עכבר דגם של דחיית כלי דם הנוצרת על-Alloimmune וטרשת עורקים להשתלות
17 במאי 2015
אנו מתארים פרוטוקול להשתלת אינטרפוזיציה של אבי העורקים בעכברים. מטרת הפרוטוקול היא לספק מודל שבאמצעותו ניתן לחקור תהליכים פתולוגיים ואסטרטגיות טיפוליות הרלוונטיות לתגובות אלואימוניות בעורקים ולשינויים העורקיים הנובעים מכך התורמים לכישלון השתלת איברים.
המטרה הכללית של הליך זה היא לבצע השתקת מעקף של האביס (aortic interposition grafting) מקצה לקצה בעכברים, לצורך חקר דחייה וסקלרוזיס של עורקים לאחר השתלה. זאת מושג תחילה על ידי קציר של מקטע מהאביס הבטני של העכבר התורם. לאחר מכן, המקטע מושתל באופן אורטוטופי לתוך האביס התוך-כלייתי של מקבל אלוגנאי השונה גנטית מהתורם.
בשלב הסופי, מקטע כלי הדם שהושתל מוצא ומנותח כדי לבחון התפתחות של טרש artery של השתלה (transplant arteriosclerosis). בסופו של דבר, ניתן להעריך את היקף הטרש של השתלה ואת הדחייה הווסקולרית של השתל הכולסטרולי (allograft) המתווכת על ידי מערכת החיסון, באמצעות מדידת העיבוי האינטימלי וההיצרות הלומנלית, וכן באמצעות ניתוח אימונוהיסטוכימי של הרקמה לבדיקת הצטברות של תאי חיסון.
בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בפרוצדורה זו זקוקים לזמן כדי להתרגל לטכניקה המיקרו-כירורגית, כיוון שהשליטה בה דורשת רמה גבוהה של מיומנות ותרגול. עם זאת, השיטה אמורה להיות נגישה לרוב החוקרים באמצעות תרגול חרוץ. לכן, נדגים את הפרוצדורה עם ד"ר וויני, נוירוכירורגית מוכשרת, ואדם רוסו, סטודנט לדוקטורט מוכשר במעבדה שלי. התחילו במיקום עכבר התורם במצב גב (supine) על לוח פלקסיגלס דק ונקי, העטוף בכיסוי סטרילי, תחת מיקרוסקופ ניתוחי בהגדלה של 8.30x.
לאחר אישור השגת הרדמה כירורגית נאותה באמצעות צביטה בבהו, השתמשו במספריים סטריליים כדי לבצע חתך אחד בקו האמצע מהפובס (עצם הח恥) ועד לתהליך ה-ZipID. לאחר מכן, השתמשו במגדיל (retractor) קטן כדי לפתוח את דפנות הבטן ולחשוף את חלל הבטן. לאחר מכן, השתמשו במקלונים סטריליים עם טיפ צמר כדי להסיט בעדינות את המעיים לכיוון עליון ושמאלה של בעל החיים.
כסו את הרקמה בתגגאוסס ספוג במלח פיזיולוגי, והזיזו את איברי הרבייה כלפי מטה כדי לאתר את האאורטה התת-כלייתית ואת הווריד הנבוב התחתון (IVC). כעת השתמשו בפינצטה רפואית מספר 5 כדי להפריד את האאורטה מה-IVC באזור העורק הכליתי השמאלי בקרבת ההסתעפות. לאחר מכן, השתמשו בתפרים מונופילמנטיים מפוליאמיד במידה 10-0 כדי לקשור את הענפים הקטנים בקרבת האאורטה.
לאחר הפרדת האורטה והוריד הנבוב (IVC) של התורם, רווי את כלי הדם במי מלח, כסה את החלל החשוף בגזה לחה והצב את התורם בצד באזור סטרילי. כעת, הנח את העכבר המקבל תחת המיקרוסקופ והפרד את האורטה של המקבל מה-IVC כפי שהודגם. לאחר מכן, הנח שני תסמיכי מיקרו-וסקולריים של 4 מילימטר, פרוקסימלית ודיסטלית למקטע הרלוונטי, במרחק של כ-5 מילימטרים זה מזה.
בשלב הבא, בעזרת מיקרו-מספריים של vanous tube engine, בצעו פתיחה אופקית בודדת של האורטה (aortotomy) והסִירו לא יותר מ-0.5 millimeters של האורטה הבטנית כדי להכניס את השתל האורטלי מהתורם. החזירו את התורם למיקרוסקופ וחתכו סגמנט של השתל באורך של שלושה עד ארבעה millimeters, כפי שהודגם כעת. לאחר מכן, השתמשו במחט 25 gauge בגודל five eight כדי לשטוף את האורטה שהוסרה במי מלח עם הפרין.
הקפידו שקצה המחט לא יבוא במגע עם הכלי, והניחו את הכלי בתוך מיכל של תמיסת מלח עם הפרין על קרח. בתוך 30 דקות מהכרסום, מקמו את השתל העורקי של התורמה במיקום האורתוטופי במקבל, תוך התאמת האוריינטציה האנטומית של השתל לזו של המקבל. לאחר מכן, אחזו בעדינות ב-tunica externa של הכלי והשתמשו בפינצטה מספר חמש כדי להסיטו מעט.
כעת השתמשו בפינצטה כדי להעביר מחט המחוברת לחוט תפר פוליאמיד מונופילמנט במידה 10-0 דרך העובי המלא של דופן כלי הדם, כדי לקבע את השתל האורטלי התורם לכלי הדם שנכרת מהמקבל לצורך ביצוע תפרים רציפים. מקמו תפרי קיבוע (Stay sutures) בשעה תשע, הן בקצה העליון והן בקצה התחתון של השתל. לאחר מכן, התחילו מהקצה העליון של השתל, משעה שלוש, את האנסטומוזיס.
חברו את הקצוות שהוסרו באמצעות שתי תפרים רציפים והדקו את התפר לתפר המייצב. לאחר מכן, הפכו את הש Transplant והמשיכו בתפר הרציף אל החלק הגבי של הכלי, עד להגעה לנקודת המקור.
הקפידו על התפרים. הדקקו את התפר מבלי להפעיל לחץ רב על כלי הדם, וחזרו על פעולת התפירה עבור האנסטומוזה התחתונה. לאחר השלמת האנסטומוזה.
שחררו את התפס המיקרו-וסקולרי הדיסטלי כדי לאפשר זרימת דם רטרוגרדית דרך כלי הדם. אם לא נצפה דימום, שחררו את התפס הפרוקסימלי. אם לא נצפו חסימות דם, השתמשו בפינצטה כדי לתפוס בעדינות קצה אחד של תפרי הקיבוע והסיטו מעט את כלי הדם כדי לבחון את הדופן האחורית של כלי הדם.
אין להבחין בקמטות; אם ניתן לראות תבנית דופק נמרצת הן בכלי התורם והן בכלי המקבל, השתמש במקלונים עם קצה צמר כדי להחזיר את המעיים לחלל הבטן. לבסוף, השתמש במחזיק מחטים ובמלקחי Grof כדי לסגור את דופן הבטן בעזרת תפרים מפוליפרופילן 5/0 בתפירה רצופה. בצע סגירה תת-עורית לסגירת שכבת העור באמצעות אותם תפרים.
ניתן להביט בתפקוד המוטורי של הגפיים האחוריות כדי להעריך את הצלחת הניתוח. כמות הנזק הווסקולרי של השתל האלוגנאי המתוּוך על ידי מערכת החיסון נבדקת באמצעות כימות העיבוי של האינטימה וההיצרות של הלומן במקטעי אאורטה מושתלים ביום ה-30 לאחר הש transplantation.
ואכן, כפי שנצפה, מקטעי העורק של השתולי-הזירה (allograft) מפתחים עיבוי אינטימה משמעותי וחסימה של הלומן, בעוד שבמקטעי העורק של ביקרת השתולי-הסוג (ISO graft) לא נצפו שינויים. יתרה מכך, ניתן להעריך את גיוס הלוקוציטים אל העורק המשתול-זירה על ידי בחינת הצטברותם של תאי T חיוביים ל-CD4 ו-CD8 ומקרופאגים באמצעות אימונוהיסטוכימיה. כצפוי, שלושת סוגי התאים החסוניים זוהו בתוך האינטימה של רקמות העורק התורמות לאחר הפיתוח.
טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום ההשתלות לחקור צמצום כלי דם המתווך על ידי תגובה אלו-אימונית וטרשת עורקים של השתלות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוטוקול להשתקלת אורטית (aortic interposition grafting) בעכברים, שמטרתו לחקור דחייה וסקולרוזיס עורקי של הש transplanted (transplant arteriosclerosis). הפרוצדורה כוללת השתלה של מקטע מהאורטה הבטנית של עכבר תורם אל תוך מקבל אלוגנני, במטרה לנתח את התפתחות הסקולרוזיס העורקי של הש transplanted.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה של השתלות
- ביולוגיה של כלי דם
- אימונולוגיה
רקע
- השתתת אבירת אאורטלית (Aortic interposition grafting) היא מודל לחקר תגובות אלואימוניות.
- טרש arteries של השתלה (Transplant arteriosclerosis) היא סיבה משמעותית לכישלון של השתלות איברים.
- הבנת דחייה וסקולרית ממתווך חיסוני היא קריטית לשיפור תוצאות ההשתלה.
- מודל זה מאפשר להעריך תהליכים פתולוגיים בשתלים.
מטרת המחקר
- לספק מודל לחקר דחייה וסקולרית בהשתלות איברים.
- לנתח את המנגנונים העומדים מאחורי טרשעורקים (arteriosclerosis) של השתלה.
- להעריך אסטרטגיות טיפוליות למניעת כשל של הש Transplant.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- קציר של מקטע מהאורטה הבטנית מעכבר תורם.
- השתלה אורטוטופית של מקטע האורטה אל תוך האורטה האינטרנלית של מקבל השונה גנטית.
- הוצאה של מקטע הכלי המושתל לצורך ניתוח.
- הערכת עיבוי האינטימה והיצרות הלומן באמצעות ניתוח אימונוהיסטוכימי.
תוצאות עיקריות
- מדידה של התעבדות האינטימה והיצרות הלומן בשתלים.
- זיהוי הצטברות של תאי מערכת החיסון ברקמת השתל.
- הערכה של מידת העמלקיה (arteriosclerosis) של השתל.
- תובנות לגבי דחייה וסקולרית של השתל (allograft) המתווכת על ידי מערכת החיסון.
מסקנות
- מודל השתלת השתל העורקי (aortic interposition grafting) יעיל לחקר טרשת עורקים לאחר השתלה.
- הממצאים תורמים להבנת המכניזמים של דחייה כלי דם.
- מודל זה יכול לסייע בפיתוח אסטרטגיות לשיפור שיעורי ההצלחה של השתלות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
דחייה וסקולרית כרונית ואטרסקלרוזיס של הש transplanted נשארים מחסומים עיקריים להצלחה ארוכת טווח של השתתלות איברים, והם מובילים לכשל של הש Transplant בשלבים מאוחרים ולאובדן של מועמדים בתהליך הפיתוח. מודל ההשתלה של אבי העורקים בעכברים המתואר מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית ותיקוף של מטרות לטיפול בפגיעה וסקולרית ממקור חיסוני, ובכך תומך בביטחון חיזוי בבחירת מועמדים בשלב הפרה-קליני. מערכת זו מספקת פלטפורמה רלוונטית מבחינה תרגומית לחקירת נתיבים אלואימוניים ולהערכת אסטרטגיות התערבות בסביבה מבוקרת וניתנת לשחזור.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר תיקוף תפקודי של יעדים חיסוניים המעורבים בדחייה וסקולרוזיס של כלי דם.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי מידול של פגיעה אלואימנית במערכת רלוונטית למחלה.
- מקל על חקירה מונחית-היפותזה של גיוס תאי חיסון ושינוי מבני של כלי דם.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספקת פלטפורמה מאושרת in vivo להערכה כמותית של עיבוי האינטימה והיצרות הלומן.
- מאפשרת מדידה הדירה של חדירת תאי מערכת החיסון באמצעות אימונוהיסטוכימיה.
- תומכת בסטנדרטיזציה של הבדיקה להערכת תרופות מועמדות המכוונות לדחייה וסקולרית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- תואם לפתולוגיה קלינית על ידי שחזור מאפיינים מרכזיים של טרש Arteriosclerosis של השתלה in vivo.
- מאפשר רציפות מגילוי מנגנוני לבדיקת יעילות פרה-קלינית של סוכנים אימונומודולטוריים.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי אספקת תוצאי קריאה ניבואיים של פגיעה בשתל.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
מודל זה מגשר בין שלבי הגילוי המוקדמים לתיקוף הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לבדיקת היפותזות, הפחתת סיכונים של מטרות טיפוליות והערכה כמותית של פגיעה כלי דם במסגרת זרימת עבודה אחת.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בחקירת מנגנונים אלואימוניים ותרומת תאי מערכת החיסון לפתולוגיה וסקולרית.
- סריקה: מספק פלטים כמותיים הניתנים לשחזור עבור עיבוי אינטימה והסננה חיסונית.
- אנליטיקה: מספק קריאות היסטולוגיות ואימונוהיסטוכימיות סטנדרטיות להשוואה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מדמה נקודות סיום רלוונטיות קלינית להערכה של מועמדים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להתאמה לזני עכברים ולהתערבויות שונות עבור יישום רחב של פורט폴יו.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי דחייה כלי דם.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הערכה in vivo של טרשח arteries (arteriosclerosis) של השתלה לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go ומתעדף מועמדים עם הגנה כלית דם מאושרת.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קידום מותאם סיכון והשוואתיות בין תוכניות שונות במחקרי השתלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות והכשרה מתקדמת במיקרו-כירורגיה להקמה עקבית של המודל.
- מחייב גישה לכלים כירורגיים ולתשתית לניתוח היסטולוגי.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של הפרוטוקולים הכירורגיים והאנליטיים.
- ניתן להתאמה לזני עכברים שונים ולהתערבויות ממוקדות למחקרים מכניסטיים.
- התפוקה עשויה להיות מוגבלת בשל המורכבות הטכנית ומיומנות המפעיל.
