.</a> Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).</li>
<li>Ji, S. J., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-axonal+translation+of+SMAD1%2F5%2F8+mediates+retrograde+regulation+of+trigeminal+ganglia+subtype+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification.</a> Neuron. 74, 95-107 (2012).</li>
<li>Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+poly%28A%29+mRNA+with+microtubules+in+cultured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons.</a> Neuron. 12, 571-582 (1994).</li>
<li>Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+subcellular+mRNA+compartmentation+in+hippocampal+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture.</a> J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).</li>
<li>Hengst, U., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+and+translational+regulation+of+mRNA+in+developing+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Function and translational regulation of mRNA in developing axons.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).</li>
<li>Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+roles+of+local+translation+from+the+axonal+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome.</a> Open Biology. 2, 120079(2012).</li>
<li>Baleriola, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonally+synthesized+ATF4+transmits+a+neurodegenerative+signal+across+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions.</a> Cell. 158, 1159-1172 (2014).</li>
<li>Gumy, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+embryonic+and+adult+sensory+axons+reveals+changes+in+mRNA+repertoire+localization%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization.</a> RNA. 17, 85-98 (2011).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).</li>
<li>Yoon, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+translation+of+extranuclear+lamin+B+promotes+axon+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance.</a> Cell. 148, 752-764 (2012).</li>
<li>Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+developmentally+regulated+local+translation+of+odorant+receptor+mRNAs+in+the+axons+of+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons.</a> J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).</li>
<li>Willis, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+Localization+of+transgene+mRNA+in+mature+PNS+and+CNS+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons.</a> J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).</li>
<li>Kar, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+the+axonal+trafficking+of+nuclear-encoded+mitochondrial+mRNA+alters+neuronal+mitochondrial+activity+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse.</a> Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).</li>
<li>Levsky, J. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization: past, present and future.</a> J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).</li>
<li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).</li>
<li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).</li>
<li>Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization+analysis+of+mouse+pancreas+using+low-power+antigen-retrieval+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique.</a> J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-Color+Ultrasensitive+Bright-Field+RNA+In+Situ+Hybridization+with+RNAscope%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope.</a> Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).</li>
<li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).</li>
<li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSheehan%2C+DC+%22Theory+and+Practice+of+Histotechnology%22">Theory and Practice of Histotechnology</a>. , 2nd edn, Battelle Press. (1987).</li>
<li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biol. 12, 55(2014).</li>
<li>Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+localization+of+arc+mRNA+in+dendrites+involves+activity-+and+translation-dependent+mRNA+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+molecular+diagnostics+%3A+JMD%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).</li>
<li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and practice of histotechnology. , 2d edn, Mosby. (1980).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

בדוח זה אנו מתארים את השימוש בטכנולוגית ISH ברזולוציה גבוהה בזיהוי של mRNA Atf4 המקומי axonally. מחקרים שפורסמו אלה וקודמים הראו כי טכנולוגיה זו היא תואמת עם זיהוי חלבון מבוסס נוגדנים ברקמות או אפילו עובר כל 33. חשוב לציין, זה כבר היה בשימוש לאחרונה לגילוי Arc mRNA בתוך הדנדריטים של נוירונים בהיפוקמפוס 34. זה גם יכול להיות בשילוב עם צבעים היסטולוגית לצביעת רקמות. לבסוף, הוא מתאים לזיהוי בו זמני של מספר יעד RNAs 28,30,33. ממצאים אל...

גיוס mRNA axonal ותרגום מקומי לאפשר האקסונים להגיב לגירויים תאיים באופן 1 באופן זמני ומרחבית חריפה. סינתזת חלבון תוך-axonal היא הדרך הטובה ביותר להבין בהקשר של התפתחות המוח שבו משחק תפקידים מכריעים בצמיחה חרוט התנהגות 2-8, האקסון מפלס-הדרך 9-11 ומדרדר איתות 12,13. אבל הרבה פחות ידוע על המשמעות התפקודית של סינתזת חלבון axonal בתאי עצב פוסט-התפתחותית כאשר רמות ה- mRNA והריבוזום axonal מופחתות 14,15 מאוד. האקסונים חוליות בוגרים כבר מזמן חשבו להיות translationally פעיל 16. עם זאת, המחקרים אחרונים מצביעים על כך שהתרגום מקומי מחדש באקסונים בוגרים תחת מצבים פתולוגיים. לדוגמא, קבוצת משנה של mRNAs מגויס לאקסונים התחדשות הבאה פגיעה עצבית וסינתזה של חלבונים תוך-axonal נדרשים להתחדשות הנכונה של אקסונים אלה 17. בנוסף, חה הקבוצה שלנוים הוכיח כי mRNAs הספציפי מגויסים לאקסונים לאחר חשיפה מקומית לפפטיד מחלת אלצהיימר Aβ 1-42, ותרגום המקומי של ATF4 גורם השעתוק נדרשת כדי להפיץ את השפעות ניווניות של Aβ 1-42 מן האקסונים לסומה העצבית 18. לבסוף, ניתוחי תפוקה גבוהים גילו כי יש לי האקסונים בוגרים transcriptome יותר מורכבת ודינמית מהצפוי 18-21, במיוחד בתנאים פתולוגיים. לאור המחקרים הללו, שיטה רגישה וספציפית מאוד כדי לזהות mRNAs axonally מקומי במערכת העצבים הבוגרת יש צורך. חלק גדול מהעבודה על גיוס mRNA ותרגום מקומי באקסונים בוגרים שבוצע על נוירונים בתרבית. זה נכון במיוחד עבור transcriptome ניתוחים מאז שיטות culturing מיוחדות קיימות המאפשרות הבידוד של אקסונים מהתא הדנדריטי somato-18-20. למרות שמחקרים כאלה ניתנו תוספות יקרותight לתוך התפקיד של תרגום המקומי באקסונים בוגרים, השאלה אם נוירונים בתרבית מייצגים נאמנה את המצב בvivo או אם גיוס mRNA הוא תגובה אדפטיבית של אקסונים לתנאי culturing עדיין פתוח. מחקרים מעטים סיפקו ראיות לגיוס mRNA להבשיל האקסונים in vivo. לדוגמא, תמליל קידוד לחלבון סמן חוש הריח זוהה באקסונים בתאי עצב תחושתיים מבוגרים 22. Transgene המכיל &#39;UTR 3 של mRNA β-אקטין מועבר לאקסונים בתאי עצב במערכת עצבים היקפיים ומרכזיים בעכברים ומתורגם באופן מקומי לאחר תקופות התפתחותיות 23. B2 Lamin mRNA הוא מקומי לאקסונים רשתית בXenopues laevis ראשנים ודלדולה משפיע תחזוקת האקסון לאחר פיתוח axonal 21. הפרעה לתחבורה axonal של קידוד mRNA לIV מונואמין ציטוכרום C משנה עכבר התנהגות 24. לבסוף, Atf4 mRNA נמצא במבוגריםxons של עכברים ומוח אנושי בהקשר של Aβ 1-42 -induced ניוון מוחיים 18. ניתוחי transcriptome תפוקה גבוהה הוכיחו להיות שימושי כדי לזהות פרופילי mRNA באקסונים מבודדים במבחנה אבל יש מגבלות במחקרי vivo מאז בכל רקמות האקסונים לא נמצאים בבידוד, אבל התערבבו עם גופים עצביים תא, תאי גלייה וסוגי תאים אחרים. לפיכך, ניתוח כזה צריך להיות משולב עם טכניקות הדמיה שלאשר את לוקליזציה subcellular של mRNAs. RNA הכלאה באתר (RNA ISH) מאפשר זיהוי והדמיה של רצפי RNA ספציפיים בתאים וברקמות. עם זאת, מבחני RNA ISH המקוריים היו מתאימים רק לזיהוי RNAs הנרחב ביותר 25, שהוא לעתים רחוקות במקרה של mRNAs המקומי axonally. לעשורים האחרונים גוברים מאמצים כבר הכניס לתוך טכנולוגיות חדישות פיתוח המאפשרות זיהוי של mRNAs ברמת המולקולה בודדת <sup&gt; 25,26. לדוגמא, זינגר ועמיתיו פיתחו בדיקות ISH לזהות mRNAs בתאים בודדים, הכוללים 5 שאינם חופף שכותרתו fluorescently 50 מרס (לפרטים עיינו 27). ההבדל העיקרי בין השיטות שהוזכרו לעיל ואחד כאן תאר הוא שמאוחר יותר משתמש 20 Z-מבנה כפול (לא ליניארי) בדיקות, כי בדרך כלל היעד ~ אזור KB 1 של ה- RNA של הספציפיות הבטחת ריבית ורמות רקע נמוכות. אז בדיקות הם הכלאה עם רצפי מגבר קדם מגבר שסופו של דבר כותרת או מצומדות עם אנזימים המאפשרים תגובות chromogenic fluorescently. צעדי הגברה אלה משפרים את יחס אות לרעש בהשוואה לטכנולוגיות אחרות ISH 28. כאן אנו מתארים שני פרוטוקולים באמצעות RNAscope בשילוב גם עם immunocytochemistry הקרינה או עם צבעים היסטולוגית מאפשרים counterstaining axonal. שני הפרוטוקולים מתאימים לדמיין לוקליזציה axonal של Atf4 mRNA במו הבוגרלהשתמש ומוח אנושי.

<table><tbody><tr><td>בדיקה מותאמת אישית מכוונת שאריות 20-1,381 של העכבר Atf4 mRNA (NM_009716)</td><td>Advanced Cell Diagnostics-בדיקה</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>מותאמת אישית שאריות בדיקה מותאמת אישית 15-1,256 של ATF4 mRNA (NM_001675.2)</td> <td>Advanced Cell Diagnostics-בדיקה</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>בקרה שלילית-DapB</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310043</td><td></td></tr> <tr><td>בדיקהבדיקה בקרה חיובית-עכבר Polr2A (אופציונלי)</td> <td>אבחון תאים מתקדם</td><td>312471</td><td>בדיקה</td></tr><tr><td>בדיקה בקרה חיובית-PPIB אנושי (אופציונלי)</td> <td>אבחון תאים מתקדם</td><td>313901</td><td></td></tr><tr><td>בדיקה RNAscope ערכת ריאגנט פלואורסצנטי (לזיהוי פלואורסצנטי)</td> <td>אבחון תאים מתקדם</td><td>320850</td><td>in-situ ערכת</td></tr> <tr><td>הכלאהערכת ריאגנטים RNAscope 2.0 HD - חום (לזיהוי כרומוגני)</td><td>אבחון תאים מתקדם</td><td>310035</td><td>in situ ערכת הכלאה</td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-ChAT פוליקלונלי עז</td><td>Millipore</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain Kit</td><td>American MasterTech</td><td>KTLFB</td><td></td></tr><tr><td>Clearify Clearify Agent (תחליף קסילן)</td> <td>American MasterTech</td><td>CACLEGAL</td><td></td></tr><tr><td>תושבת זהב ProLong&nbsp; בינונית עם מדיום הרכבה DAPI</td><td>Life</td><td>Technologies P36935</td><td></td></tr><tr><td>DPX</td><td>Sigma</td><td>6522</td><td></td></tr></tbody></table>

איתור של axonally המותאם למקום mrnas בסעיפי מוח באמצעות ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs לעתים קרובות מקומי לאקסונים חוליות והתרגום המקומי שלהם נדרש לpathfinding האקסון או הסתעפות בפיתוח ותחזוקה, תיקון או ניוון של מערכת עצבים בתקופות postdevelopmental. ניתוחי תפוקה גבוהים חשפו לאחרונה כי יש לי האקסונים transcriptome יותר דינמית ומורכבת יותר מהצפוי בעבר. ניתוח אלה, עם זאת כבר נעשה בעיקר בנוירונים בתרבית שבו ניתן לבודד האקסונים מתאי somato-הדנדריטים. זה כמעט בלתי אפשרי להשיג בידוד כזה ברקמות שלמות in vivo. לפיכך, על מנת לאמת את הגיוס של mRNAs ורלוונטי הפונקציונלי שלהם בכל בעלי חיים, צריכים להיות משולבים באופן אידיאלי ניתוחי transcriptome עם טכניקות המאפשרות ההדמיה של mRNAs באתר. לאחרונה, טכנולוגיות ISH רומן המזהות RNAs ברמת מולקולה בודדת פותחו. זה חשוב במיוחד בעת ניתוח לוקליזציה subcellular של mRNA, RNAs המקומי מאז נמצא בדרך כלל ברמות נמוכות. כאן אנו מתארים שני פרוטוקולים לצורך זיהוי של mRNAs axonally-מקומי באמצעות טכנולוגית RNA ISH רומן רגישה. יש לנו שילוב RNAscope ISH עם counterstain axonal באמצעות אימונוהיסטוכימיה הקרינה או צבעים היסטולוגית כדי לאמת את הגיוס של Atf4 mRNA לאקסונים in vivo בעכבר הבוגר והמוח אנושי.

סיכום קצר של ההליכים שתוארו לעיל מוצג באיור 1. זיהוי אופטימלי של Atf4 mRNA גרגירים באקסונים כולינרגית באמצעות הסרת מסכות מושרה חום כאשר הערכת לוקליזציה axonal של mRNAs, זה הוא קריטי כדי להיות מסוגל לזהות את האקסונים ולהיות מסוגל לדמיין RNAs שפע נמוך. טכנולוגית RNA ISH המתוארת כאן מאפשרת זיהוי של RNAs ברזולוציה מולקולה ב...

RNA in situ hybridization (ISH) מאפשר הדמיה של RNA בתאים וברקמות. כאן אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בהצלחה בשילוב של RNAscope ISH עם אימונוהיסטוכימיה או צבעים היסטולוגיים כדי לזהות mRNAs הממוקמים באקסונים בחלקים של מוחות עכברים ובני אדם.

איתור של Axonally המותאם למקום mRNAs בסעיפי מוח באמצעות ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לזהות mRNA הממוקם באופן מקרי בדגימות של מוח בוגר. מטרה זו מושגת על ידי טיפול מקדים של הדגימות באמצעות הרתחה ועיכול בפרוטאז כדי לחשוף את מולקולות ה-mRNA; כשלב שני מבוצע תהליך היברידיזציה, ולאחריו שלבי הגברה וזיהוי, המאפשרים את הוויזואליזציה של ה-mRNA המבוקש.בשלב הבא צובעים את האקסונים באמצעות נוגדנים או צבעים כדי לוודא שה-mRNA המבוקש ממוקם באקסונים. התוצאות מראות נוכחות של mRNA של TF four בדגימות מוח תוך שימוש בפרוצדורות חשיפה (unmasking) וצביעות שונות, בשיטות צביעה המבוססות על ניתוחים מיקרוסקופיים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות במדעי המוח, כגון אילו mRNA ממוקמים ומתורגמים ללא אקסונים.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי סינתזת חלבונים תוך-נוירונלית, ניתן ליישמה גם על מערכות אחרות כגון דנדריטים ותאים ורקמות שאינם נוירונליים שבהם מתרחש מיקום של mRNA. לאחר קיבוע פרוסות מוח, בהתאם להוראות בפרוטוקול הכתוב, הכינו Copin jar המכיל 60 milliliters של תמיסת שחזור אנטיגן והטבילו את השקופיות בתמיסה. לאחר מכן, מלאו כוס כימית של one liter במים מזוקקים והניחו אותה במיקרוגל כדי למתן את החום.בעת ביצוע הסרת המסכה (unmasking), יש להניח את צנצנת ה-coplan המכילה את השקופיות ואת תמיסת השחזור לתוך המיקרוגל. הרתח את השקופיות בהספק גבוה למשך חמש דקות. מיד לאחר שהתמיסה הפסיקה לרתוח, חמם את השקופיות שוב בהספק גבוה למשך חמש דקות נוספות.יש להניח למשטות להתקרר בטמפרטורת החדר. לאחר הקירור, טבול את המשטות במיכל המכיל PBS לשטיפה, וחזור על השטיפה פעמיים נוספות. לאחר השטיפה, הנח את המשטות על משטח שטוח והוסף שתי עד שלוש טיפות או 100 µL של DAP B.Probe לשני או שלושה חתכי מוח כביקורת. כדי להעריך את צביעת הרקע, הוסף שתי עד שלוש טיפות של הגשוש המכוון (targeting probe) לחתכים הניסוייים. כדי לזהות את ה-RNA המבוקש, נעשה שימוש בגשוש המכוון לשאריות 20 עד 1381 של mouse a TF four RNA. השתמש בפינצטה כדי להניח פארפילם מעל המשטות למניעת התאיידות של הגשוש.לאחר מכן, הניחו את השקופיות בתוך קופסת שקופיות ללחות בתנור ההיברידיזציה והדגירו אותן בטמפרטורה של 40 °C למשך שעתיים. לאחר תום זמן ההדגרה, שטפו את השקופיות בתוך צלחת עם wash buffer בריכוז 1x למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו שתי עד שלוש טיפות של amplification reagent a MP one fl לכל פרוסת מוח.לאחר מכן, כסו ב-para film טרי, הניחו בקופסת השקופיות והדגירו בטמפרטורה של 40 degrees Celsius למשך 15 דקות בתנור ההיברידיזציה. לאחר שטיפת השקופיות כפי שבוצע קודם לכן, הוסיפו שתי עד שלוש טיפות של ריאגנט הגברה A MP four fl לכל פרוסה של מוח וכסו ב-perfil. הדגירו את השקופיות בקופסת השקופיות בטמפרטורה של 40 degrees Celsius למשך 15 דקות בתנור ההיברידיזציה.שטפו את השקופיות פעמיים עם תמיסת שטיפה בריכוז 1x למשך שתי דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר. כפי שנעשה קודם לכן, לאחר השטיפה האחרונה, כסו כל פרוסה ב-100 עד 200 µL של תמיסת חסימה המכילה 3 mg/mL BSA, 100 mM glycine ו-0.25% Triton X 100 ב-PBS. כסו כל שקופית ב-Parafilm והדגירו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר ההדגרה, הוסיפו לשקופיות 100 עד 200 µL של נוגדן המדלל בתמיסת חסימה. במקרה זה נעשה שימוש בנוגדן anti-choline acetyltransferase. לאחר כיסוי השקופיות ב-Parafilm, הדגירו למשך יומיים ב-4 °C.ודאו שפרוסות המוח אינן מתייבשות; במידת הצורך, מרססו שוב תמיסת נוגדן anti CHATT על פרוסות המוח 24 שעות לאחר האינקובציה. לאחר שטיפת השקופיות שלוש פעמים ב-XPBS למשך חמש דקות, הוסיפו לשקופיות בטמפרטורת החדר 100 עד 200 µL של נוגדן שני מתאים המצומד ל-Alexa.כסו ב-param והדגירו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר תוך הגנה מאור לאחר שתעבור השעה. שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-XPBS למשך חמש דקות בכל פעם כפי שנעשה קודם לכן, ולאחר מכן שטפו פעם אחת במים מזוקקים. רכבו את השקופיות עם תוך רכיבה המכיל DPI ולאחר מכן הדמינו את פרוסות המוח תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה.לאחר הכנת דגימות מוח אנושי מקובעות בפורמלין ומוטמעות בפראפין, בהתאם להוראות בחלק הכתוב של הפרוטוקול, בצעו חשיפת אנטיגנים בהשראת חום (heat induced antigen unmasking) על ידי טבילת השקופיות בתמיסת קדם-טיפול 2 חמה והרתחה למשך 15 דקות. לאחר שטיפה של שלוש עד חמש פעמים במים מזוקקים ושלוש עד חמש פעמים ב-100% ethanol טרי, הניחו לשקופיות להתייבש למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לבצע חשיפת אנטיגנים בהשראת פרוטאזה. הוסיפו ארבע טיפות של קדם-טיפול 3, כסו ב-perfil והדגירו למשך 30 דקות ב-40 °C בתנור ההכלה (hybridization oven). לאחר מכן שטפו שלוש עד חמש פעמים במים מזוקקים.כמו קודם לכן, הוסיפו ארבע טיפות של סט הגששים DAP B לפרוסות מוח של ביקורת כדי להעריך את הצביעה ברקע, וארבע טיפות של סט הגששים המכוונים (targeting probe set) לחתכים הניסיוניים. הניחו את זוג השקופיות המכוסות בסרט בתוך קופסת השקופיות והדגירו למשך שעתיים בטמפרטורה של 40 °C בתנור ההיברידיזציה. לאחר ביצוע השלבים המפורטים בפרוטוקול הכתוב לפיתוח אות ה-DAB עבור ה-mRNA הרלוונטי, בדקו את נוכחות האות תחת מיקרוסקופ שדה בהיר (brightfield microscope).הגדירו אזורי ייחוס בדגימות המוח שבהם תעקבו אחר נוכחות של puncta לאורך הליך הצביעה הנגדית. לצורך הצביעה הנגדית, ראשית הניחו את השקופיות ב-luxal fast blue שחומם מראש ל-60 °C והדגרימו למשך 30 דקות ב-60 °C.לאחר הדגירה, שטפו את השקופיות מספר פעמים במים מזוקקים ולאחר מכן טבלו את השקופיות מספר פעמים בתמיסת lithium carbonate בריכוז 0.05% כדי להתחיל את הדיפרנציאציה. לאחר מכן, טבלו את השקופיות פעמיים ב-75% ethanol טרי ושטפו במים מזוקקים. בדקו את פרוסות המוח תחת מיקרוסקופ שדה בהיר (bright field microscope).שימו לב כי החומר האפור והחומר הלבן צריכים להתחיל להיות מובחנים, וגרנולות RNA עדיין צריכות להיראות כנקודות כחולות-שחורות כהות. ודאו כי האקסונים מתחילים להופיע כסיבים כחולים בהירים; חזרו על הליך הצביעה ב-Luxal Blue, תוך דגירה עם Luxal Blue במרווחי זמן של 10 עד 20 דקות ומעקב קפדני אחר צביעת הנגד והנוכחות של גרנולות RNA עד להשגת צביעה אופטימלית. לאחר הדגירה, הניחו את השקופיות לשטיפה בתוך תמיסת Crystal Violet והדגירו למשך 10 דקות.שטפו את השקופיות במים מזוקקים. טבלו את השקופיות ב-70% ethanol בין חמש ל-10 פעמים, ולאחר מכן בצעו דהידרציה באמצעות שלושה החלפות מהירות של 100% ethanol במנדף כימיים. בצעו שקיפות של פרוסות המוח על ידי אינקובציה פעמיים ב-xylene.סוכן הבהרה חלופי למשך שתי דקות ופעם שלישית למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר, קבעו את פרוסות המוח בתווך קיבוע קבוע מבוסס xylene ובצעו אנליזה תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. עבור הדג בוצע תהליך חשיפה (unmasking) באמצעות פרוטאז, ולאחריו זיהוי נוגדנים של choline acetyl transferase המופיע בצבע אדום.הנוגדן לא זיהה את chat כאשר בוצע טיפול בפרוטאז. מוצגים דוגמאות לתוצאות שהתקבלו עם גשושית שאינה מטרתית ועם גשושית המכוונת ל-TF four תוך שימוש באותן הגדרות מיקרוסקופ והתאמות תמונה. גרנולות ירוקות חיוביות ל-ATF four עם לוקליזציה אקסונית לא ברורה מסומנות בסימני שאלה.אזורים כחולים הם גרעינים שצבעו בשיטה נקודתית כאשר ביצעו את הצביעה באמצעות חשיפת אנטיגן בהשראת חום. חשיפה חוזרת של צביעה אימונופלואורסצנטית, המוצגת שוב באדום, הייתה מוצלחת. גרנולות חיוביות ל-TF four הממוקמות באקסונים מופיעות בכתום ומסומנות כ-okay; האקסונים נצבעו בסימון נגדי באמצעות luxal.צביעות ב-Fast blue וב-neuronal SOTA נצבעו בצביעה נגדית של crestal violet suboptimal luxal. צביעת Fast blue עשויה להתרחש אם הטמפרטורה יורדת. במקרה זה, הדגימות נצבעו ב-luxal fast blue בטמפרטורה של 40 °C למשך ארבע שעות.גרגירים ארבעה חיוביים של TF עם לוקליזציה מקרית לא ברורה מסומנים בסימני שאלה. צביעה סוב-אופטימלית מתרחשת גם כאשר עוצמת צביעת הנגד אינה נבדקת לאחר תקופות אינקובציה קצרות, כפי שנראה כאן. דוגמאות לצביעת LFB אופטימלית בשילוב עם ish באמצעות פרובה לא-מטרה או באמצעות פרובה המכוונת ל-TF ארבעה מוצגות כאן.רכישת התמונות הותאמה באופן אוטומטי כדי להשיג את יחס אות לרעש המיטבי. Axon מיקם ארבעה גרנולות של TF המסומנות כ-okay. לאחר שלב ה-mastering.ניתן לבצע טכניקה זו בטווח של יום עד שלושה ימים, בהתאם לשיטת הצביעה הנגדית שנבחרה לאחר הפיתוח. טכניקה זו סוללת את הדרך עבור נוירומדענים לחקור תרגום ומיקום של mRNA באופן מפורט.

detection-axonally-localized-mrnas-brain-sections-using-high

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פעמיים פלואורסצנטי באתרו הכלאה בסעיפים המוח טריים

סרטון זה מתאר אסטרטגיית הכלאה רציפה הכוללת הכלאה של גשושיות mRNA ל-mRNA מטרה ספציפי. לאחר הכלאת הגשושיות, הגברת האות מבוצעת כדי לשפר את הרזולוציה באמצעות הפחתת יחס אות לרעש במהלך RNA-CISH של דגימות היסטולוגיות.

הכלאת בדיקה והגברת אותות בהכלאה של RNA באתרו: טכניקה לאיתור רצפי RNA ספציפיים במקטעי רקמות

מקור: Jolly, S., et.al. שילוב של פלואורסצנציה כפולה  בהכלאה באתר עם תיוג חיסוני לזיהוי ביטוי של שלושה גנים במקטעי מוח של עכברים. J. Vis. Exp. (2016). סרטון זה מדגים את השימוש בפלואורסצנציה כפולה בהכלאה באתרה כדי לדמיין את הביטוי של שתי מטרות RNA במקטעי מוח של עכברים. הפרוטוקול כולל זיהוי רציף של RNA באמצעות בדיקות המסומנות בפלואורסצאין איזותיוציאנט ודיגוקסיגנין, ואחריו הגברת אות אנזימטית להגברת הרגישות. הקרינה המתקבלת מאפשרת ניתוח לוקליזציה משותפת של רנ"א המטרה בתוך הרקמה.

 ביצוע הכלאה של פלואורסצנציה כפולה באתרה לאיתור ביטוי גנים במקטעי מוח של עכבר

מקור: Baleriola, J., et. al., זיהוי mRNAs מקומיים אקסונליים בחלקי מוח באמצעות הכלאה ברזולוציה גבוהה באתר.  J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים את זיהוי ה-mRNA בתוך אקסונים כולינרגיים בפרוסות היפוקמפוס קבועות של עכבר באמצעות הכלאה פלואורסצנטית באתרה וצביעת נוגדנים. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית חושפת את הלוקליזציה המרחבית של mRNAs מתויגים בבדיקה וכולין אצטילטרנספראז בנוירונים כולינרגיים.

צביעה חיסונית של נוירונים בפרוסות מוח של עכבר בעקבות הכלאה פלואורסצנטית באתרה

פרוטוקול זה מתאר שיטת הכלאה מהירה ופשוטה באתרה אידיאלית למוח עם קידומת פרה-פורמלדהיד, ובכך מפחית את הצורך בשלבים מורכבים ממושכים תוך שימוש ברקמות קפואות טריות.  השיטה מאומתת באמצעות זיהוי גן הקולטן סרוטונין 5-HT2A htr2a בחולדות.

מהיר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה באמצעות oligonucleotide בדיקות במוח-התחילית Paraformaldehyde של חולדות עם סרוטונין תסמונת

לוקליזציה של ביטוי גנים לסוגי תאים ספציפיים יכולה להיות מאתגרת בשל היעדר נוגדנים ספציפיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי משולש בו זמנית של ביטוי גנים על ידי שילוב של RNA פלואורסצנטי כפול הכלאה באתרו עם צביעה חיסונית.

שילוב קרינה זוגית<em&gt; באתרו</em&gt; כלאה עם Immunolabelling עבור איתור של הביטוי של שלושה גנים בסעיפי מוח עכבר

פרוטוקול זה מתאר שיטה לשילוב הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) ואימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית (IHC) באזורי מוח עכבר טריים קפואים וקבועים, במטרה להשיג FISH רב-תוויות ואות IHC פלואורסצנטי. IHC התמקד בחלבונים ציטופלזמיים וחלבונים המחוברים לממברנה.

שילוב של הכלאה פלואורסצנטית באתרו עם אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית על חלקי מוח טריים של עכברים קפואים או קבועים

Expand-Assisted Fluorative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) היא טכניקה חזקה המשלבת מיקרוסקופ הרחבה עם הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) כדי לזהות ביטוי של גנים מרובים ברקמה עבה. פרוטוקול זה מתאר את ההתקדמות האחרונה בשיטה ואת התאמתה לתיוג מערכת העצבים המרכזית של דרוזופילה השלמה.

זיהוי מולטיפלקס של ביטוי גנים במוח הדרוזופילה השלם באמצעות פלואורסצנציה איטרטיבית בסיוע הרחבה בהכלאה באתרה

הקמנו מבחן הכלאה דופלקס באתרו למיפוי איזופורמים של קולטני אינסולין IR-A ו-IR-B במקלעת הכורואיד של העכבר, תוך התגברות על מגבלות השיטות המסורתיות. גישה ברזולוציה גבוהה זו חושפת ביטוי ספציפי לאיזופורמים, ומציעה תובנות חדשות לגבי איתות אינסולין במוח וטיפולים ממוקדי איזופורמים פוטנציאליים להפרעות נוירולוגיות.

הדמיה מדויקת של קולטני אינסולין A ו-B במוח עכברים עם בדיקת היברידיזציה של RNA באתרו

מחקר זה מציג שיטה איתנה לבידוד mRNA אקסונים באמצעות הכנסות ממברנה נקבוביות, המאפשרת הפרדה מלאה בין נוירונים לנויריטים וטיהור RNA. בשילוב עם RTddPCR, הגישה מאפשרת כימות מוחלט של תמלילים בעותק נמוך, ומקלה על מחקרים של העברת mRNA ותרגום מקומי עם רגישות גבוהה, שחזוריות ויישום ניסויי רחב.

בידוד וכימות של mRNA אקסונליים באמצעות תוספות ממברנה נקבוביות ו-RTddPCR

למד לזהות mRNA ממוקמים באקסונים במוח באמצעות הכלאה באתר ברזולוציה גבוהה בשילוב אימונוהיסטוכימיה. שיטה זו מאפשרת למדעני מוח לחקור ביטוי גנים ותרגום בתאי עצב.

איתור של Axonally המותאם למקום mRNAs בסעיפי מוח באמצעות ברזולוציה גבוהה

גלה סרטונים נוספים