הנדסת ג'ל קולגן Cellularized 3D לשחזור רקמות וכלי דם

המטרה הכוללת של הליך זה היא להנדס מבנים צינוריים להתחדשות רקמות כלי הדם. זה מושג על ידי שילוב של קולגן מסוג 1 ותאי שריר חלק בגיאומטריה גלילית עם שימוש בטכניקת יציקה. השלב השני הוא להבשיל את המבנה בביו-ריאקטור סטטי שתוכנן במיוחד.

לאחר מכן, המבנים הבוגרים נקצרים בזהירות ותאי אנדותל יושבים על לומן המבנה באמצעות שחקן ביו-ריאקטור מסתובב. בסופו של דבר, היסטולוגיה, בדיקות מטבוליות ובדיקות מכניות מבוצעות כדי להעריך את המאפיינים של מבנים צינוריים אלה. המקוריות של טכניקה זו היא שהיא משתמשת בשלב אחד בלבד כדי לשלב תאים וקולגן כדי לייצר מבנה מהנדס רקמות עם תכונות מכניות ממוקדות ללא כל טיפול פיזיקלי או כימי נוסף.

יתר על כן, ניתן לתפעל את המבנה בקלות הודות לאחיזות עיצוב ספציפיות, המאפשרות מניפולציה וקישורי קצה שלהם. שיטה זו יכולה לספק תובנה ביחסי הגומלין בין תאים למטריצה חוץ-תאית במהלך צמיחה ועיצוב מחדש להתחדשות רקמות כלי הדם. בנוסף, ניתן ליישם אותו על מספר רקמות ממוקדות, כגון גידים, שתלי עור, מדבקת לב ומערכת העצבים.

כדי להתחיל לייצר ולהרכיב את הביוריאקטור הסטטי כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה כלולים פרטים על מאגר וגזה, ייצור אחיזה, מכסה ציר וטכניקות ההרכבה והעיקור של תבנית הדיור. לאחר מכן, הרחב את תאי השריר החלק של אבי העורקים החזירי בבקבוק תרבית רקמה של 175 סנטימטר רבוע עד שהם מתכנסים ב-90%. באמצעות טכניקות תרבית סטנדרטיות, קצרו את התאים ולאחר מכן השעו אותם מחדש ב-4 מיליון תאים למיליליטר במדיום תרבית שלם.

לאחר מכן, שלב תמיסת חיץ חלק אחד, שני חלקים תמיסת קולגן סטרילית בארבעה גרם לליטר וחלק אחד של תרחיף תאים. בסדר זה, מדוד את ה-pH של התערובת וודא שהוא בין pH 7.0 ל-7.4. לאחר מכן שפכו בעדינות את תערובת הקולגן של התאים למתחם תבנית הדיור המורכב.

וודאו שאין בועות אוויר בתערובת. תנו לג'ל הקולגן לשבת בטמפרטורת החדר למשך שעה בסביבה סטרילית. לאחר שעה, הסר את צינור הדיור והעביר בזהירות את המבנה למאגר המכיל 35 מיליליטר של מדיום תרבית חם מראש.

דגרו את המבנה במצב אנכי למשך שבוע או שבועיים של התבגרות סטטית. החלף את מדיום התרבות כל יומיים על ידי שאיבת המדיום הישן מיציאת המחיצה התחתונה ומילוי המאגר בכמות שווה של תרבית טרייה. בינוני. אם תרצה, אסוף מיליליטר אחד של מדיום התרבות הישן והטרי בכל חילופי מדיה לניתוח ביוכימי כל שעה במשך 12 השעות הראשונות וכל 24 שעות לאחר מכן.

הסר את המבנה ממדיום התרבית בתנאים סטריליים והנח אותו אורתוגונלית בנתיב של אינטרפרומטר לייזר סורק כדי למדוד את עובי המבנה לאחר שבוע עד שבועיים של התבגרות סטטית. העבירו את הביוריאקטור למכסה המנוע של תרבית תאים והוציאו בעדינות את המבנה מהשדרה שלו. לאחר השחרור, הניחו אותו בצלחת פטרי בקוטר 100 מילימטר המכילה 40 מיליליטר של מדיום תרבית טרי.

לאחר מכן, הגדר בודק מיקרו-מכני המצויד בתא עומס של חמישה עד 10 ניוטון ואחיזות המשתרעות לאמבטיה של PBS שנשמרת ב-37 מעלות צלזיוס. הסר את המבנה מצלחת הפטרי שלו וחבר אותו למכשירי אחיזה מיוחדים לבדיקות אורך ומיועדים להתחבר לחלק הגזה של המבנה מבלי לרסק את הג'ל. השתמש בסרט טפלון כדי למנוע החלקה של התקני האחיזה במהלך הבדיקה.

לאחר מכן הרכיב את המבנה על הבודק המיקרו-מכני. לאחר מכן, בצע בדיקת עייפות בכיוון האורך על ידי מתיחת המבנה תחילה לאורך המד הראשוני שלו והחזקתו שם למשך 10 דקות. לאחר מכן החל 30 מחזורים של מתח מחזורי של 10% בקצב של 5% לשנייה.

הגדל את המתח בצעדים מצטברים של מתח מחזורי של 10% עד שהדגימה לא מצליחה לבצע בדיקות בכיוון ההיקפי. ראשית חתכו את הדגימה למבני טבעת באורך 10 מילימטרים. לאחר מכן הרכיבו את הטבעות על מוטות נירוסטה המשמשים במקום האחיזות.

כמו במבחני כיוון האורך, ראשית, מתחו את המבנה לאורך המד ההתחלתי שלו והחזיקו אותו שם למשך 10 דקות. לאחר מכן, יש למרוח 30 מחזורים של מתח מחזורי של 10% בקצב של 5% לשנייה. לאחר שהמבנה הבשיל והוא הוסר מהשדרה שלו, תקן את המבנה ששני קצותיו למאגר והנח אותו במכלול המאגר.

כפי שמוצג כאן. מלאו את החלק החיצוני של המאגר ב -30 מיליליטר תרבות. בינוני. לאחר מכן, מלאו 75% מנפח התאורה של המבנה בתערובת של חלבונים, ואז סגרו את שני קצוות המבנה.

כדי למנוע דליפה של תמיסת החלבון, הנח את הביוריאקטור בתוך אינקובטור וסובב את הביוריאקטור ב-4.02 כפול 10 ל-5 G השלילי למשך שעה אחת כדי לצפות את פני השטח הלומינליים בחלבונים בזמן ציפוי הלומינל. קצור וריד טבורי אנושי ותאי טיאל שגודלו בטכניקות סטנדרטיות כאשר הם מתכנסים ב-90% Resus משהה את התאים ומשלים את מדיום התרבית M1 99. לאחר מכן, ראה את וריד הטבור האנושי ותאי השתן לתוך לומן המבנה.

עם צפיפות של 1000 תאים לסנטימטר מרובע, סגור את הגפיים העליונות של המבנה כדי למנוע דליפה של תמיסת התא. דגרו את המבנים המתארחים בתרבית הביוריאקטור המסתובב למשך יומיים בסיבוב קבוע של 4.02 כפול 10 לכוח 5G השלילי. במהלך ההתבגרות הסטטית של מבני הכלי, הקוטר החיצוני של מבני העלייה התאית הצטמצם במהירות.

כפי שמוצג כאן, קוטר המבנים ירד ב-60% מערכם ההתחלתי ביום הראשון של התרבית הסטטית. עד היום השביעי, המבנים הפחיתו כמעט 85%הן מחזורי המתח האורכיים והן מחזורי המתח ההיקפי של המבנים עקבו אחר תכונות ויסקו-אלסטיות האופייניות למבנים מבוססי קולגן. בסך הכל, המבנים היו חזקים יותר בכיוון האורך בהשוואה לכיוון ההיקפי באותו טווח מתח, צביעת טריקון מאסן שבוצעה על מבני האנדותל הראתה אנדותל הומוגני ביותר.

תאי שריר חלק הפגינו מורפולוגיה דמוית ציר ונראו מפוזרים באופן הומוגני דרך הדופן בעוד שתאי האנדותל נראו מפוזרים היטב בצד הלומינלי. לאחר התפתחותו. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בביומכניקה ורפואה רגנרטיבית לחקור את ההתנהגות המכנית של רקמות מהונדסות ומקומיות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ניתן להנדס במהירות מבנים של כלי דם ולבסוף להיות חזקים מספיק כדי לטפל בהם ולהשתמש בהם למיזוג מכני בטור דינמי. אנו מקווים שהמאמצים והתוצאות שלנו שכנעו אותך לגבי הפוטנציאל הגבוה של תאים במודל של מטריצה חוץ-תאית להתפתחות רקמות פונקציונליות ביולוגיות.