Name: Intranasal המינהל של החיסונים שפעת רקומביננטי במודלי כימרי עכבר ללמוד חסינות רירית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: למדו את מנגנוני החיסון נגד שפעת בעכברים כימריים באמצעות הנדסה גנטית הפוכה. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תאי דנדריטיים ותגובות חיסון תאי CD8 בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לסרג'יו גומז-מדינה על התמיכה הטכנית המצוינת בניסויים בעכברים. עבודה זו נתמכה על ידי כספים מאגודת לייבניץ ומרכז לייבניץ לזיהום. א.ל. הוא זוכה מלגת קדם-דוקטורט מבית הספר לתארים מתקדמים ע"ש לייבניץ.

<ol><li>Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understand+memory%2C+design+better+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Understand memory, design better vaccines.</a> Nat. Immunol. 12, 463-465 (2011).</li>
<li>Gaucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yellow+fever+vaccine+induces+integrated+multilineage+and+polyfunctional+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Yellow fever vaccine induces integrated multilineage and polyfunctional immune responses.</a> J. Exp. Med. 205, 3119-3131 (2008).</li>
<li>Querec, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+approach+predicts+immunogenicity+of+the+yellow+fever+vaccine+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Systems biology approach predicts immunogenicity of the yellow fever vaccine in humans.</a> Nat. Immunol. 10, 116-125 (2009).</li>
<li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392, 245-252 (1998).</li>
<li>Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+recombinant+influenza+virus+from+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA.</a> J Vis Exp. 3, (2010).</li>
<li>Haniffa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Tissues+Contain+CD141hi+Cross-Presenting+Dendritic+Cells+with+Functional+Homology+to+Mouse+CD103%2B+Nonlymphoid+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Human Tissues Contain CD141hi Cross-Presenting Dendritic Cells with Functional Homology to Mouse CD103+ Nonlymphoid Dendritic Cells.</a> Immunity. 37, 60-73 (2012).</li>
<li>Haniffa, M., Collin, M., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+functional+specialization+of+dendritic+cells+in+human+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and functional specialization of dendritic cells in human and mouse.</a> Adv. Immunol. 120, 1-49 (2013).</li>
<li>Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+depletion+of+CD11c%2B+dendritic+cells+abrogates+priming+of+CD8%2B+T+cells+by+exogenous+cell-associated+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens.</a> Immunity. 17, 211-220 (2011).</li>
<li>Lahl, K., Sparwasser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+depletion+of+FoxP3%2B+Tregs+using+the+DEREG+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo depletion of FoxP3+ Tregs using the DEREG mouse model.</a> Methods Mol. Biol. 17, 211-220 (2011).</li>
<li>Duffield, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+depletion+of+macrophages+reveals+distinct%2C+opposing+roles+during+liver+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair.</a> J. Clin. Invest. 115, 56-65 (2005).</li>
<li>Meredith, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+zinc+finger+transcription+factor+zDC%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Expression of the zinc finger transcription factor zDC.</a> J. Exp. Med. 209, 1153-1165 (2012).</li>
<li>Girón, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+Polyinosinic-Polycytidylic+Acid+Improves+Protection+Elicited+by+Replicating+Influenza+Vaccines+via+Enhanced+Dendritic+Cell+Function+and+T+Cell+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mucosal Polyinosinic-Polycytidylic Acid Improves Protection Elicited by Replicating Influenza Vaccines via Enhanced Dendritic Cell Function and T Cell Immunity.</a> J. Immunol. 193, 1324-1332 (2014).</li>
<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+animal+cells%3A+a+manual+of+basic+technique%5BTitle%5D)+AND+%22bib.usb.ve%22%5BJournal%5D)">Culture of animal cells: a manual of basic technique.</a> bib.usb.ve. , (1983).</li>
<li>Cox, R. J., Brokstad, K. A., Ogra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus%3A+immunity+and+vaccination+strategies.+Comparison+of+the+immune+response+to+inactivated+and+live%2C+attenuated+influenza+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Influenza virus: immunity and vaccination strategies. Comparison of the immune response to inactivated and live, attenuated influenza vaccines.</a> Scand. J. Immunol. 59, 1-15 (2004).</li>
<li>Gowdy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+CD8%28%2B%29+T+cell+immunity+after+allogeneic+bone+marrow+transplantation+leads+to+persistent+and+severe+respiratory+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Impaired CD8(+) T cell immunity after allogeneic bone marrow transplantation leads to persistent and severe respiratory viral infection.</a> Transpl. Immunol. 32, 51-60 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

במחקר זה אנו מתארים כיצד הפוכים גנטיקה ומודלים של עכברים chimeric יכול להיות מנוצלים כדי להבהיר את המנגנונים הפיזיולוגיים ומולקולריים של חסינות שנוצר עקב חיסון. גנטיקה הפוכה שפעת הוקמה במעבדות רבות ומלאה תפקיד ראשי בהבנת הפתוגנזה שפעת, שכפול והעברה 17. נקודת מפתח בפרוטוקול שלנו היא הצלה של חיסונים לשפעת מותאם קרים להביע epitopes הזרה. בעוד האסטרטגיה של החדרת cDNAs הקצר לגבעול של neuraminidase תוארה על ידי קבוצות רבות, החוקר צריך לוודא ששום מוטציות נוספות הציגו במהלך ייצ...

הדור של זיכרון חיסוני בהעדר המחלה הוא הבסיס הפיזיולוגי של חיסון יעיל 1. לאחרונה, מערכות גישות מבוססות ביולוגיה חשפו כי חיסונים מוצלחים כגון חיסון הקדחת הצהוב, לגרום לאינדוקציה חזקה של תגובות חיסוניות מולדים והפעלה של מספר תת קבוצות של תאים דנדריטים (DCS), אשר בתורו, להוביל לmultilineage הפעלה של אנטיגן תאי T ספציפיים 2,3. מאז DCs הוא אוכלוסיית תאים חיסונית רק עם היכולת להפעיל תאי T הנאיביים אנטיגן ספציפי 4, חקר תפקודם במהלך החיסון הוא קריטי להבנת תגובות חיסוניות לחיסונים ולעצב אסטרטגיות עתידיות נגד פתוגנים מאתגרים. מערכת מאפשרת מעקב של תת DCs שונה במהלך תגובה חיסונית לחיסונים תהיה רצויה כדי להקים קינטיקה מדויקת של הגירת DC לרקמות הלימפה, ולכן כדי לספקתובנה המנגנונים הפיסיולוגיים אחראים על הייזום של חסינות אדפטיבית חיסון ספציפי. הפוך גנטיקה מבוססת גישות מציעות האפשרות ליצירת שינוי, חיסונים-מוחלש חיים, שניתן להשתמש בניסוי עם מטרה זו. מאז יישומה על מחקר שפעת, גנטיקה הפוכה מבוסס פלסמיד הועסקה נרחבת כדי ליצור זני שפעת רקומביננטי כולל LAIVs. פרוטוקולים סטנדרטיים להצלת נגיפי שפעת רקומביננטי דורשים רב-transfection של קווי transfectable מאוד תא עם פלסמידים ambisense (הפקת שני RNA תחושה חיובי והשלילי) המכילים את הקטעים נגיפיים שפעת שמונה, כמו גם הגברה במערכת מתירנית כגון כליות כלבי מדין-דארבי ( תאי MDCK) ו / או ביצי תרנגולת embryonated 5. עם זאת, היישום של גנטיקה הפוכה כדי ליצור כלים מולקולריים כדי ללמוד את מנגנוני החיסון של חיסון נשאר נחקר. הדורמודלים עכבר חדשים המאפשרים דלדול ספציפי של תת תא חיסון, כולל DCS, פתח אפשרויות חדשות כדי להבין את מנגנוני חיסון הבסיסיים שבבסיס הגנה-שהושרו חיסון. ההשוואה בין פונקציות משנה DC בעכברים ובבני האדם גילתה כי, במידה רבה, עכבר וDCs האנושי הם פונקציונלי הומולוגי 6,7, ממצאים אלה, ממליץ בחום שפיתוח המודלים עכבר מאפשר דלדול ספציפי של DCs במצב היציב ובמהלך המצבים דלקתיים, יכול לשמש כדי להבין את הפיסיולוגיה של תגובות DC בבני אדם. בשנים האחרונות מספר המודלים עכבר כבר נוצר נושא transgenes מבטא את הקולטן רעלן דיפתריה הקופי (DT) (DTR) תחת שליטתו של אזור האמרגן של גן של 8,9 עניין. מאז רקמות עכבר לא באופן טבעי להביע DTR, מודלים אלה מאפשרים דלדול מותנה של תת תא נושא את הגן הממוקד של עניין על חיסון עכבר עם DT. לפיכך, abili שלנוטאי לרוקן DCs הספציפי ולויקוציטים האחר in vivo בתהליכים פיסיולוגיים, שופר באופן משמעותי על ידי הפיתוח של ro מבוסס DTR. עם זאת, בעוד שדגמי העכבר מהונדסים אלה היו בשימוש נרחב כדי להבין את ontogeny של מערכת החיסון, היישום שלהם לפיתוח חיסון נבדק בקושי. כאן, על ידי שילוב של גנטיקה הפוכה שפעת ומפלצות מח עצם תחרותיות מבוססות DTR, אנו מציעים שיטה ללמוד קינטיקה של חסינות חיסון, כמו גם תפקוד גן בודד במהלך תגובה חיסונית לחיסוני in vivo. היישום של טכנולוגיה זו להערכה פרה-קלינית של חיסונים חדשים כנגד מחלות זיהומיות מאתגרות יכול לעזור לתרץ עיצוב חיסון ולבחון מועמדי חיסון in vivo.

<table><tbody><tr><td>דולבקו וחריף; s Modified Eagle Medium (DMEM 1x)</td><td>Gibco RL-Life Technologies</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Gibco RL-Life Technologies</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen-Life Technologies</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/ml)</td><td>PAA</td><td>p11-010</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>ביציות עובריות</td><td>Valo biomedia Gmbh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; מסנני ניילון M</td><td>Greiner-Biorad</td><td>542-070</td><td></td></tr><tr><td>מאגר ליסינג של תאי דם אדומים (RBCL) 10x</td><td>BD Bioscience</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32 עכבר BD FC בלוק (2.4G2)</td><td>BD Pharmigen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>APC-Anti-Mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16)</td><td>Biolegend</td><td>141605</td><td></td></tr><tr><td>PE-Anti-Mouse CD11c (HLA3)</td><td>BD Biosciences</td><td>553802</td><td></td></tr><tr><td>eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2)</td><td>eBioscience</td><td>48-5321-82</td><td></td></tr><tr><td>Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70)</td><td>Biolegend</td><td>101216-PerCp</td><td></td></tr><tr><td>/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7)</td><td>Biolegend</td><td></td> 121416-PE-Anti-mouse <td></td></tr><tr><td>CD45.1 (A20)</td><td>eBioscience</td><td>12-0453-82</td><td></td></tr><tr><td>V500-Anti-Mouse CD45.2 (1O4)</td><td>BD Bioscience</td><td>562130</td><td></td></tr><tr><td>PerCp-eFluor710 -נגד עכבר CD8a (53-6.7)</td><td>eBioscience</td><td>46-0081-80</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7-נגד עכבר CD3&epsilon; (145-2611)</td><td>Biolegend</td><td>100325</td><td></td></tr><tr><td>eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5)</td><td>eBioscience</td><td>48-0041-80</td><td></td></tr><tr><td>CFSE Proliferation dye</td><td>eBioscience</td><td>65-0850-85</td><td></td></tr><tr><td>Baytril 2.5%</td><td>Bayer</td><td>65-0850-85</td><td></td></tr><tr><td>דימטיל-סולפוקסיד (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumin&nbsp;</td><td>בדיקות מולקולריות&nbsp;</td><td>O23020</td><td></td></tr><tr><td>דיפטריה טוקסין (DT)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D0564</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-TPCK</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>BD FACsCanto II ציטומטר זרימה</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo תוכנת ניתוח תאים 9.5</td><td>Flowjo inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>כתם כחול טריפן (0.4%)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Countess מונה תאים אוטומטי</td><td>Invitrogen-Life Technologies</td><td>C10227</td><td></td></tr></tbody></table>

intranasal המינהל של החיסונים שפעת רקומביננטי במודלי כימרי עכבר ללמוד חסינות רירית

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

חיסונים הם אחד ההישגים הגדולים ביותר של האנושות, והצילו את חייהם של מיליוני אנשים במאה האחרונה. באופן פרדוקסלי, מעט ידוע על המנגנונים הפיזיולוגיים המתווכים תגובות חיסוניות לחיסונים, אולי בשל ההצלחה הכוללת של החיסון, שהפחית את העניין במנגנונים המולקולריים והפיזיולוגיים של חסינות החיסונים. עם זאת, מספר פתוגנים אנושיים חשובים, כולל נגיף השפעת, עדיין מהווים אתגר לחיסון, ועשויים להפיק תועלת מאסטרטגיות מבוססות חיסון. 
למרות שגנטיקה הפוכה של שפעת יושמה בהצלחה ליצירת חיסוני שפעת חיים מוחלשים (LAIVs), הוספת כלים מולקולריים בתכשירי חיסון כגון רכיבי מעקב למעקב אחר הקינטיקה של חיסון in vivo, לא טופלה. בנוסף, הדור האחרון של מודלים עכבריים המאפשרים דלדול ספציפי של לויקוציטים במהלך מחקרים קינטיים פתח חלון הזדמנויות להבין את המנגנונים החיסוניים הבסיסיים העומדים בבסיס ההגנה הנגרמת על ידי חיסון. כאן, אנו מתארים כיצד השילוב של גנטיקה הפוכה ומודלים של עכברים כימריים עשוי לסייע לספק תובנות חדשות לגבי האופן שבו חיסונים פועלים ברמות פיזיולוגיות ומולקולריות, תוך שימוש כדוגמה בחיסון שפעת רקומביננטי, מותאם לקור ומוחלש חי (LAIV). השתמשנו ב-LAIVs שנוצרו במעבדה המכילים עוקבי תאים כמו גם כימרות מח עצם תחרותיות (BMCs) כדי לקבוע את הקינטיקה המוקדמת של חסינות החיסון ואת המנגנונים הפיזיולוגיים העיקריים האחראים להתחלת חסינות אדפטיבית ספציפית לחיסון. בנוסף, אנו מראים כיצד טכניקה זו עשויה להקל על מחקרי תפקוד גנים בבעלי חיים בודדים במהלך תגובות חיסוניות לחיסונים. אנו מציעים שניתן ליישם טכניקה זו כדי לשפר את האסטרטגיות המניעתיות הנוכחיות נגד פתוגנים שעבורם יש צורך באמצעי נגד רפואיים דחופים, למשל שפעת, HIV, פלסמודיום ונגיפי קדחת דימומית כגון נגיף האבולה.

דור של חיסונים לשפעת חיים-מוחלשים רקומביננטי יכול להיות מושגת על ידי transfection של פלסמידים קידוד שמונה המקטעים של נגיף שפעת בשליטת יזמים דו-כיוונית 5. חיסון נגד שפעת מותאמת קר בדרך כלל מכיל שישה מקטעים של זן מותאם קר, כמו גם את HA ו NA של זן השפעת של בחירה (למשל, H1N1) (איור 1 א). העיקרון קר-ההסתגלות מבוסס על שכפול וירוס מוגבל ב 33 מעלות צלזיוס, הטמפרטורה של דרכי נשימה העליונה (אגד) בעכברים ובבני אדם 14. לכן, החיסון יכול לשכפל באג...

יש חוסר ידע כללי על אופן פעולת החיסונים. כאן אנו מציעים שימוש משולב בגנטיקה הפוכה ועכברים כימריים של מח עצם כדי לקבל תובנה לגבי התגובות החיסוניות המוקדמות של המארח לחיסונים עם דגש מיוחד על תאים דנדריטיים וחסינות תאי T.

Intranasal המינהל של החיסונים שפעת רקומביננטי במודלי כימרי עכבר ללמוד חסינות רירית

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לתאר מערכת להערכת ההשראה הפיזיולוגית של חסינות אדפטיבית ספציפית לוואקצין. מטרה זו מושגת תחילה באמצעות גנטיקה הפוכה ליצירת ואקצינים חיים ומוחלשים נגד שפעת המכילים פפטיד אימונוגני ספציפי, ולאחר מכן באמצעות שימוש בעוובר אפרוח להרביית הנגיף. בשלב הבא, תאים נאספים מהקשרי לימפה של עכברים שחוסנו, וניתוח fax משמש למעקב אחר נדידת תאי דנדריטיים.בבדיקה הבאה, תאי T חיוביים ל-CD8 המגיבים לפפטיד האימונוגני מסומנים ומוזרקים לעכברים מחוסנים, ולאחריהם מבוצע אנליזה של FACS כדי למדוד את השכפול של תאים אלו לצורך ניתוח מפורט יותר של התגובה החיסונית. כימרה תחרותית של מח עצם נוצרת על ידי עירוי של תאי מח עצם המבטאים רספטור לטוקסין הדיפתריה לעכברים קונגניים שהקרנו, אשר נחשפים לאחר מכן לטוקסין הדיפתריה. לאחר דילול מוצלח, העכבר מחוסן, ונועזרים בנוגדנים מסומנים ובתטראמרים כדי לזהות תאי T חיוביים ל-CD8.זיהוי הפפטיד הספציפי. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הוואקסינולוגיה, כגון כיצד פועל חיסון ברמה הנוירולוגית, מהם המטרות התאיים והמולקולריות העיקריות של החיסון, וחשוב מכל, כיצד ניתן לשפר את האסטרטגיות הפרופילקטיות הנוכחיות. את הפרוצדורה תדגים Sanmen Medina.מנהל המעבדה ואני פיתחנו פרוטוקול זה כדי להפיק חיסון שפעת מותאם לקור בעל רכיבים מומח rescheduled, תוך שימוש בזן המותאם לקור A Ann Arbor six 60 כרקע, בשילוב עם המגלוטינין ונוירומינידאז משונה של זן A PR 8 34.חלק מרצף גבעול החלבון של גן ה-neuraminidase מוחלף ברצף cDNA קצר המקודד לפפטיד העוף syn fecal. פפטיד זה הוא בעל דומיננטיות אימונולוגית גבוהה במחלקה H two BMHC. הוא מעורר תגובה מוגבלת אחת בעכברי C 57 black six ומתפקד כאלמנט שניתן למעקב.כדי להתחיל, זרעו 1,000,002 תאי T בכל באר של פלטה בעלת שש בארות עם DMEM המכיל 10% fetal bovine serum ו-1% pen strep. לאחר מכן, הכינו תערובת טרנספקציית פלסמיד בכמות מספיקה ל-100 µL לכל באר. ערבבו מיקרוגרם אחד מכל פלסמיד ומלאו מבחנה נוספת במצע תאים מסוג opti MEM שחומם מראש עד לנפח של 50 µL.הוסיפו נפח כפול של lipectomy 2000 בהתאם לכמות הכוללת של הפלסמיד המיועד לטרנספקציה, והשלימו את נפח המבחנה ל-50 microliters באמצעות opti MEM לפני הוספת תערובת הטרנספקציה לתאים. המתינו 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו 100 microliters מתערובת הטרנספקציה לכל באר והעבירו את הפלטה לאינקובטור למשך 16 שעות.ביום למחרת, החליפו את המצע ל-DMEM עם 0.3% BSA ו-1% pen strep. לאחר מכן, העבירו את התאים לטמפרטורה של 33 °C עם 5% carbon dioxide למשך חמש שעות. לאחר חמש שעות.הוסיפו שכבה של מיליון תאי MDCK המאפשרים זיהום בשפעת ב-DMEM המועשר ב-Trypsin. תחזקו את תרביות השיתוף (co-cultures) במשך יומיים עד שלושה ימים תחת משטר דגירה של 33 °C כדי לייצר ולהגביר את הנגיף. לאחר מכן, הסירו את השאריות באמצעות סבב צנטריפוגה של 5 דקות ב-260 G. לאחר מכן אספו את העל-נוזלים (supernatants) והחדירו אותם לביצים של עוברי עוף בני 9 עד 10 ימים בתנאים סטריליים.כדי לעשות זאת, צרו חור בחלק העליון של קליפת הביצה והוסיפו את הווירוס בדילול של 100 x 10 או בדילול של one x. כסו את קליפת הביצה בשעווה מותכת באמצעות מקלון צמר, והדגירו את ביצי העוף המוחדרות למשך שלושה ימים בטמפרטורה של 33 °C. לאחר מכן, אספו את הנוזל האלנטואיטי (allantoic fluid) מהביצים המודבקות.שטפו את קליפות הביצים ב-70% ethanol. פתחו את הביצה באמצעות סדק עדין מאוד בחלק העליון, והסירו את קרום ה-allantoic בעזרת פינצטה סטרילית. השתמשו בפיפטה של 10 milliliter כדי לאסוף כמה שיותר נוזל.בדרך כלל בין 6 ל-10 מיליליטר. סובב את הנוזל בצנטריפוגה ב-260 gs למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C והעבר את נוזל ה-allantoic המרוקח למבחנות חדשות. לאחר הרדמת עכבר תורמן וגישה ניתוחית למדיאסטינום (המדיאסטינום), אסוף את קשרי הלימפה באמצעות פינצטה קמורה.העבירו את קשרי הלימפה לפלטה בעלת שישה בארות המכילה מיליליטר אחד של DMEM. לאחר הסרת כל רקמה חיבורית או רקמת שומן המקיפה את קשר הלימפה, קבעו את קשר הלימפה באמצעות מחט אחת ופרצו אותו עם המחט השנייה. פעולה זו אמורה להוביל לפריצה של תאים מקשר הלימפה אל תוך המצע לצורך איסוף התאים.ראשית, העבירו את כל חומר הרקמה דרך מסנן ניילון של 70 micron כדי לקבל תרחיף תאים המוכן לסרטיפוגציה. השעיקו מחדש את משקע התאים בשני מיליליטר של RBC Lysing buffer. אפשרו לתגובת הליזיס להימשך במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר, וסיימו אותה על ידי הוספת שני מיליליטר של PBS קר מאוד; לאחר מכן, המשיכו בצביעת התאים בהתאם לפרוטוקול הכתוב.הקפידו להשתמש בטפיחת פלטות (plate flicking) כדי להסיר ולהשליך את supernatant לפני דגירת הנוגדן. תייגו תאי T תורמים מעכברים טרנסגניים ל-TCR הזמינים מסחרית; דגגו 5 million תאים ב-1 mL של PBS עם 5 µM CFSE. תנו לדגירה להימשך 20 דקות ב-37 °C בחושך.לאחר מכן, אספו את התאים בריכוז של 2 מיליון תאים ל-100 µL של PBS, והחדירו לעכברים קונגניים מקבלים בוליס של 100 µL באמצעות הזרקה לסינוס רטרו-אורביטלי. לאחר שלושה עד חמישה ימים, הפריעו את העכברים, אספו את קשרי הלימפה המדיסטינליים והכינו תרחיף תאים בודדים עבור ציטומטריה זרימתית, כפי שבוצע קודם לכן.לאחר מכן, זהו את תאי התורם על ידי צביעה של תגלי התאים הבודדים בתערובת נוגדנים. לצורך הניתוח, השאר את ערוץ ה-FL one של ציטומטר הזרימה פתוח כדי לקבוע את פרופיל הדילול של CFSE.לאחר הסרה וחיטוי של השוקיים (tibiae) והירך (femur) מעכבר שהורג, אספו אותם לצלחית המכילה DMEM. חתכו את קצות העצמות באמצעות מספריים חדים ושטפו את מחולל השומן (bone marrow) לתוך ה-DMEM. כעת, בשיטות סטנדרטיות, הקרינו נקבות עכברים בני שש עד שמונה שבועות באמצעות מקרין עם מקור של caesium 137. שעתיים עד ארבע שעות לאחר הקרנת העכברים, הרדימו אותם והשתילו בהם תאי מחולל שומן מתורם באמצעות הזרקה לסינוס הרטרו-אורביטלי של 2 מיליון תאים ב-100 µL של PBS. במהלך השבועיים הבאים, ספקו לעכברים 2.5 עד 5 mg של Baal לכל קילוגרם במי השתייה שלהם.החל משני ימים לפני החיסון, ניתן 50 nanograms של DT המדולל ב-50 microliters של PBS, טיפה אחר טיפה, ישירות לנחירים של עכברים המורדמים. המשיכו בטיפול זה למשך שלושה ימים לאחר החיסון. עיינו בפרוטוקול הטקסט לפרטים נוספים ליצירת מודל העכברים הסופי.חטלו את העכברים בנגיף שפעת חי מוחלש רקומביננטי באמצעות הזרקה תוך-נחרית תחת הרדמה. הניפו 1000 PFU של הוואקצין באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר ב-50 מיקרוליטר של PBS. ניתן להפיק חיסוני שפעת חיים מוחלשים רקומביננטיים על ידי טרנספקציה של פלסמידים המקודדים את שמונת המקטעים של נגיף השפעת תחת בקרת מקדמים דו-כיווניים. חיסון שפעת מותאם לקור מכיל בדרך כלל שישה מקטעים של זן מותאם לקור, וכן את ה-HA וה-NA של זן השפעת הנבחר, כגון H1N1.הסתגלות לקור מאפשרת שכפול מוגבל של הנגיף בטמפרטורה של 33 מעלות צלזיוס, שהיא הטמפרטורה של דרכי הנשימה העליונות בעכברים ובבני אדם, אך אינה מאפשרת שכפול בדרכי הנשימה התחתונות, ולכן אינה עלולה להוביל לדלקת ריאות. נעשה שימוש ב-PCR כדי להחליף אזור שמור בגבעול של הneuraminidase הנגיפי בפפטיד ניתן למעקב שנגזר מ-OVA. מודל הפפטיד שניתן למעקב הוחדר לעכברים בין שלושה לשישה ימים לאחר החיסון.החלבון העקוב syn fecal זוהה בקשרי הלימפה המנקזים מהריאה. ציטומטריה זרימה רב-פרמטרית שימשה לכימות הצגת אנטיגן ממקור החסון בזמן אמת. באופן דומה, עירוי של תאי T ספציפיים ל-syn fecal אפשר כימות של תגובות תאי CD8 T ספציפיים לחסון כדי להעריך תפקודים ספציפיים לגן במהלך החסונה.נעשה שימוש במודל עכברים המשלב טכנולוגיית DTR והשתלת מחלקה של מחולל גרמי תחרותי. בכך, פגיעה בתפקוד הגן כוונה למדורי תאים ספציפיים במהלך תגובות חיסוניות לחיסון. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הניתוח של מסלולים מולקולריים ופיזיולוגיים המעורבים בוויסות של חסינות מושרית חיסון במארח.בנוסף, טכניקה זו תספק תובנות חדשות בקביעת יעדי התאים של החיסון, ובכך תסייע בהערכה של פלטפורמות חיסון חדשות.

intranasal-administration-recombinant-influenza-vaccines-chimeric

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: לנהרד, א. ואחרים. מודל עכבר למעבר של Streptococcus pneumoniae ממתיישב לפתוגן בעקבות זיהום נגיפי משחזר מחלה שהוחמרה על ידי הגיל. J. Vis. Exp. (2022)הסרטון הזה מדגים מודל זיהום משותף לעכברים, שבו נגיף השפעת מפעיל את המעבר של Streptococcus pneumoniae ממתיישב לפתוגן. הוא מפרט את השלבים המעורבים בהתיישבות חיידקית, זיהום ויראלי והתקדמות מחלה.

מודל עכבר לחקר המעבר הפתוגני של Streptococcus pneumoniae בעקבות זיהום נלווה ויראלי

Source: Wang, M., et al, Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates intranasal infection of a mouse with a pathogenic influenza virus to establish a respiratory tract infection. The procedure outlines the administration of the virus into the nasal cavity. The virus enters host cells, replicates, and activates the immune system.

Intranasal Infection of a Mouse with a Pathogenic Influenza Virus

סרטון זה מדגים חיסון BCG תוך-אפי בעכברים, המפעיל תגובות חיסוניות מולדות ונרכשות, מה שמוביל להתפתחות תאי זיכרון T שוכני ריאות ותאי B משפיעים, ובכך משפר את ההגנה מפני זיהומי מיקובקטריום.

חיסון תוך אפי עם BCG במודל עכבר

הסרטון מציג שיטה ליצירת נגיפי שפעת רקומביננטיים מותאמים לקור. היא כרוכה בהדבקת תאים אנושיים בפלסמידים דו-כיווניים, ולאחר מכן דגירה בטמפרטורה נמוכה יותר כדי להניב נגיפים המתאימים לייצור חיסונים, המאופיינים בשכפול מופחת בתנאים חמים יותר.

יצירת נגיפי שפעת חיים מוחלשים רקומביננטיים לחיסונים

אנו מדגימים את ההליך לחיסון תוך קנה הנשימה של המופילוס אינפלואנזה לדרכי הנשימה התחתונות של עכברים. זהו כלי שימושי מאוד לחקר מסלולי איתות המווסתים דלקת בדרכי הנשימה במודלים של עכברים.

מנהל Intra-קנה נשימה של<em&gt; אינפלואנזה המופילוס</em&gt; בעכברי מודל לחקר Airway דלקת

וירוסים שפעת A (IAVs) הם חשובים פתוגנים הנשימה האנושית. כדי להבין את פתוגניות של IAVs וכדי לבצע בדיקות פרה גישות חיסון הרומן, חייתיים מחקה פיזיולוגיה אנושית נדרשים. כאן, אנו מתארים שיטות להערכת iav ב פתוגנזה, התגובות ההורמונאלית, יעילות החיסון באמצעות מודל של העכבר של זיהום.

מחקרים וירוס שפעת A במודל של עכברים של זיהום

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול לבצע שני הפוטונים intravital הדמיה ותא ניתוח אינטראקציות בין רירית והכו אותי מאתר לאחר ההדבקה בנגיף שפעת. פרוטוקול זה יהיה רלוונטי עבור החוקרים ללמוד את הדינמיקה תא החיסון במהלך זיהומים בדרכי הנשימה.

אינטראקציה תא הדמיה ב רירית והכו אותי במהלך זיהום בנגיף שפעת באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים Intravital

כאן אנו מציגים פרוטוקול אלגנטי ויוו הערכה של חיסון היעילות ומנחה תגובות מערכת החיסון. פרוטוקול זה ניתן להתאים מודלים חיסון ללמוד ויראלי, חיידקי, או טפילים פתוגנים.

הערכה של פתוגן-פונדקאי תגובות והיעילות החיסון בעכברים

מאמר זה מתאר פרוטוקולים של הערכת תגובת Tfh ו- GC B במודל העכבר של זיהום וירוס שפעת.

הערכה של תאי עוזר T זקיקים ותגובת מרכז חיידקים במהלך שפעת זיהום וירוס בעכברים

פרוטוקול זה מספק הוראות למתן תוך-אף של IAV וניתוח במורד הזרם של נזק לריאות עכברים ושינויים שעתוק נלווים לסוגי תאי ריאה.

מידול תיקון דיספלסטי ותפקודי של מכתשית ריאות לאחר זיהום בשפעת

למדו את מנגנוני החיסון נגד שפעת בעכברים כימריים באמצעות הנדסה גנטית הפוכה. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תאי דנדריטיים ותגובות חיסון תאי CD8 בזמן אמת.

Intranasal המינהל של החיסונים שפעת רקומביננטי במודלי כימרי עכבר ללמוד חסינות רירית

גלה סרטונים נוספים