Ex Vivo הדמיה של נדידת תאי המוח הקטן אחרי הלידה גרגיר שימוש Confocal Macroscopy
12 במאי 2015
במהלך התפתחות המוח הקטן לאחר הלידה, תאי גרגיר לא בשלים שמקורם באזור הנבט מציגים אופני נדידה מובהקים כדי להגיע ליעדם הסופי ולהקים רשתות עצביות. פרוטוקול זה מתאר את הכנת פרוסות המוח הקטן ואת הגישה המקרוסקופית הקונפוקלית המשמשת לחקירת הגורמים המווסתים את נדידת העצבים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין נוירונים נודדים בפרוסות מוח חיות. זה מושג על ידי ניתוח המוח הקטן מחולדת P 10. השלבים הבאים הם הכנת פרוסות מוח חריפות ולתייג את הנוירונים עם בדיקה פלואורסצנטית.
לאחר מכן מבוצע ניסוי זמן-lapse באמצעות הדמיה קונפוקלית מאקרו או מיקרוסקופיה קונפוקלית. השלב האחרון הוא לעקוב אחר תאי העצב בסרטים שנוצרו. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה ex vivo משמשת כדי להראות את תפקידם של גורמים אנדוגניים או חומרים רעילים המווסתים את נדידת העצבים.
היתרון העיקרי של טכניקה זו של שיטות קיימות כמו מיקרוסקופיה קונפוקלית, הוא שהדמיה קונפוקלית מאקרו מגבירה את תחושת הראייה של השארת פרוסות אמנות מוח מונחות ישירות על הכנסת המפשעה. ראשית, היה לי את הרעיון לשיטה זו כאשר היו לי קשיים להעביר ולייצב פרוסות אמנות מוח לניסויי מיקרוסקופיה קונפוקלית התחל בגישה לגולגולת של ראש גור חולדה P 10 ערוף ראש, תוך שימוש במספריים עדינים של קשתית הגולגולת לבצע בעדינות שני חתכים רוחביים מהבסיס לאזור הרוסטרלי של הגולגולת. לאחר מכן הסר את הגולגולת המנותחת עם שני מלקחיים מספר שלוש, ושבר כל הידבקות בין המוח לגולגולת.
כעת, הוציאו את המוח עם קצה הכף של מרית, והכניסו אותו לצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר עם שני מיליליטר HBSS קר על קרח. כעת, תחת מיקרוסקופ סטריאו, בודדו את המוח הקטן מהמוח על ידי חתכים D באמצעות שני מלקחיים מספר שלוש. כף את המוח הקטן לכלי חדש עם חיץ קר כקרח.
לאחר מכן בעזרת אותם כלים, הסר והשליך את חוט השדרה הנותר ואת קרום הקליפה. הכן ידית אזמל מוצקה מספר שלוש עם להב כירורגי מספר 15. בעזרת הלהב מתחת למיקרוסקופ סטריאו, חותכים את המוח הקטן בין הוורוס לחצי הכדור הימני.
כעת בוויברטו, הניחו טיפה של דבק ציאנוקרילט על דיסק הדגימה והמתינו 15 עד 25 שניות עד שאדי הממס יתפזרו לפני העברת המוח הקטן לדיסק. לאחר מכן, קבע את קצה המוח הקטן לדיסק הדגימה והמתן 10 שניות. כעת באמצעות המניפולטור, הכנס את דיסק הדגימה למגש החיץ כך שהציר הרוחבי של המוח הקטן יהיה בניצב למחזיק הסכין.
הקפד לאבטח את הדיסק באמצעות מפתח ברגים. לאחר מכן מכסים בזהירות את המוח הקטן ב- HBSS ומעמיסים קרח כתוש לאמבט הקירור. כדי לפרוס את הדגימה מקם להב נקי, כך שהקצה שלו נמצא ממש מאחורי הקצה האחורי של הדגימה.
הגדירו זאת כנקודת ההתחלה לציפוי. לאחר מכן השתמש בפקודה קדימה כדי להגדיר את נקודת הקצה ממש מעבר לקצה הקדמי של הדגימה. כעת הגדר את עובי הפרוסה ל -180 מיקרון.
לאחר מכן הגדר את מהירות החיתוך ל-2.5 ואת התדירות לשמונה, והתחל לחתוך את הדגימה. אוספים עד חמש פרוסות לכל מוח קטן. הרם כל חלק באמצעות פיפטה מזכוכית חזיר רחבה קטומה.
מעבירים את החלקים לכלי המכיל HBSS קר על קרח. לאחר איסוף הפרוסות תחת מיקרוסקופ סטריאו, הסר בזהירות את קרומי המוח באמצעות שני מלקחיים מספר חמש. כמו כן, הפרד בעדינות את ה-LOEs לטעינת בדיקה טובה יותר.
לאחר חיתוך הדגימה, השתמש בפיפטה רחבה קטומה כדי להעביר אותם עם מעט HBSS לעומס צלחת של שש בארות עד שלוש פרוסות בכל באר. לאחר מכן, לאחר ריקון המדיה בכל טעון, הוסיפו היטב חמישה מיליליטר של תמיסת טעינה המכילה 10 מיקרומולר של הצבע הפלואורסצנטי כדי להגן על הדגימות מפני אור, כסו את הצלחת בנייר כסף. לאחר מכן הניחו את הצלחת על מוטטור המוגדר ל -35 סל"ד.
הניחו לצלחת לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לצבע לתייג את בארות התאים. כעת העבירו את הפרוסות כמו קודם לקרום של תוספת טרנסוול שיש בה שלוש נקבוביות מיקרון. לאחר מכן שאפו את אמצעי הטעינה, והשאירו רק את הפרוסות.
כעת הסר את התוספת והפרוסות כדי למלא את הבאר ב -1.9 מיליליטר DMEM. לאחר מכן החזירו את התוספת והוסיפו עוד 100 מיקרוליטר של DMEM כדי לכסות את הרקמות. דגרו על תכשיר זה למשך שעתיים, ולאחר מכן נראו תאי גרגיר.
העבירו את הצלחת ללא המכסה לתא סביבתי עם זרימת גז קבועה במיקרוסקופ קונפוקלי. לאחר מכן הנח מכסה זכוכית על תוספת הצלחת של המיקרוסקופ הקונפוקלי לניסויי זמן-lapse. תן לתאים לדגור בתא למשך שעתיים נוספות לפני שתמשיך.
כדי לדמיין את תאי הגרגיר הנודדים בפרוסות הרקמה, האירו את התכשיר באור של 488 ננומטר והשתמשו במטרה יבשה פי שניים. זהה פליטות פלואורסצנטיות מ-500 עד 530 ננומטר באמצעות תמונה J.עבור כל תמונה של סרט ה-time-lapse, בצע הקרנת Zack באמצעות מצב סטיית התקן, התאם את הניגודיות ואת רמות הבהירות של כל תמונה כך שתאי הגרגיר המסומנים יהיו קלים לראות. כעת, בחר את תוסף המעקב הידני מתפריט ניתוח החלקיקים.
השתמש בתוסף כדי ללחוץ על הנקודה המרכזית של כל גוף תא מסומן לאורך רצף התמונות של זמן-lapse. לאחר מכן ייצא את נתוני המעקב הגולמיים לגיליון אלקטרוני להמשך ניתוח. ארגן מחדש את נתוני המעקב הגולמיים המיוצאים מתמונה J עם כלי ביתי חכם המזהה כל תא ומיקומים משויכים באמצעות התוכנית.
חשב את מרחק הנסיעה הכולל ואת מהירות ההעברה הממוצעת עבור כל תא. במוח הקטן המוקדם שלאחר הלידה, תאי גרגיר מציגים שינויים משמעותיים במצב ובמהירות הנדידה שלהם כאשר הם חצו שכבות קליפת המוח השונות. נבדקו תאי גרגיר עם תווית CTG בפרוסות רקמת המוח הקטן של חולדת PM.
כמתואר, תאי הגרגיר נדדו רדיאלית בשכבה המולקולרית במהירות ממוצעת של 18 מיקרון לשעה. לאחר מכן נעשה שימוש בתכשיר נוסף כדי לבחון את ההשפעה של תרופות שצפויות לשנות את קצב הנדידה. החלת תקרת שכר 38 על מדיום התרבית הביאה לירידה של 79% במהירות של תאי הגרגיר בשכבה המולקולרית, ירידה ל-2.5 מיקרון לשעה.
מתן PI one, מעכב של TPA אנדוגני הפחית את מהירות נדידת תאי הגרגיר ב-78% ממהירות הבקרה ל-4.2 מיקרון לשעה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לעקוב אחר תאים בבלון התיאוריה המתפתח. בזמן שאני מנסה את ההליך הזה, חשוב לזכור לספק פרמטרים סביבתיים מתאימים וקבועים החיוניים לנדידת תאים לאחר התפתחותו.
טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח לחקור את התהליכים העובדתיים במוח.
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בנדירה של תאי גרנולה לא בשלים במערכת ה cerebelllum לאחר הלידה, תוך שימוש בגישה מקרוסקופית קונפוקלית להדמיית תנועה של נוירונים בתוך פרוסות מוח חיות. הפרוטוקול מפרט את הכנת פרוסות ה-cerebellum ואת הגורמים המשפיעים על נדירת הנוירונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- נדידה עצבית
- מיקרוסקופיה קונפוקלית
רקע
- תאי גרנולה נודדים כדי להקים רשתות עצביות במהלך התפתחות cerebellum.
- הבנת נדידת נוירונים היא חיונית להשגת תובנות לגבי התפתחות המוח והפרעות נוירולוגיות.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשרת הדמיה מפורטת של התנהגות עצבית.
- מיקרוסקופיה ex vivo יכולה לחשוף את השפעתם של גורמים שונים על נדידה עצבית.
מטרת המחקר
- להדמיות של נדירת תאי גרנולה (granule cells) בחלולית המוח (cerebellum).
- לבדיקת ההשפעה של גורמים אנדוגניים וחומרים רעילים על נדירה נוירונלית.
- לשיפור טכניקות למחקר של דינמיקה נוירונלית בחתכי מוח.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ניתוח של cerebellum מחתול P10 והכנת פרוסות אקוטיות.
- סימון נוירונים באמצעות גשים פלואורסצנטיים לצורך ויזואליזציה.
- דימות Time-lapse באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית מאקרו.
- מעקב אחר תנועת נוירונים וניתוח מהירות ומרחק נדידה.
תוצאות עיקריות
- תאי גרנולה הראו שינויים משמעותיים בדרכי ובמהירויות הנדידה לאורך השכבות הקורטיקליות.
- מהירות הנדידה הממוצעת שנמצאה בשכבה המולקולרית הייתה 18 microns per hour.
- מתן תרופות ספציפיות שינה באופן משמעותי את מהירות הנדידה של תאי הגרנולה.
- התוצאות מספקות תובנות לגבי מנגנוני הבקרה של נדידה עצבית.
מסקנות
- המחקר ויזואлизиציה בהצלחה את נדירת תאי הגרנול בחתכים של המוח הקטן.
- הממצאים מדגישים את ההשפעה של גורמים אנדוגניים על תנועת נוירונים.
- שיטה זו משפרת את ההבנה של הדינמיקה הנוירונלית במהלך ההתפתחות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה בזמן אמת של נדידה עצבית בתוך פרוסות מוח חיות, ובכך תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים בתהליכי תיקוף של מטרות פיתוח עצבי. באמצעות כימות מהירות הנדידה ודינמיקת המסלולים, היא מספקת ביטחון ניבוי להערכת השפעות של תרכובות על המעגלים העצביים. גישה זו מגשרת בין ביולוגיה של גילוי לבין הערכה פרה-קלינית של חומרים בעלי פעילות עצבית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של נדידת תאי גרנולה כקריאה פונקציונלית של שלמות מסלולים עצביים.
- ערך תפעולי: מאפשר הפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות תצפית ישירה על השפעות של גורמים אנדוגניים וחומרים רעילים על תנועת התאים.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי קישור שינויים בנדידה לגרועים פונקציונליים פוטנציאליים במעגלים של הדגיכה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות מתוקפות עבור תהליכי עבודה המשכיים על ידי קביעת קינטיקת נדידה בסיסית בשכבות קורטיקליות.
- ערך תפעולי: נותן מענה לסטנדרטיזציה של הבדיקה וליכולת השחזור שלה באמצעות מעקב כמותי אחר מרחק הנדידה הכולל והמהירות הממוצעת.
- מוכנות לסריקה: מדגיש את יכולת ההרחבה ואת השימוש החוזר בפלטפורמה להערכה מהימנה של תרכובות בפורמט של צילום רציף (time-lapse).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: דן ברלוונטיות למחלות על ידי קישור בין הפרעות בבקרת נדידה לבין ליקויים בתפקודי דצירול (מוח דגי) מגוונים.
- קידום מותאם סיכון: מתאר את הרצף מהשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של תרכובות נוירו-אקטיביות.
- הפחתת סיכונים חזויה: מתמקד בתובנה מכניסטית בעת הערכת השפעת חומרים כמו אלכוהול או מתילכספית על נדידת נוירונים.
שילוב זרימת עבודה וצינור עיבוד
ממקם את השיטה ברצף הגילוי, מבדיקת השערות ועד לזיהוי מובילים (leads), וזאת בהתבסס על יכולתה למדוד נדידה כנקודת קצה פונקציונלית.
- ביולוגיה של תגליות: מסביר כיצד השיטה תומכת בבדיקת השערות, הבהרת מסלולים והפחתת סיכונים ביולוגיים של מנגנוני נדידה עצבית.
- סריקה: מתאר את המוכנות של הבדיקה, את השחזוריות ואת התוצרים הכמותיים בעת מעקב אחר תנועת תאי גרנולה בתגובה לתרכובות.
- אנליזה: מדגיש מדידות, קריאות או תוצרים סטטיסטיים המסייעים לצוותים להשוות את מהירות ומרחק הנדידה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר את השיטה לרציפות פרה-קלינית או להתאמה של סממנים ביולוגיים רק כאשר המקור תומך בכך.
- שימוש חוזר ארגוני: מציג את השיטה כיכולת ניתנת לשימוש חוזר ולא כטכניקה לשימוש חד-פעמי.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי, תיקוף מטרה, והפחתת עמימות מכניסטית במסלולי נדידה עצבית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת הרחבה של פרוטוקולי דימות ומעקב בשיטת time-lapse.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go), יעילות הונית והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בסריקת תרכובות בעלות פעילות עצבית.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף והחלטות קידום מותאמות לסיכון, המבוססות על נתוני פנוטיפ של נדידה.
שיקולי יישום
- מומחיות מדעית נדרשת בנוירו-אנטומיה, סימון פלואורסצנטי ומיקרוסקופיה קונפוקלית.
- צרכי תשתית אנליטית וציוד, הכוללים תא סביבתי, מקרוסקופ קונפוקלי ותוכנת Image J עם תוספי מעקב.
- דרישות לסטנדרטיזציה בין צוותים להכנת פרוסות, עקביות בסימון וכימות נדידה.
- שיקולי התאמה בין מערכות מודלים, כגון גילאים פוסט-נטאליים שונים או מינים שונים.
- מגבלות מעשיות הנתמכות על ידי חומרי המקור, כולל חלון חיוניות הפרוסה וסיכוני פוטוטוקסיות במהלך דימוג לטווח ארוך.
