איתור של Axonally המותאם למקום mRNAs בסעיפי מוח באמצעות ברזולוציה גבוהה באתר הכלאה
June 17th, 2015
RNA in situ hybridization (ISH) מאפשר הדמיה של RNA בתאים וברקמות. כאן אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בהצלחה בשילוב של RNAscope ISH עם אימונוהיסטוכימיה או צבעים היסטולוגיים כדי לזהות mRNAs הממוקמים באקסונים בחלקים של מוחות עכברים ובני אדם.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לזהות mRNA מקומיים בטעות בדגימות מוח של מבוגרים. זה מושג על ידי טיפול מקדים. הדגימות על ידי רתיחה ועיכול פרוטאז כדי לחשוף את מולקולות ה-mRNA כשלב שני מתבצעת הכלאה, ואחריה שלבי הגברה וזיהוי, המאפשרים הדמיה של ה-mRNA המעניין.
האקסונים הבאים מוכתמים בנוגדנים או בצבעים על מנת לוודא שה-mRNA המעניין ממוקם באקסונים. התוצאות מראות נוכחות של TF 4 mRNA בדגימות מוח באמצעות הליכי חשיפה ומונים שונים, שיטות צביעה המבוססות על ניתוחי מיקרוסקופיה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות במדעי המוח כגון אילו mRNAs מתורגמים ללא אקסונים.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי סינתזת חלבון תוך-קון, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון דנדריטים ותאים ורקמות לא עצביים שבהם מתרחשת לוקליזציה של mRNA. לאחר תיקון פרוסות המוח, על פי ההוראות בפרוטוקול הכתוב, הכינו צנצנת קופין המכילה 60 מיליליטר תמיסת אחזור אנטיגן וטבלו את השקופיות בתמיסה. לאחר מכן, מלאו ליטר אחד במים מזוקקים והכניסו אותה למיקרוגל כדי לאזן את החום.
בעת ביצוע הסרת המסכה, הכניסו את צנצנת הקופלן המכילה את השקופיות ותמיסת האחזור למיקרוגל. מרתיחים את השקופיות בעוצמה גבוהה במשך חמש דקות. מיד לאחר שהתמיסה הפסיקה לרתוח, מחממים את המגלשות שוב בעוצמה גבוהה למשך חמש דקות נוספות.
הניחו לשקופיות להתקרר בטמפרטורת החדר לאחר הקירור, טבלו את השקופיות בכלי המכיל PBS כדי לשטוף אותן ולאחר מכן חזרו על הכביסה פעמיים נוספות לאחר הכביסה, הניחו את השקופיות על משטח ישר והוסיפו שתיים עד שלוש טיפות או 100 מיקרוליטר של DAP B.Probe לשניים או שלושה חלקי מוח כבקרה. כדי להעריך את צביעת הרקע, הוסף שתיים עד שלוש טיפות של בדיקת המטרה לקטעי הניסוי כדי לזהות את ה-RNA המעניין, נעשה שימוש כאן בבדיקה המכוונת לשאריות 20 עד 1381 של עכבר TF ארבעה RNA. השתמש במלקחיים כדי להניח פרם מעל המגלשות כדי למנוע אידוי בדיקה.
לאחר מכן הניחו את השקופיות בקופסת השקופיות הלחה בתוך תנור ההכלאה ודגרו אותן בחום של 40 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר שחלף זמן הדגירה, שטפו את השקופיות בכלי עם מאגר כביסה אחד למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף שתיים עד שלוש טיפות של מגיב הגברה MP 1 fl לכל פרוסת מוח.
לאחר מכן מכסים בניילון פרה טרי, מניחים בקופסת השקופיות ודוגרים בחום של 40 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בתנור ההכלאה. לאחר שטיפת השקופיות כמו קודם, הוסף שתיים עד שלוש טיפות של מגיב הגברה A MP ארבע fl לכל פרוסת מוח וכסה בפרפיל. דגרו את השקופיות בתיבת השקופיות בחום של 40 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בתנור ההכלאה.
שטפו את השקופיות פעמיים עם מאגר כביסה אחד למשך שתי דקות כל אחת בטמפרטורת החדר. כמו לפני הכביסה האחרונה, מכסים כל פרוסה ב-100 עד 200 מיקרוליטר של תמיסת חסימה המכילה שלושה מיליגרם למיליליטר, BSA 100 מילי-מולרי גליצין ו-0.25% טריטון X 100 ב-PBS, מכסים כל שקופית בפרפורם ודוגרים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לאחר הדגירה, מוסיפים 100 עד 200 מיקרוליטר נוגדנים מדוללים בתמיסת חסימה למגלשות. נוגדן אנטי כולין אצטיל טרנספראז משמש כאן לאחר כיסוי המגלשות בדגירה של פרפיל במשך יומיים בארבע מעלות צלזיוס.
וודאו שפרוסות המוח לא מתייבשות במידת הצורך, מרחו מחדש תמיסת נוגדנים נגד CHATT על פרוסות המוח 24 שעות לאחר הדגירה. לאחר שטיפת השקופיות שלוש פעמים ב-XPBS אחד למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר, הוסף לשקופיות 100 עד 200 מיקרוליטר של הנוגדן המשני המצומד המתאים של Alexa.
מכסים בפראם ודוגרים במשך שעה בטמפרטורת החדר כשהם מוגנים מאור לאחר שחלפה השעה. שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-XPBS אחד למשך חמש דקות כל אחת כמו קודם, ולאחר מכן שטפו פעם אחת במים מזוקקים. הרכיבו את השקופיות עם מדיום הרכבה המכיל DPI ולאחר מכן דמיינו את פרוסות המוח מתחת למיקרוסקופ הקרינה.
לאחר הכנת דגימות מוח אנושיות משובצות פרפין רשמיות וקבועות, על פי ההוראות בחלק הכתוב של הפרוטוקול, בצע חשיפת אנטיגן המושרה בחום על ידי טבילת השקופיות בתמיסה חמה לפני טיפול ורתיחה, למשך 15 דקות. לאחר שטיפה שלוש עד חמש פעמים במים מזוקקים ושלוש עד חמש פעמים באתנול טרי של 100%, הניחו לשקופיות להתייבש במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לבצע חשיפת אנטיגן המושרה על ידי פרוטאז. מוסיפים ארבע טיפות של טיפול מקדים שלוש מכסים בפרפיל ודוגרים למשך 30 דקות בחום של 40 מעלות צלזיוס בתנור ההכלאה לאחר שטיפה שלוש עד חמש פעמים במים מזוקקים.
כמו קודם, הוסף ארבע טיפות של בדיקת DAP B שנקבעה כדי לשלוט בפרוסות המוח כדי להעריך את צביעת הרקע וארבע טיפות של בדיקת המטרה שהוגדרה לחלקי הניסוי. מניחים את זוג השקופיות המכוסות בסרט בקופסת השקופיות ודוגרים במשך שעתיים בחום של 40 מעלות צלזיוס בתנור ההכלאה. לאחר ביצוע השלבים בפרוטוקול הכתוב לפיתוח אות ה-DAB עבור ה-mRNA המעניין, בדוק אם יש אות תחת מיקרוסקופ שדה בהיר.
הגדר אזורי ייחוס בדגימות המוח בהם ניתן לנטר את נוכחות הפונקטה לאורך הליך הכתם הנגדי. כדי להתמודד עם כתמים. ראשית מניחים את המגלשות בכחול מהיר לוקסל שחומם מראש ל-60 מעלות צלזיוס ודוגרים במשך 30 דקות ב-60 מעלות צלזיוס.
לאחר הדגירה יש לשטוף את המגלשות מספר פעמים במים מזוקקים ולאחר מכן לטבול את המגלשות בתמיסת ליתיום קרבונט 0.05% מספר פעמים כדי להתחיל בהתמיינות. לאחר מכן, טבלו את השקופיות פעמיים באתנול טרי 75% ושטפו במים מזוקקים. בדקו את פרוסות המוח תחת מיקרוסקופ שדה בהיר.
שימו לב שחומר אפור ולבן צריכים להתחיל להיות ניתנים להבחנה וגרגירי RNA עדיין נראים כפונקטה כחולה כהה. ודא שהאקסונים מתחילים להופיע כסיבים כחולים בהירים, חוזרים על הליך הצביעה הכחול הלוקסל, מדגרים בכחול לוקסל בצעדים של 10 עד 20 דקות ומנטרים בקפידה את הכתם הנגדי ואת נוכחותם של גרגירי RNA כאשר הושגה צביעה אופטימלית. מניחים את מגלשות השטיפה בתמיסה סגולה קרסטלית ודוגרים במשך 10 דקות לאחר הדגירה.
שוטפים את השקופיות במים מזוקקים. טבלו את המגלשות ב-70% אתנול חמש עד 10 פעמים ולאחר מכן יבשו באמצעות שלושה החלפות מהירות של 100% אתנול במכסה אדים. נקה פרוסות מוח על ידי דגירה פעמיים בקסילן.
סוכן סליקה חלופי למשך שתי דקות ופעם שלישית למשך חמש דקות. בטמפרטורת החדר הרכיבו את פרוסות המוח במדיום הרכבה קבוע מבוסס קסילן ונתחו תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. הדגים בוצעו באמצעות חשיפה המושרה על ידי פרוטאז ואחריה זיהוי נוגדנים של כולין אצטיל טרנספראז המוצג באדום.
הנוגדן לא הצליח לזהות צ'אט כאשר בוצע טיפול בפרוטאז. מוצגות דוגמאות לתוצאות שהושגו עם בדיקה שאינה מטרה ובדיקת מיקוד TF ארבע המשתמשות באותן הגדרות מיקרוסקופ והתאמות תמונה. ATF ירוק ארבעה גרגירים חיוביים עם לוקליזציה אקסונלית לא ברורה מסומנים בסימני שאלה.
אזורים כחולים הם גרעינים מוכתמים כאשר הדגים בוצעו באמצעות אנטיגן המושרה בחום. חשיפת צביעה אימונו-פלואורסצנטית בצ'אט המוצגת שוב באדום הצליחה. ארבעה גרגירים חיוביים של TF הממוקמים לאקסונים נראים כתומים ומסומנים כבסדר בעקבות האקסונים הנגדיים עם לוקסל.
כחול מהיר ו-SOTA עצבי היו מוכתמים נגד עם סגול קרסטלי, לוקסל תת-אופטימלי. כתמים כחולים מהירים יכולים להיגרם אם הטמפרטורה יורדת. כאן הדגימות נצבעו בכחול מהיר לוקסל ב-40 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות.
ארבעה גרגירים חיוביים של TF עם לוקליזציה מקרית לא ברורה מסומנים בסימני שאלה. צביעה לא אופטימלית מתרחשת גם כאשר עוצמת הכתם הנגדי אינה נבדקת לאחר תקופות דגירה קצרות כפי שניתן לראות כאן. דוגמאות לצביעה אופטימלית של LFB בשילוב עם ish באמצעות בדיקה שאינה מטרה או בדיקת מיקוד TF 4 מוצגות כאן.
רכישת התמונה הותאמה אוטומטית ליחס האות לרעש הטוב ביותר. Axon לוקליזציה של TF ארבעה גרגירים מסומנים כבסדר. ברגע ששולטים.
ניתן לבצע טכניקה זו תוך יום עד שלושה ימים בהתאם לשיטת הכתמים הנגדיים שנבחרה לאחר התפתחותה. טכניקה זו סוללת את מדעני המוח לחקור תרגום ולוקליזציה של mRNA בניואנסים.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מחקר זה מדגים את השימוש בהכלאה in situ של RNA (ISH) בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה להדמיית mRNAs באקסונים של רקמות מוח של עכבר ובן אדם. השיטה מאפשרת זיהוי של mRNAs מקומיים, ומספקת תובנות לגבי תפקידם במדעי המוח.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה מולקולרית
- ביטוי גנים
רקע
- הכלאה in situ של RNA (ISH) היא טכניקה להדמיית RNA בתוך תאים.
- הבנת לוקליזציה של mRNA חיונית לחקר ביטוי גנים במוח.
- שילוב של ISH עם אימונוהיסטוכימיה משפר את יכולות הזיהוי.
- גישה זו יכולה לחשוף את התפלגות המרחבית של mRNAs ברקמות עצביות.
מטרת המחקר
- לזהות mRNAs הממוקמים באקסונים בדגימות מוח.
- לחקור את הקשר בין לוקליזציה של mRNA ותרגום בנוירונים.
- לאמת את יעילותם של הליכי חשיפה ושיטות צביעה שונות.
שיטות ששימשו
- טיפול מוקדם בדגימה הכולל הרתחה ועיכול פרוטאז.
- הכלאה של בדיקות RNA ל-mRNAs ממוקדים.
- שלבי הגברה וזיהוי לצורך הדמיה.
- צביעת אקסונים עם נוגדנים או צבעים לצורך אימות.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של TF four mRNA בדגימות מוח.
- הדגמה של הליכי חשיפה שונים המניבים תוצאות עקביות.
- אימות לוקליזציה של mRNA לאקסונים באמצעות ניתוחים מיקרוסקופיים.
- תובנות לגבי תרגום של mRNAs מקומיים במוח.
מסקנות
- השיטה המשולבת של ISH ואימונוהיסטוכימיה יעילה לחקר לוקליזציה של mRNA.
- גישה זו יכולה לעזור לענות על שאלות קריטיות במדעי המוח.
- מחקר נוסף יכול להרחיב את ההבנה של דינמיקה של mRNA ברקמות עצביות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Understanding subcellular mRNA localization in axons provides mechanistic insights into neuronal function, supporting target validation in neurodegenerative disease models. This technique enables direct visualization of low-abundance transcripts in complex tissues, reducing reliance on artificial culture systems. It enhances predictive confidence in preclinical target de-risking by confirming spatial gene expression patterns relevant to axon pathfinding, repair, and neurodegeneration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by confirming axonal mRNA recruitment in vivo.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization of target transcript localization.
- Predictive Value: Strengthens target confidence by linking mRNA localization to axonal function in mature brain tissue.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing mRNA-axon colocalization.
- Quantitative Output: Provides puncta-based readouts amenable to image analysis for screening applications.
- Platform Reuse: Compatible with multiple counterstains (immunohistochemistry, histological dyes) enabling adaptability across target classes.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to models of neurodegeneration where axonal mRNA localization and local translation are implicated.
- Translational Continuity: Bridges discovery findings to preclinical validation by verifying mRNA localization in human and mouse brain sections.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target mechanism by confirming subcellular RNA distribution prior to functional studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, particularly for neuroscience targets involving axonal biology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by determining which mRNAs are localized to axons in intact tissue.
- Screening: Enables assay standardization through reproducible detection of RNA puncta in axonal compartments.
- Analytics: Generates spatial and quantitative mRNA readouts that help compare experimental conditions across brain regions.
- Translational Research: Connects in vitro findings to in vivo relevance by validating localization in mammalian brain sections.
- Enterprise Reuse: Represents a adaptable capability for multiple targets beyond Atf4, supporting broad neuroscience programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity around mRNA function.
- Operational Value: Delivers standardization and reproducibility through standardized unmasking, hybridization, and detection steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct evidence of target engagement in axons.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on confirmed subcellular mRNA localization.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling, immunohistochemistry, and fluorescence microscopy.
- Depends on access to RNAscope ISH reagents, hybridization ovens, and antigen retrieval systems.
- Necessitates standardization across teams for probe design, unmasking conditions, and counterstain optimization.
- Must account for tissue-specific variability in antigen retrieval efficiency between mouse and human samples.
- Limited by the need for optimized counterstaining to avoid obscuring RNA puncta signal.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:26
Heat-Induced Antigen/RNA Unmasking
2:21
Probe Hybridization
4:01
Immunofluorescence Staining
5:42
Diaminobenzidine (DAB)-based Chromogenic ISH Assay Followed by Luxol Fast Blue and Cresyl Violet Stain Using Heat-induced and Protease-induced RNA Unmasking
8:54
Results: Aft4 Localization to Cholinergic Axons in the Mouse Dentate Gyrus and Myelinated Axons in the Adult Hippocampal Formation
10:53
Conclusion
