בידוד ואפיון של תאי לווין משרירי עכברוש ראש Branchiomeric

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד תאי לוויין משרירים מייצגים שמקורם בקשתות הזרוע הראשונה, השנייה והרביעית לצורך תרביתם על מטריצה חוץ-תאית. כתמי ג'ל. זה מושג על ידי ניתוח תחילה של שרירי הטבח, הדיגסטרי והלוואדה ולי פלאטין של חולדה צעירה.

בשלב השני, תאי הלוויין מכל דגימת שריר מבודדים לפי אנזימטי, עיכול ומשך זמן. לאחר מכן התאים מתורבתים על ג'ל המטריצה החוץ-תאית. בסופו של דבר, ניתן לעקוב אחר המצב הדינמי של מיוגנזה של תרביות תאי הלוויין באמצעות צביעה עבור סמני השרירים המעניינים.

שפה וחך שסועים הם אחד המומים הנפוצים ביותר בגולגולת בבני אדם. כאשר קיים שסע, נדרש תיקון כירורגי על מנת לסגור את הפגם ולאפשר התפתחות דיבור תקינה, פיברוזיס והתחדשות שרירים פגומים, לעומת זאת, עלולים לעכב את ההתאוששות התפקודית של שרירי החך הרך. לאחר תיקון חיך שסוע, ניתן להדגים שיטה חדשנית לתרבית של תאי לוויין מבודדים טריים באמצעות ציפויי כתמי ג'ל מטריצה תאית אקסו בגודל מילימטר בלבד.

זה מונע את הדרישה להרחבה. ותאים אלה יום לפני הבידוד, מניחים שמונה תא באר מחליק לתוך צלחת פטרי של 100 מילימטר ומעביר את הצלחת למשטח קר. לאחר 10 דקות, השתמש במיקרו פיפטה ממולאת מראש כדי להוציא טיפה אחת של 10 מיקרוליטר של ג'ל מטריקס חוץ-תאי לכל באר.

לאחר צינון המגלשות למשך שבע דקות נוספות, הסר לחלוטין את הג'ל שנותר וייבש את הבארות בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה למחרת. כדי לנתח את שריר הטבח, הסירו את העור מראשה של חולדה בת תשעה שבועות והשתמשו במחטים תת-עוריות כדי לקבע את הראש על צידה. על כרית סיליקון, בודדו את בלוטת הפרוטיד ואת עצב הפנים והסירו את הבלוטה.

לאחר מכן, בעזרת להב אזמל מספר 15, הסר בזהירות את עצב הפנים. זהה את הראש השטחי של שריר המאסטר. לאחר מכן, השתמש במלקחיים ישרים כדי להפריד את הגיד ממקורו בתהליך הזיגומטי, ואחריו חיתוך זהיר של הגיד בעזרת מספריים לניתוח.

בעזרת האזמל מנתחים את הראש השטחי של הטבח עד להחדרתו בזווית ובמחצית התחתונה של המשטח הצדדי של ראמוס הלסת התחתונה. כדי לנתח את הבטן האחורית של השריר הדיגסטרי, יש לתקן את הראש במצב שכיבה בעזרת מחטים ולהסיר את השומן התת עורי המכסה את הבלוטות התת-לשוניות והתת-לסתיות. חשוף את בטן שרירי הקיבה הקדמית והאחורית ואז החזק את הגיד הקדמי של הבטן האחורית בעזרת מלקחיים ישרים חתוכים לתוך נתח בזהירות את הגיד למקורו בשור התוף.

כדי לנתח את שריר הלבדה ולי פלטינו, מקם את שריר הסטילו הלואיד. משוך אותו לרוחב והסר בזהירות את רקמת השריר. לאחר מכן, מקם את הגיד של הלבדה ולי פלטינו שמכניס את השור התוף ונתח אותו בזהירות.

לאחר מכן הרם את הוושט מאחורי קנה הנשימה. זהה את אזור החך הרך שבו מוחדר החך levada vli וחתוך את השריר לחופשי. לאחר מכן טבלו את השריר באתנול 70% והעבירו אותו ל-PBS קר כקרח בתוספת אנטיביוטיקה.

כדי לבודד את תאי הלוויין, העבירו כל שריר לבארות בודדות של צלחת של שש בארות, וחתכו את הרקמות לחתיכות קטנות של שני מילימטרים. הקפידו לא לטחון את השרירים יותר מדי. לאחר מכן, דגרו בזהירות את שברי הרקמה ב -2.5 מיליליטר של תמיסת פרונאז של 0.1% לבאר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות עם ניעור עדין כל 20 דקות.

כאשר צרורות הסיבים מציגים: מראה משוחרר ב-2.5 מיליליטר של DMEM בתוספת סרום סוסים ואנטיביוטיקה לכל באר ומעביר את הרקמות המעוכלות לצינורות חרוטיים בודדים של 15 מיליליטר. סובבו את תמיסות הרקמות ושפכו את הסופרנטנטים. לאחר מכן הוסיפו חמישה מיליליטר מדיום לכל צינור והומוגניזציה של הרקמה בעזרת פיפטה מפלסטיק של 10 מיליליטר.

סובבו שוב את הרקמות והעבירו את הסופרנטנטים לצינורות חרוטיים חדשים של 15 מיליליטר. לאחר מכן הוסיפו עוד חמישה מיליליטר של מדיום לצינורות ודרגו שוב את חתיכות הרקמה עד שהשברים עוברים בקלות דרך הפיפטה. לאחר צנטריפוגה נוספת, משוך את הסופרנטנטים לתוך הצינורות המתאימים וסנן את תרחיפי התאים דרך מסננות של 40 מיקרומטר לצינורות בודדים של 50 מיליליטר.

שטפו את המסננות עם מיליליטר אחד של DMEM להתאוששות תאים מקסימלית. לאחר מכן סובב את התאים, השהה מחדש את הכדורים במדיום טרי וספר את התאים כדי לתרבית את תאי הלוויין המבודדים. לאחר מכן, יש לדלל את תרחיפי התאים ל -1.5 פעמים 10 לשלושת התאים לכל 10 מיקרוליטר של מדיום תרבית.

לאחר מכן הוסיפו 10 מיקרוליטר של תאים על כל נקודת ג'ל מטריצה חוץ-תאית שהוכנה בעבר, ודגרו את הג'לים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לאחר שש שעות. מוסיפים בזהירות 400 מיקרוליטר מדיום תרבית לכל נקודת ג'ל ומחזירים את השקופיות לחממה. לאחר שלושה ימים יש ליזום את התמיינות התאים בתוספת מדיום התרבות המתאים מיד לאחר הבידוד.

יותר מ-90% מתאי הלוויין המבודדים הטריים מבטאים חבילה שבע ביום הרביעי, חבילה שבע ו-MyoD מתבטאים על ידי תאי הלוויין מכל קבוצות השרירים. ה-OG שלי בא לידי ביטוי מאוד ביום השביעי בכל קבוצות השרירים. ארבעה ימים לאחר הזריעה על המטריצה החוץ-תאית, כתמי ג'ל, התאים המתרבים מתחילים להתמזג וליצור צינורות מיו קטנים מרובי גרעינים, המבטאים שרשרת כבדה של מיוזין ביום השביעי והעשירי.

צינורות מיו ארוכים ומאורגנים היטב ניכרים עד היום העשירי. ניתן להבחין גם בעוויתות צינור מיו. פרוטוקול זה מאפשר לחקור תאי לוויין שמקורם בשרירי ראש שסועים ומציע אפשרויות חדשות לטיפול בחבר שסוע. חולים.