Name: בידוד ואפיון של תאי לווין משרירי עכברוש ראש Branchiomeric (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: למדו לבודד תאי לווין משרירי ראש עכברוש ולתרבותם על ג'לי מטריצה חוץ-תאית. שיטה זו מאפשרת מעקב אחרי מיוגנזה וייצור שרירים רב-גרעיניים פונקציונליים ללא צורך בהרחבת תאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי מענק Mosaic (017.009.009) מהארגון ההולנדי למחקר מדעי (NWO) ומענק Start (S-13-167C) לחוקרים צעירים מקרן AO. Z.Y.R נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (מענק # AG021566, AG035377, NS090051).

כל הניסויים המתוארים במסמך זה אושרו על ידי הדירקטוריון המקומי לניסויים בבעלי חיים מRadboud ניימיכן האוניברסיטה בהתאם לחוקים ולתקנות (RU-DEC 2,013-205) הולנדיים. 1. כתמים תאי מטריקס ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים הבאים יום אחד לפני הבידוד: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר ג&#39;ל מטריקס aliquot (100 μl) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 1.5 שעות. לדלל 1:10 ב הבינוני של הנשר שונה Dulbecco; עם 4,500 מ&quot;ג / גלוקוז L, 4 המ&quot;מ L- גלוטמין, ו -110 מ&quot;ג / מיליליטר נתרן פירובט (DMEM). שמור את הג&#39;ל מטריקס על 4 מעלות צלזיוס בכל העת. הערה: שינויי טמפרטורה פתאומיים יגרמו ציפוי אחיד והיווצרות גבישים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את פתרון ג&#39;ל מטריקס המדולל על קרח במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום צמרמורת micropipette 20 μl במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים שקופיות קאמריות 8 היטב לתוך צלחת פטרי 100 מ&quot;מ ולהעביר את הצלחת על גבי משטח קר (לדוגמא חבילת מקפיא) למשך 10 דקות.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש micropipette מראש צונן לשים טיפה של ג&#39;ל מטריקס 10 μl בכל טוב. שמור את צלחת פטרי על פני השטח הקרים לפחות עוד 7 דקות (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר לחלוטין את הג&#39;ל מטריקס הנותר (איור 1), ולייבש את הבארות על 37 מעלות צלזיוס למשך לילה. </li></ol></li></ol> 2. שרירי Dissection של הראש (Masseter, Digastric, וLevator Veli Palatini) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הנתיחה, להכין 50 מיליליטר של פוספט שנאגרו מלוח (PBS) בתוספת 2% פניצילין, סטרפטומיצין (P / S). שמור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המתת חסד של עכברוש אחד צעיר מבוגר (9 שבועות) עם CO 2 / O 2, לערוף את הראש ולהסיר את העור מהראש. העבר את הראש לPBS קר כקרח בתוספת 2% P / S בשפופרת 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שריר המלעס (הנגזר מקשת branchial 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הראש עם צד אחד עד על כרית סיליקון ולתקן עם n המזרקeedles (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את בלוטת הפרוטיד ועצב פנים (איור 2 א). לחשוף את fascia העמוק מכסה את הבלוטה. חותך את fascia ולהסיר את הבלוטה באמצעות מספריים לנתיחה. זהה את תעלת השמע החיצונית. עקוב אחר עצב הפנים מנקב stylomastoid ולהסיר בזהירות את הסניפים זמניים, הזיגומטית, ולחי עם להב מס &#39;15 אזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחרר את הראש השטחי של השריר המלעס ידי הסרת fascia. לזהות ראשי שני שטחיים ועמוקים של השריר המלעס. עקוב אחר הראש השטחי עד אָלָל tendinous העבה שלה הוכנס בתהליך הזיגומטית של הלסת העליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את הגיד ממקורו בתהליך הזיגומטית עם מלקחיים ישר. לחתוך אותו בסכין אזמל מס &#39;15 או מספריים לנתיחה ובזהירות חיים זה (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הראש השטחי של masseter עד כניסתה בזווית וחצי הנחותה של tהוא רוחב פני השטח של Ramus של הלסת התחתונה עם מס &#39;15 להב סכין מנתחים (איור 2 ג). עכשיו, להסיר לחלוטין את השריר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטן אחורית של שריר digastric (הנגזרת מקשת 2 nd branchial) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הראש במצב שכיבה על משטח סיליקון ולתקן עם מזרקים (איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השומן תת עורי שמעל שני sublingual ובלוטות submandibular. בשלב הבא, להסיר את fascia ובלוטות באמצעות מספריים לנתיחה השטחיים. לחשוף את השרירים digastric (קדמית ואחורית בטן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את הגיד הקדמי של הבטן האחורית עם מלקחיים ישר, לחתוך אותו, ולנתח אותו בזהירות עד שמקורו בבולת התוף (איור 3). לעשות את אותו הדבר בצד הנגדי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שריר Levator palatini Veli (הנגזר מקשת branchial 4) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הנתיחה של הבטן האחורית של שריר digastric, למקם את השרירים stylohyoid, למשוך אותו לרוחב, ולהסיר אותו (איור 4 א) בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למקם את הגיד של palatini Veli Levator שמחדיר בבולת התוף (איור 4 א). לנתח את זה בזהירות ולחתוך אותו משני הצדדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חפש את קנה הנשימה והוושט שפועל מאחוריו. הרם את הוושט, ולחשוף את הלוע, הגרון וחיך הרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למקם את האזור של החיך הרך שבי palatini Veli Levator מוכנס ולחתוך אותו רופפים (איור 4). הערה: מייד לאחר נתיחה, להסיר בזהירות גיד ורקמות חיבור מכל שריר מתחת למיקרוסקופ סטריאו. לצלול כל הדגימות במהירות באתנול 70%, ולהעביר אותם לPBS קר כקרח בתוספת 2% P / S בשפופרת 15 מיליליטר. </li></ol></li></ol> 3. בידוד של תאי לווין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את שלבי ההכנה הבאות לבידוד SC מ 3 קבוצות של שרירים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl">הכן 7.5 מיליליטר של pronase 0.1% בDMEM. סנן את הפתרון דרך פילטר 0.22 מיקרומטר. טרום חם הפתרון על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 10 דקות לפני הבידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 35 מיליליטר של DMEM בתוספת 10% על סוסים סרום (HS) ו -1% P / S. טרום חם גם על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 15 מיליליטר מדיום התרבות אשר מורכב DMEM בתוספת 20% בסרום שור עוברי (FBS), 10% HS, 1% P / S ו 1% תמצית עובר עוף (CEE). טרום חם על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שש טפטפות טרום מעיל פלסטיק (10 מיליליטר) עם HS ויבש במשך לפחות 10 דקות לפני השימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשכונה התרבות, להעביר כל שריר לתוך באר של צלחת 6-היטב. שימוש במספריים לנתיחה, לחתוך את השריר בחתיכות קטנות של כ -2 מ&quot;מ. היזהר שלא לקצץ את הרקמה יותר מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להוסיף 2.5 מיליליטר של 0.1% פתרון pronase היטב כל אחד ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות. נער בעדינות את הצלחת אחרי 20, 40, ו -60 דקות. הערה: duratio המדויקn של הדגירה תלויה בגורמים כמו גיל ומתח של בעלי החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג מתחת למיקרוסקופ. בדוק את שברי השריר ולהפסיק את עיכול אנזימטי כאשר חבילות הסיבים לקבל מראה רפוי (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 2.5 מיליליטר של DMEM בתוספת HS 10% ו -1% P / S. העבר לצינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות הצינורות ב 400 XG במשך 5 דקות. בטל supernatant ידי decantation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיליליטר DMEM בתוספת HS 10% ו -1% P / S. פיפטה הפתרון למעלה ולמטה עם פיפטה 10 מיליליטר פלסטיק (טחינה דקה) לפחות 20 פעמים כדי homogenize הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה הצינורות ב XG 200 במשך 4 דקות. לאסוף את supernatant ולהעביר לתוך צינור 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיליליטר DMEM בתוספת HS 10% ו -1% P / S. פיפטה שוב עם טפטפת פלסטיק 10 מיליליטר עד שברי הרקמות עוברת בקלות דרך פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצנטריפוגה הצינורות ב XG 200 במשך 4 דקות ולאסוף את supernatant בצינור 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Put מסננת תא (40 מיקרומטר) על צינור 50 מ&quot;ל ולהעביר את supernatant המכיל את התאים ניתקו על המסנן. לשטוף עם DMEM 1 מיליליטר להתאוששות תא מקסימאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינורות XG ב 1000 עבור 10 דקות וזורקים supernatant עם pipet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה במדיום תרבות 300 μl ולספור את התאים בhemocytometer. </li></ol> 4. התמיינות של תאי לווין בכתמים תאי מטריקס ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את ההשעיה התא להשיג 1.5 x 10 3 תאים ב 10 μl של מדיום התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבטח את הכיסויים של שקופיות תאים עם קלטת ולסמן את הנקודות עם טוש שחור בצד התחתון של זכוכית האובייקט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות micropipette, לשים טיפה של השעיה תא 10 μl על מקום ג&#39;ל מטריקס. בדוק תחת מיקרוסקופ אם הירידה של השעיה תא הושמה כהלכה במקום. דגירה במשך שש שעות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירly להוסיף 400 μl של מדיום התרבות (DMEM בתוספת 20% FBS, 10% HS, 1% P / S CEE ו -1%) ודגירה במשך שלושה ימים על 37 מעלות צלזיוס. הערה: בשלב זה, SC מבודד טרי חשופים לטראומה מסיבית (תקציר האנזימטית וטחינה דקה קשה) והם צריכים להתאושש. נא לא להפריע לתאים במהלך שלושת הימים הראשונים 37. בשלב הבא, מדיום התרבות יכול להיות שונה בהתאם לסוג של ניסוי. ניתן נזרעו כתמי מטריקס ג&#39;ל עם צפיפות גבוהה של תאים (1.5-2.5 x 10 3/20 μl) עבור assay בידול. תרבות בינונית (DMEM בתוספת 20% FBS, 10% HS, 1% P / S ו 1% תמצית עובר עוף) יכול להיות מוחלף בכל יום שלישי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, אם הרחבה וחולפת היא רצויה לבצע את השלבים הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר ג&#39;ל מטריקס aliquot (500 μl) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 1.5 שעות. לדלל 1:10 ב DMEM ולבצע את ההמלצות בנקודה 1.1.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום צמרמורת פיפטה 10 מיליליטר במשך 10 דקות ב 4 ו# 176; ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את שלוש צלוחיות T75 על גבי משטח קר (לדוגמא חבילת מקפיא) למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה מראש צונן לשים 1 מיליליטר ג&#39;ל מטריקס לכל בקבוק. בדוק שהשטח מכוסה לחלוטין. שמור את צלוחיות על פני השטח הקרים לפחות עוד 7 דקות (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר לחלוטין את הג&#39;ל מטריקס נותר עם פיפטה 10 מיליליטר, ולייבש את הבארות על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הספירה, resuspend SCS המבודדים הטרי ב 10 מיליליטר של מדיום תרבות (DMEM בתוספת 20% FBS, 10% HS, 1% P / S ו 1% תמצית עובר עוף) וזרע בצלוחיות T75 מצופה מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שלושה ימים, לשנות הבינוני (ובכל יום שלישי) עד מפגש 80% הוא הגיע. לpassaging, לשטוף את צלוחיות T75 שלוש פעמים עם PBS. הבא להוסיף 1 מיליליטר 0.25% פתרון טריפסין ודגירה של שלוש דקות על 37 מעלות צלזיוס. גלול ב9 מיליליטר של מדיום התרבות (DMEM בתוספת 20% FBS, 10% HS, 1% P / Sו 1% תמצית עובר עוף) וצנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות. בטל supernatant. לאחר הספירה, resuspend 1 x 10 6 תאים ב1,000 μl של מדיום התרבות ולהקפיא את התאים. </li></ol></li></ol>

למחברים אין אינטרסים סותרים לחשוף.

SCs משרירי ראש מסועפים שונים בודדו מחולדת וויסטאר אחת בת 9 שבועות ותרבית ישירות על כתמי ג'ל מטריקס חוץ-תאיים ללא התרחבות ומעבר מוקדמים. לאחר הבידוד, התאים נספרו ונזרעו באותה צפיפות תאים. לבידוד מקביל של שלושה שרירים שונים, שיטה זו אורכת כ -4 שעות. כדי למנוע זיהום תרבית, שלב קריטי הוא שטיפה מהירה באלכוהול 70% לאחר דיסקציה של השרירים.
במהלך בידוד SC חשוב לחתוך את רקמת השריר לחתיכות קטנות (כ-2 מ"מ) אך להימנע מטחינה רבה מדי מכיוון שהדבר יגרום לתפוקת תאים קטנה בגלל נזק לתאים. כמו כן, יש לבדוק היטב את משך העיכול האנזימטי תחת המיקרוסקופ כדי למנוע נזק נוסף. מטרת העיכול היא לנתק את סיבי השריר. מכיוון שיותר מ-90% מהתאים המבודדים מבטאים Pax7, אין צורך בטיהור נוסף (איורים 6-8). זה מונע שלבי טיהור נוספים בשיטות אחרות כגון ציפוי מראש על כלים לא מצופים14,37,38, פיצול על פרקול39,40, או מיון תאים פלואורסצנטיים או מגנטיים41,43. לצורך טריטורציה חיוני לגרום לגזירה בין שברי הרקמה לפתיחת קצה הפיפטה מכיוון שהדבר מאפשר שחרור מכני של ה-SCs. אם הטריטורציה עם פיפטה של 10 מ"ל (קצה קוטר פנימי: 1 מ"מ) קשה, ניתן להשתמש תחילה בפיפטה של 5 מ"ל (קצה קוטר פנימי: 2 מ"מ). לחלופין, ניתן לחתוך פיפטות פסטר מזכוכית בקוטר הרצוי ולהשתמש בהן. שיטה זו פשוטה, יעילה ומאפשרת בידוד בו זמנית של SC מדגימות שרירים שונות.
ניתן גם לצפות את לוחות התרבית של SCs בג'לטין או קולגן, אך המחקרים הקודמים שלנו מראים שג'ל מטריצה חוץ-תאית טוב בהרבה לשמירה על הפוטנציאל המיוגני מאשר קולגן38. כתמי הג'ל החוץ-תאיים בגודל מילימטר (10 μl/Ø 2 מ"מ או 20 μl/Ø 4 מ"מ) מאפשרים לחקור התפשטות והתמיינות של SCs עם מספר מוגבל של תאים. לצורך בדיקת ההתמיינות נדרשים בערך פי 8 עד 20 פחות תאים בהשוואה לצלחת של 24 בארות (Ø 15.6 מ"מ), וכ-80 עד פי 200 פחות בהשוואה לצלחות פטרי של 35 מ"מ (Ø 35 מ"מ)14,38.
מכיוון שג'ל מטריקס חוץ-תאי הוא יקר, שיטה זו גם חסכונית יותר. בנוסף, ניתן להחליף את מגלשות החדר בהחלקות כיסוי מפלסטיק כדי להפחית עוד יותר את העלויות. להכנת כתמי הג'ל של המטריצה החוץ-תאית ייבוש לילה של מגלשות החדר הוא חיוני. מכיוון שכתמי הג'ל החוץ-תאיים של המטריצה שקופים, יש צורך לסמן את הכתמים בצד התחתון באמצעות תאורה אחורית. מגלשות התאים מקובעות בצלחת פטרי למניפולציה קלה. אין צורך בהרחבה נוספת של תרבית תאים, מה שמציע אפשרות לחקור את ה-SCs של שרירים קטנים יותר או דגימות שרירים קטנות. לחלופין, למשל עבור PCR או מבני שריר אם יש צורך בתאים נוספים, ניתן להרחיב תחילה את ה-SCs המבודדים הטריים בצלוחיות T75 כפי שצוין לעיל.
SCs שבודדו באמצעות פרוטוקול זה אינם מתאימים לטיהור נוסף עם ציטומטריית זרימה מיד לאחר הבידוד. העיכול עם פרונאז גורם לעיכול נרחב של אנטיגנים פני השטח14. יש לאפיין תחילה כראוי סרום סוסים וסרום בקר עוברי המשמשים לתרבית תאים לפני הבידוד, מכיוון שמספרי אצווה שונים השפיעו באופן דיפרנציאלי על התפשטות והתמיינות המיובלסטים.
בשנים האחרונות גובר העניין בשרירים שמקורם בקשתות המסועפות ובמזודרם הראש (למשל השרירים החוץ-עיניים)24. הוכח בבירור כי לשרירי הראש והגפיים יש תכונות שונות מאוד. נראה כי שרירי המעסה מבעלי חיים זקנים שומרים על יכולת ההתחדשות שלהם בהשוואה לשרירי הגפיים25,26. ל-SCs מהשרירים החוץ-עיניים יש יכולת התפשטות והתמיינות חזקה הדומה ל-SCs משרירי הראש, ומראים פוטנציאל חריטה גדול יותר מאשר SCs של שרירי הגפיים24.
התפלגות סוג הסיבים והרכב המיוזין משתנים בין קבוצות שרירים וגם בין מינים. שרירים שמקורם בקשת הענפים הראשונה בבני אדם מכילים סיבים איטיים ומהירים (תת-סוגים IIA ו- IIX), מיוזינים יילודים ומיוזינים האופייניים להתפתחות שריר הלב. במכרסמים שרירים אלה מכילים כ -95% סיבים מהירים מיוזין IIA ו- IIb) 44-46. מחקרים על שרירי עופות מראים כי SCs מסוגי סיבי שריר שונים משתנים ביכולת ההתמיינות. SCs מסיבים מהירים מתמיינים רק לסיבי שריר מהירים, בעוד SCs מסיבים איטיים יכולים להתמיין לשני סוגי הסיבים47. בנוסף, אחוז ה-SCs בסיבי שריר מהירים נמוך יותר מאשר בסיבי שריר איטיים48,49. זה מצביע על כך שיש לקחת בחשבון את התפלגות סוג הסיבים למחקרים על שרירים באזור הגולגולת. בדומה לשרירי חיך שסועים, ה- LVP במכרסמים מכיל כמעט אך ורק סיבים מהירים50. מסיבה זו, SCs מה-LVP מתאימים למחקרים פרה-קליניים בתחום החך השסוע.
פרוטוקול זה מציע אפשרויות חדשות לחקר SCs שמקורם בשרירי ראש מסועפים או שרירים קטנים אחרים או דגימות שרירים קטנות יותר. זה יקל על פיתוח טיפולים חדשים לשיפור התחדשות השרירים באזור הלסתות במצבים כמו חיך שסוע אך גם במצבים אחרים המשפיעים על שרירים קטנים יותר.

An erratum was issue for <a href="http://www.jove.com/video/52802">Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles</a>. The fourth figure was updated to explain the isolation of the LVP better.

Erratum: Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

על 1: 500 עד 1: 1000 תינוקות תערוכה שסועים מעורבים השפה ו / או חיך (CLP); כך זה מום המולד הנפוץ ביותר בבני האדם 1. השרירים של החיך הרך הם קריטיים לתפקודו של החיך הרך בדיבור, בליעה, ומציצה. אם שסוע של החיך הרך הוא הווה, שרירים אלה מוכנסים באופן חריג לקצה האחורי של עצם החיך. החיך הרך נע מעלה ומטה במהלך נאום, מניעת אוויר לברוח דרך האף. ילדים עם שסע בחיך אין לי פונקצית שליטה זו וכתוצאה מכך תופעה הידועה בתפקוד velopharyngeal 2,3. למרות שפרוטוקולי הטיפול משתנים, התיקון ניתוחי של החיך הרך מתרחש בילדות המוקדמת (6-36 חודשים של גיל) 4. השרירים מוכנסים באופן חריג של החיך הרך ניתן לתקן בניתוח 5-7, לעומת זאת, תפקוד לקוי של velopharyngeal נמשך ב -7% עד 30%של החולים 2,3,8-10. יכולתו של שריר שלד להתחדש דרך הפעולה של תאי לווין (SCS) היא מבוססת היטב 11,12. על פגיעה בשרירים, מאמנים מופעלים ולעבור לאתר של פציעה. לאחר מכן הם מתרבים, להבדיל, ולמזג ליצירת myofibers החדש או אלה תיקון פגום 13. מאמנים רגיעה להביע גורם שעתוק Pax7 14,15, בעוד צאצאיהם, myoblasts מתרבים, גם להביע גורם myogenic נחישות 1 (Myod) 16. myoblasts ההבחנה להתחיל להביע myogenin (MyoG) 17. בידול המסוף של myoblasts מסומן על ידי ההיווצרות של myofibers, והביטוי של חלבוני שריר ספציפי כגון שרשרת שרירן כבדה (MyHC) 16,18. לאחרונה, מספר אסטרטגיות כבר בשימוש ברפואת רגנרטיבית לשפר התחדשות שריר של שרירי גפיים 19-23. מחקרים ספציפיים עלשרירי ראש branchiomeric חשובים גם משום שהוא הוכיח לאחרונה כי הם שונים משרירים אחרים בכמה היבטים 24. בניגוד לשרירי גפיים, זה כבר הציע שרירי ראש branchiomeric מכילים פחות SCS 25, להתחדש איטי יותר, ורקמת חיבור סיבית יותר נוצר לאחר פציעת 26 בנוסף, מתרבות מאמנים משרירי ראש branchiomeric גם להביע את גורמי שעתוק אחרים. לדוגמא, Tcf21, גורם שעתוק לבניית שריר craniofacial בחום לידי ביטוי בהתחדשות שרירי ראש אבל לא בהתחדשות שרירי גפיים 25. השרירים בחיך הרך של חולי CLP הם בדרך כלל קטנים ומאורגן היטב פחות בהשוואה לשרירי חיך רגיל 27,28. סיבים איטיים ומהירים גם נמצאים בשרירי החיך הרכים אבל הסיבים איטיים הם שופעים יותר. לעומת זאת, שרירים שסועים מכילים שיעור גבוה יותר של סיבים מהירים וגם אספקת נימים מופחתתלעומת שרירי חיך רכים נורמלים 29-31. סיבים מהיר נוטים יותר לפגיעה הנגרמת על-התכווצות 31-33. אספקת נימי עניים הנלווית עשויה גם לקדם סיסטיק 34,35. כל ההיבטים הללו עשויים לתרום לעניי ההתחדשות של שרירי חיך רכים לאחר סגירה שסועה כירורגית 36. לאור זאת, פרוטוקול לבידוד והאפיון של שריר ראש branchiomeric SCS הוא חיוני. זה מספק את האפשרות ללמוד ביולוגיה SC של שרירי ראש branchiomeric. בנוסף, ניתן לפתח טיפולים חדשים המבוססים על הנדסת רקמות לקידום התחדשות שריר לאחר הניתוח בCLP ותנאים אחרים להתפשר אזור craniofacial. באופן כללי, ניתן לקבל SCS לאחר הניתוק של רקמת שריר 14. ממינסינג, עיכול אנזימטי, וטחינה הדקה נדרשים בדרך כלל כדי לשחרר מאמנים מהנישה שלהם. יכול להיות מטוהר SCS ידי מראש ציפוי על מנות ללא ציפוי 14,37,38, fractionation על Percoll 39,40, תא או ניאון או מגנטי מיון 41-43. כאן אנו מציגים פרוטוקול כלכלי ומהיר חדש לבידוד של תאי לווין משרירי ראש branchiomeric של חולדות מבוגרות צעירות. פרוטוקול זה מבוסס על כתב יד קודמת 14 ומותאם ספציפית לדגימות רקמה קטנות. הבידוד של מאמנים משרירי נציג מקורם -1, 2 nd, ו -4 קשתות branchial ה מתואר. לאחר בידוד, מספרים נמוכים של תאי לווין בתרבית על כתמי ג&#39;ל מטריקס בגודל מילימטר ללמוד הבידול שלהם. גישה זו תמנע את הדרישה להרחבה וpassaging של מאמנים.

<table><tbody><tr><td>מחט היפודרמית 25&nbsp; G 0.5&nbsp; x&nbsp; 25&nbsp; m</td><td>BD Microlance</td><td>300400</td><td></td></tr><tr><td>מספריים לניתוח</td><td>בראון</td><td>BC154R</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו מלקחיים ישר</td><td>בראון</td><td>BD330R</td><td></td></tr><tr><td>להב אזמל כירורגי מס'&nbsp; 15</td><td>Swann-Morton</td><td>0205</td><td></td></tr><tr><td>אלכוהול 70%</td> <td>Denteck</td><td>2,010,005</td><td></td></tr><tr><td>Permanox Slide, 8 Chamber</td><td>Thermo Scientific</td><td>177445</td><td></td></tr><tr><td>6 באר צלחת תרבית תאים</td><td>Greiner bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>כלי תרבית תאים (100 x 20 מ"מ)</td> <td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי</td><td>BD Biosciences</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי 50 מ"ל</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים (40 &mu; מ)</td> <td>גיבקו</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל פיפטה סרולוגית</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>20&nbsp; ומיקרו; l FT20</td><td>Greiner bio-one</td><td>774288</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, ללא פנול-אדום</td><td>BD Biosciences</td><td>356237</td><td>10 מ"ל</td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Calbiochem</td><td>53702</td><td>10&nbsp; KU</td></tr><tr><td>פוספט בופר</td><td>מלח Gibco</td><td>14190-144</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium, גלוקוז גבוה, תוסף GlutaMAX, פירובאט&nbsp;</td><td>ג'יבקו</td><td>10569-010</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי&nbsp; &nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>3600511</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>סרום סוסים</td><td>גיבקו</td><td>26050088</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)</td><td>גיבקו</td><td>15140-122</td><td>100 מ"ל</td></tr><tr><td>תמצית עוברי עוף</td><td>MP ביומדיקל</td><td>2850145</td><td>20 מ"ל</td></tr></tbody></table>

בידוד ואפיון של תאי לווין משרירי עכברוש ראש branchiomeric

Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

פיברוזיס והתחדשות שרירים פגומה עלולים לפגוע בהתאוששות התפקודית של שרירי החך הרך לאחר תיקון חיך שסוע. זה גורם לבעיות מתמשכות בדיבור, בבליעה וביניקה. מערכות תרבית חוץ גופית המאפשרות חקר תאי לוויין (תאי גזע מיוגניים) משרירי הראש חיוניות לפיתוח טיפולים חדשים המבוססים על הנדסת רקמות לקידום התחדשות השרירים לאחר ניתוח. מערכות אלו יציעו נקודות מבט חדשות לטיפול בחולי חיך שסוע. מוצג פרוטוקול לבידוד, תרבית והתמיינות של תאי לוויין משרירי הראש. הבידוד מבוסס על עיכול אנזימטי וטריטורציה לשחרור תאי הלוויין. בנוסף, פרוטוקול זה כולל שיטה חדשנית המשתמשת בציפויי ג'ל מטריצה חוץ-תאיים בגודל מילימטר, הדורש רק מספר נמוך של תאי לוויין לבדיקות התמיינות.

באמצעות פרוטוקול זה, שריר המאסטר (צד אחד) מניב 0.8-1 x 106 תאים, שריר הדיגסטריק (הבטן האחורית) מניב 1.5-2 x 105 תאים, ושריר ה-levator veli palatini מניב 1-1.5 x 105 תאים. תנובת התאים תלויה בסוג השריר, בזן ובגיל בעל החיים. לצורך השוואה בין שלוש קבוצות השרירים, תאי SC שבודדו באופן טרי זרעו בצפיפות תאים זהה (1.5 x 103/10 µl). מיד לאחר הבידוד, יותר מ-90% מהתאים שבודדו באופן טרי מבטאים Pax7 (איור 6).
תרביות מהימים 4, 7 ו-10 נצבעו בנוגדנים נגד Pax7, MyoD, MyoG ו-MyHC באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית. חמישה שדות אקראיים נספרו לכל תרבית באמצעות עדשה של 20X. ביום 4, Pax7 ו-MyoD מובעים בכל קבוצות השרירים (איורים 6, 7 ו-8), עם זאת, צאצאי תאי ה-SatCs משרירי המאסטר (masseter) והדיגסטריק (digastric) מתחילים להביע מיוגנין (myogenin) מוקדם יותר מאשר שריר ה-levator veli palatini (איור 9). ביום 10, הביטוי של MyoG מופחת באופן משמעותי בכל הקבוצות (איור 9). מספר ימים לאחר הזריעה על נקודות ג'ל של מטריצה חוץ-תאית, התאים הפרוליפרטיביים מתחילים להתמזג וליצור שפורי שריר (myotubes) רב-גרעיניים, המביעים שרשרת כבדה של מיוזין (myosin heavy chain). שפורי שריר קטנים נראים בבירור ביום 7 (איור 10). ביום 10, ניתן להבחין בהתכווצויות של שפורי השריר (סרטון 1).
<img alt="הסדרה של ניסוי שיווי משקל סטטי עם צלחוני פטרי על שולחן מעבדה; חקר התפלגות משקל." src="/files/ftp_upload/52802/52802fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="איור 1"> 
איור 1: נקודות ג'ל של מטריקס חוץ-תאית בתוך שקופית תאים עם תאיים. (A) לצורך מניפולציה קלה, הניחו את שקופית התאים בעלת 8 התאים בתוך צלחן פטרי של 100 mm. העבירו באמצעות פיפטה 10 µl של ג'ל מטריקס חוץ-תאית לכל תא והניחו אותה על משטח קר (7 min). (B) שקופית תאים לאחר הסרת עודפי הג'ל של המטריקס החוץ-תאית.
<img alt="עצבוב מוטורי של שרירי הפנים בחזיר; דיאגרמה מתויגת; מחקר מדעי על מסלולים עצביים." src="/files/ftp_upload/52802/52802fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="איור 2"> 
איור 2: נתיחה של שריר הלעיסה (masseter muscle). (A) ראש החיה במבט צדי. אוזן (E), בלוטת הפארוטיד (P) ועצב הפנים (VII). (B) אפונורוזיס גידית (Te) של הראש השטחי של שריר הלעיסה (Ms) ושריר הרקה (T). הפרד את הגיד ממקום היצמדותו באמצעות פינצטה. (C) נתח בזהירות את השריר עד למקום היצמדותו בענף הלסת התחתונה (ramus of the mandible). E: אוזן, P: בלוטת הפארוטיד, VII: עצב הפנים, T: שריר הרקה, Ms: ראש שטחי של שריר הלעיסה, Te: גיד, Mp: ראש עמוק של שריר הלעיסה.
<img alt="תרשים אנטומיה של עכבר המראה את מיקומי הבלוטות והמבנה השרירי." src="/files/ftp_upload/52802/52802fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="איור 3"> 
איור 3: נתיחה של הבטן האחורית של השריר הדו-בטני (digastric muscle). (A) ראש החיה במצב שכיבה על הגב. איתור בלוטת תת-הלסת (Sg), שריר הלעיסה (M), העצב הפקיאלי (VII) ושריר הסטרנוקליידומסטואיד (SCM). הסרת בלוטת תת-הלסת. (B) איתור הבטן הקדמית (AD) והבטן האחורית (PD) של השריר הדו-בטני. באמצעות פינצטה ישרה, תפסו את הגיד הקדמי של הבטן האחורית, חתכו אותו ונתחו אותו בזהירות עד למקורו בבועה התימפנית (ty). E: אוזן, Sg: בלוטת תת-הלסת, VII: העצב הפקיאלי, M: שריר הלעיסה, SMC: שריר הסטרנוקליידומסטואיד, AD: הבטן הקדמית של השריר הדו-בטני, PD: הבטן האחורית של השריר הדו-בטני, Ty: בועה תימפנית.
<img src="/files/ftp_upload/52802/52802fig4new.jpg" align="Figure 4" alt="ניתוח של בלוניות הרוק של זבוב הפירות, הדיאגרמה מראה מיקומים אנטומיים, תוויות ומנתס." data-altupdatedat="1787630408000"> איור 4: ניתוח של שריר ה-levator veli palatini. (A) מבט כללי לאחר ניתוח של השריר הדיגסטרי (הבטן האחורית). ניתן לאתר את שריר ה-stylohyoid (St) ואת הגיד של ה-levator veli palatini. שימו לב לקנה הנשימה (T) ולוח הגרון (Es) העוברים מאחוריו. (B) לאחר הרמת קנה הנשימה ולוח הגרון, נחשף הלעייתון (P). שריר ה-levator veli palatini העובר לצד לכיוון החך הרך נראה כעת. החץ מצביע על שריר ה-superior pharyngeal constrictor המנותח; שימו לב לשרירי ה-levator veli palatini בשני הצדדים. E: אוזן, St: שריר stylohyoid, VII: עצב הפנים, M: שריר masseter, AD: הבטן הקדמית של השריר הדיגסטרי, PD: הבטן האחורית של השריר הדיגסטרי, T: קנה נשימה, Es: לוח גרון, P: לעייתון, *שריר levator veli palatini.
<img alt="תמונת מיקרוסקופ היסטולוגית; תצפית על דגימת רקמה; שני חתכים מסומנים, A ו-B." src="/files/ftp_upload/52802/52802fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="איור 5"> 
איור 5: מראה של רקמת השריר (A) לפני ו-(B) אחרי עיכול אנזימטי באמצעות pronase. שימו לב שצרורות השריר נראים משוחררים לאחר העיכול האנזימטי.
<img alt="מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, סימון DAPI Pax7, ויזואליזציה של גרעיני תאים, תמונת אימונופלואורסצנציה." src="/files/ftp_upload/52802/52802fig6highres.jpg" width="350" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="איור 6"> 
איור 6: צביעה אימונוהיסטוכימית ל-Pax 7. תאי SC שבודדו לאחרונה והועברו לג'ל של מטריצה חוץ-תאית בסיום הבידוד (כ-6 שעות לאחר עיכול הרקמה הראשוני). חמישה שדות שרירותיים נספרו באמצעות עדשה של 10X, עם ממוצע של 210 תאים לשדה. כ-90% מהתאים הם Pax 7 חיוביים. DAPI: כחול, Pax7: אדום. סרגל קנה מידה, 100 µm.
<img alt="Fluorescent microscopy and bar charts showing Pax7, MyoD cell differentiation on Day 4, Day 7." src="/files/ftp_upload/52802/52802fig7highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 7"> 
איור 7: צביעה אימונוהיסטוכימית של Pax 7 ו-MyoD. תרבויות מימים 4, 7 ו-10 נצבעו בנוגדנים נגד Pax7 ובסמימה של MyoD.A–C) ו- (ד'–F) פוטומיקרוגרפיות מייצגות של תרביות מהיום ה-4 וה-7 משריר הלעיסה (masseter). (G ו- Hמספר תאי ה-Pax7+ ו-MyoD+ מספר הגרעינים לכל שדה מיקרוסקופי נספר והובע כאחוז ממספר הגרעינים הכולל (DAPI). DAPI: כחול, Pax7: אדום, ו-MyoD: ירוק. סרגל קנה מידה, 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig7highres.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="תרשים עמודות של דיפרנציאציה של תאי שריר בשרירי ה-masseter, ה-digastric וה-levator veli palatini; טבלת נתונים." src="/files/ftp_upload/52802/52802fig8highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="איור 8"> 
איור 8: התפלגות של Pax7±/MyoD± בתרביות של תאים חד-גרעיים משרירי ה-masseter, ה-digastric וה-levator veli palatine. (A–C) תרביות מימים 4, 7 ו-10 נצבעו בנוגדנים נגד Pax7, ובצביעה אימונוהיסטוכימית של MyoD. מספר התאים הכולל מבוסס על מספר הגרעינים הכולל (DAPI). (D) כימות נתונים של תאי Pax7±/MyoD±. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig8highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של DAPI ו-MyoG ביום 4, יום 7; גרף וטבלה של אחוז תאי MyoG+." src="/files/ftp_upload/52802/52802fig9highres.jpg" width="700" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="איור 9"> 
איור 9: צביעה אימונוהיסטוכימית של Myogenin. תרביתי ימים 4, 7 ו-10 נצבעו בנוגדנים נגד Myogenin. (A–D) מיקרוגרפיהים מייצגים של תרביתי ימים 4 ו-7 משריר ה-levator veli palatine. (E) מספר גרעיני MyoG+ לכל שדה מיקרוסקופי נספר והוצג כאחוז ממספר הגרעינים הכולל (DAPI). (F) כימות נתונים של תאי MyoG+. DAPI: כחול, Myogenin: ירוק. סרגל קנה מידה, 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig9highres.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה מוגדלת של איור זה.</a>
<img alt="מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של בידול תאים שצבעו ב-DAPI המראה ביטוי של MyHC בימים 4, 7, 10." src="/files/ftp_upload/52802/52802fig10.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="איור 10"> 
איור 10: צביעה אימונוהיסטוכימית של Myosin Heavy Chain. תרביות מהימים 4, 7 ו-10 נצבעו בנוגדנים נגד myosin heavy chain (MyHC). מיקרוגרפיות מייצגות של תרביות מהימים 4, 7 ו-10 מהשריר הדיגסטריקי (DIG). ביום 7 נראים Myotubes קטנים, בעוד שביום 10 נראים Myotubes ארוכים ומאורגנים היטב. סרגל קנה מידה, 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig10large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
סרטון 1: התכווצות (twitching) של מיבטובים. מוצגים שני שדות מייצגים של מיבטובים מתכווצים עבור תרביות ביום 10 משריר הדיגסטריק (digastric muscle). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/Video1.mpg" target="_blank">אנא לחצו כאן לצפייה בסרטון זה.</a>

פרוטוקול זה מתאר בידוד של תאי לוויין משרירי ראש מסועפים של חולדה בת 9 שבועות. מקורם של השרירים בקשתות ענפיות שונות. לאחר מכן, תאי הלוויין מתורבתים על ציפוי נקודתי בגודל מילימטר כדי לחקור את ההתמיינות שלהם. גישה זו מונעת התרחבות ומעבר של תאי לוויין.

בידוד ואפיון של תאי לווין משרירי עכברוש ראש Branchiomeric

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד תאי לוויין משרירים מייצגים שמקורם בקשתות הזרוע הראשונה, השנייה והרביעית לצורך גידולם על מטריצה חוץ-תאית. נקודות ג'ל. דבר זה מושג תחילה על ידי נתיחה של שרירי ה-masseter, ה-digastric וה-levator veli palatini של חולדה בוגרת צעירה.בשלב השני, תאי לוויין מכל דגימת שריר מבודלים באמצעות עיכול אנזימטי וזמן חיתוך. לאחר מכן, התאים מרובים על ג'לים של מטריצה חוץ-תאית. לבסוף, ניתן לעקוב אחר המצב הדינמי של המיוגנזה בתרביות תאי הלוויין באמצעות צביעה לסמני שריר רלוונטיים.שפה וחך שסועים הם אחת המומים הקרניו-פציאליים השכיחים ביותר בבני אדם. כאשר קיים שסע, נדרש תיקון כירורגי על מנת לסגור את הפגם ולאפשר התפתחות נורמלית של הדיבור. עם זאת, פיברוזיס והתחדשות שרירית לקויה עלולים לעכב את ההחלמה התפקודית של שרירי החך הרך. לאחר תיקון של חך שסוע, ניתן להדגים שיטה חדשנית לתרבית של תאי לוויין (satellite cells) שבודדו acabado, באמצעות ציפויי נקודות של ג'ל מטריצה חוץ-תאית בגודל של מילימטרים בודדים בלבד.פעולה זו מונעת את הצורך בהרחבה. יום אחד לפני הבידוד, הניחו למשטיות עם תאי בידוד בעלות שמונה בארות בתוך צלחת פטרי של 100 מילימטר והעבירו את הצלחת למשטח קר. לאחר 10 דקות, השתמשו במיקרופיפט מומלא מראש כדי להטפטף טיפה בודדת של 10 microliter של ג'ל מטריצה חוץ-תאית לתוך כל בארה.לאחר קירור השקופיות למשך שבע דקות נוספות, הסר לחלוטין את שאריות הג'ל וייבש את הבארות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך הלילה. כדי לבצע נתיקה של שריר הלעיסה, הסר את העור מהראש של חולדה בת תשעה שבועות והשתמש במחטים היפודרמיות כדי לקבע את הראש על צדו. על גבי פד סיליקון, בודד את בלוטת הפרוטיד ואת עצב הפנים והסר את הבלוטה.בשלב הבא, בעזרת להב סקלפל מספר 15, הסר בזהירות את העצב הפציאלי. זהה את הראש השטחי של שריר ה-masseter. לאחר מכן, השתמש בפינצטה ישרה כדי להפריד את הגיד מנקודת מוצאו ב-zygomatic process, ולאחר מכן גזור בזהירות את הגיד באמצעות מספרי דיסקציה.באמצעות הסקלפל, נבצע דיסקציה של הראש השטחי של שריר המסטריקציה (masseter) עד לנקודת ההחדרה שלו בזווית ובחצי התחתון של המשטח הלטרלי של ענף הלסת התחתונה (ramus of the mandible). כדי לבצע דיסקציה של הבטן האחורית של השריר הדיגסטרי (digastric muscle), נקבע את הראש במנח גב (supine position) באמצעות מחטים ונסיר את השומן התת-עורי המכסה את בלוטות התת-לשונית והתת-לסתרית. נחשוף את הבטנים הקדמית והאחורית של השריר הדיגסטרי, ולאחר מכן, תוך החזקת הגיד הקדמי של הבטן האחורית באמצעות פינצטה ישרה, נבצע חיתוך ודיסקציה זהירה של הגיד עד למקורו בבועה הטימפנית (tympanic bulla).כדי לנצח את שריר ה-levada vli palatino, אתרו את שריר ה-stylo halloid. משכו אותו לצד והסירו בזהירות את רקמת השריר. לאחר מכן, אתרו את הגיד של ה-levada vli palatino הנכנס ל-tympanic buller ונצחו אותו בזהירות.לאחר מכן, הרים את הוושט מאחורי הקנה. זהה את אזור החיך הרך שבו מוחדר ה-levada vli palate וחתור את השריר כדי לשחררו. לאחר מכן, טבול את השריר ב-70% ethanol והעבר אותו ל-PBS קר בקרח בתוספת אנטיביוטיקה.על מנת לבודד את תאי הלוויין (satellite cells), העבירו כל שריר לבארים נפרדות בפלטה של שש בארות, וחתכו את הרקמות לחתיכות קטנות של 2 mm. יש להקפיד לא לקצוץ את השרירים יתר על המידה. לאחר מכן, הדגרירו בזהירות את חלקי הרקמה ב-2.5 mL של תמיסת pronase בריכוז 0.1% לכל באר, בטמפרטורה של 37 °C למשך 60 דקות, תוך ניעור עדין מדי 20 דקות.כאשר צרורי הסיבים מראים מראה רפוי, הוסיפו 2.5 milliliters של DMEM מועשר בסרום סוס ואנטיביוטיקה לכל באר והעבירו את הרקמות שעברו עיכול למבחנות קוניות נפרדות של 15 milliliter. סובבו את תערובות הרקמה בצנטריפוגה ושפכו את העלונות. לאחר מכן, הוסיפו חמישה milliliters של מצע לכל מבחנה והומוגניזו את הרקמה באמצעות פיפטה פלסטית של 10 milliliter.סובב שוב את הרקמות בצנטריפוגה והעבר את העל-נוזלים (supernatants) למבחנות קוניות חדשות של 15 milliliter. לאחר מכן, הוסף למבחנות חמישה milliliters נוספים של מצע תרבית וטריטורה שוב את חתיכות הרקמה עד שהשברים עוברים בקלות דרך הפ pipette. לאחר סבב צנטריפוגה נוסף, שאב את העל-נוזלים למבחנות המתאימות וסנן את תלייי התאים דרך מסנני 40 micrometer לתוך מבחנות בודדות של 50 milliliter.שטפו את המסננות ב-1 mL של DMEM כדי להשיג שחזור מקסימלי של תאים. לאחר מכן, הריצו את התאים בצנטריפוגה, השעיו את המשקעים במצע טרי, וספרו את התאים לצורך תרבית של תאי הלוויין (satellite cells) המבודדים. לאחר מכן, דללו את תליי התאים לריכוז של 1.5 × 10³ תאים ל-10 µL של מצע תרבית.לאחר מכן, הוסיפו 10 µL של תאים לכל נקודת ג'ל של מטריצה חוץ-תאית שהוכנה מראש, והדגירו את הג'לים בטמפרטורה של 37 °C למשך שש שעות. הוסיפו בזהירות 400 µL של מצע גידול לכל נקודת ג'ל והחזירו את השקופיות לאינקובטור. לאחר שלושה ימים, התחילו את התהליך של גביית התאים באמצעות הוספה של מצע הגידול המתאים מיד לאחר הבידוד.יותר מ-90% מהתאים הלוויינים שבודדו באופן טרי מבטאים את Pax7. עד היום הרביעי, Pax7 ו-MyoD מובטאים על ידי התאים הלוויינים מכל קבוצות השרירים. MyOG מובטא ברמה גבוהה ביום השביעי בכל קבוצות השרירים. ארבעה ימים לאחר הזריעה על מטריצה חוץ-תאית, gel spots, התאים המתחלקים מתחילים להתמזג ויוצרים שפופיות שריר (myotubes) רב-גרעיניות קטנות, המבטאות myosin heavy chain ביום השביעי והעשירי.שפופי שריר (myotubes) ארוכים ומאורגנים היטב ניכרים ביום ה-10. ניתן להבחין גם בהתכווצויות (twitching) של שפופי השריר. פרוטוקול זה מאפשר את חקר תאי הלוויין שמקורם בשרירי הראש של דגמי brer ומציע אפשרויות חדשות לטיפול בחולי שפך חיך.

isolation-characterization-satellite-cells-from-rat-head

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

סרטון זה מדגים את הבידוד של תאי לוויין מרקמות שריר מסועפות של ראש חולדה באמצעות דיסקציה של רקמות, עיכול אנזימטי וטיהור מכני וצנטריפוגלי לאחר מכן. לאחר מכן זורעים את התאים על בארות מצופות מטריצה חוץ-תאיות לצורך התמיינות למיובלסטים, ובסופו של דבר לצינורות מיו-צינור וסיבי שריר בוגרים.

טכניקה לבידוד תאי לוויין מרקמת שריר ראש חולדה

בידוד והתרבות של myofibers הוא תקן...

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

הבידוד והתרבות של אוכלוסייה טהורה של תאי לווין שקטים, אוכלוסיית תאי גזע שריר, הוא חיוני להבנה של ביולוגיה שרירים תאי גזע והתחדשות, כמו גם בתאי גזע להשתלה עבור טיפולים בניוון שרירים ומחלות ניווניות אחרות.

בידוד, תרבות והשתלה של תאי לווין שריר

בתרבות חוץ גופית מערכות הוכיחו הכרחיות להבנה של myogenesis חוליות שלנו. עם זאת, הרבה עדיין לא למד על פיתוח שרירי שלד nonmammalian וצמיחה, במיוחד במינים הבזליים. פרוטוקול יעיל וחזק לבידוד בתאי גזע בוגרים של רקמה זו, התאים המבשר myogenic (MPCs), ושמירה על ההתחדשות העצמית שלהם, שגשוג, ובידול בהגדרת תרבות העיקרית מאפשר זיהוי של מנגנוני פיקוח שימור ומסתעפים לאורך שושלות חוליות.

הכנת תא / תרבויות והיצמדות למנגנון הראשי myogenic מבשר משושלות חוליות בסל

סוגי התאים הדבקים העיקריים שמקורם בשריר אנושי הם תאים מיוגניים ופיברובלסטים. כאן, אוכלוסיות התאים מועשרות באמצעות מיון תאים מופעל מגנטי המבוסס על אנטיגן CD56. תיוג חיסוני לאחר מכן עם נוגדנים ספציפיים ושימוש בטכניקות ניתוח תמונה מאפשר כימות של מאפיינים ציטופלזמיים וגרעיניים בתאים בודדים.

בידוד וכמוני Immunocytochemical אפיון של תאים ראשוניים myogenic וFibroblasts משרירי שלד אדם

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה כדי להשיג אוכלוסייה טהורה של myoblasts האדם מן רקמת שריר בוגר. תאים אלה משמשים ללמוד בידול שריר השלד במבחנה , בפרט, ללמוד חלבונים המעורבים Ca 2 + איתות.

בידוד של Myoblasts האדם, הערכה של בידול Myogenic, ו-מופעלות סידן מופעל מדידה

זיהוי מדויק של תאים הלוויין חיוני ללמוד את הפונקציות שלהם בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. מאמר זה מציג פרוטוקול כדי לזהות תאים הלוויין במקטעי שרירי השלד למבוגרים מאת מבוססי immunofluorescence מכתים.

זיהוי של שרירי השלד תאים הלוויין על-ידי Immunofluorescence עם Pax7 ו- Laminin נוגדנים

כאן, אנו מציעים שיטה ביעילות להשיג סיבי שריר בודד בשלב מוקדם לאחר לידה התפתחותית מ homozygous מוטציה Lamin δ 8-11 מודל העכבר, מודל חמור מאוד עבור השרירים נייל-דרייפוס ניוון שרירים (edmd).

בידוד ותרבות בודדים מודל מורנה של קבצי נייל-דרייפוס ניוון שרירים בתחילת לאחר לידה פיתוח

פרוטוקול זה מתאר בידוד של תאי גזע שריריים ואבות פיברו-אדיפוגניים משרירי שלד בודדים בעכברים. הפרוטוקול כולל דיסקציה של שריר יחיד, בידוד תאי גזע על ידי מיון תאים מופעל פלואורסצנטי, הערכת טוהר על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית, ומדידה כמותית של כניסה לשלב S על ידי בדיקת שילוב 5-ethynyl-2'-deoxyuridine.

בידוד אוכלוסיות תאי גזע שקטים משרירי שלד בודדים

מוצג כאן פרוטוקול יעיל לבידוד תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) של תאי לוויין של שרירי גפיים עכבריים המותאם לחקר ויסות שעתוק בסיבי שריר על ידי שסע מתחת למטרות ושחרור באמצעות נוקלאז (CUT&amp;RUN).

פרוטוקול יעיל לניתוח CUT&amp;RUN של תאי לוויין עכבר מבודדים ב-FAC

פרוטוקול זה מספק שיטה סטנדרטית לבידוד והעשרת מיובלסטים ראשוניים משרירי השלד של עכברים בוגרים ויילודים באמצעות ניתוק רקמות, סינון רציף, ציפוי מוקדם ותנאי תרבית מוגדרים, המאפשר הקמה ותחזוקה של תרביות מיובלסטים שמקורן בתאי לוויין ליישומים ניסיוניים במורד הזרם.

בידוד תאי לוויין שריר השלד למחקרי מיוגנזה במבחנה

למדו לבודד תאי לווין משרירי ראש עכברוש ולתרבותם על ג'לי מטריצה חוץ-תאית. שיטה זו מאפשרת מעקב אחרי מיוגנזה וייצור שרירים רב-גרעיניים פונקציונליים ללא צורך בהרחבת תאים.

בידוד ואפיון של תאי לווין משרירי עכברוש ראש Branchiomeric

גלה סרטונים נוספים