בידול עצבי של תאי עכבר גזע עובריים בסרום ללא חד שכבתי תרבות
14 במאי 2015
פרוטוקול זה מתאר בפירוט את השיטה ליצירת אבות עצביים מתאי גזע עובריים בשיטה חד-שכבתית נטולת סרום. ניתן להשתמש באבות אלה כדי לגזור סוגי תאים עצביים בוגרים או לחקור את תהליך המפרט העצבי והם ניתנים לקנה מידה של פורמט מרובה בארות עבור סינון מורכב.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לגזור תאי גזע עובריים של עכבר לשושלת עצבית בתרבית תאים בשכבה אחת ללא סרום. דבר זה מושג תחילה על ידי ציפוי כלי התרבית בג'לטין. בשלב השני, תאי הגזע העובריים מופרדים לתליה של תאים בודדים בתווך גזירה ומדוללים לצפיפות הזריעה המתאימה.
בשלב הסופי, התאים נזרעים על פלטה מצופה ב-gel ENC. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה כדי לאשש את הצלחתה של הדיפרנציאציה על ידי ויזואליזציה של סממנים עצביים רלוונטיים. בדרך כלל, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקלו בקשיים, שכן זריעה בצפיפות המתאימה היא קריטית להשגת דיפרנציאציה טובה.
ישנם מספר גורמים המשפיעים על צפיפות הזריעה הן באופן ישיר והן באופן עקיף. לפני זריעת התאים, חממו מנה של 1%gelatin באמבט מים של 37 °C עד להמסה מלאה. לאחר מכן, ערבבו את ה-gelatin עם 500 milliliters של PBS חמים וכסו את תחתית כלי תרבית התאים בכמות מספקת של התמיסה כדי לצפות את הפנימה בזמן שה-gelatin נספג.
שטפו את תרבית תאי הגזע העובריים של עכבר שאינה נמצאת בקונופלואנס (sub confluent) פעמיים ב-PBS. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של ריאגנט לפירוק (dissociation reagent) לתרבית. לאחר שתיים עד חמש דקות, הקישו על הכלי כדי לשחרר את השכבה החד-שכבתית (monolayer) לתליה של תאים בודדים (single cell suspension), ואספו את התרבית לנפח כולל של 10 מיליליטר של מצע וריאגנט לפירוק תאים.
העבירו את התאים למבחנה קונית בנפח 50 מיליליטר והספירו אותם בצנטריפוגה. לאחר שאיבה זהירה של הנוזל העליון (supernatant), השעיקו מחדש את המשקע ב-10 מיליליטר של N2B27 שחומם מראש, על ידי דפיקה קלה של המבחנה כנגד הדופן. כדי למנוע היווצרות בועות, ספרו כעת את התאים, רשמו את הריכוז והשעיקו אותם מחדש ב-N2B27 שחומם מראש, לפי מספר התאים המתאים ליחידת נפח לכל באר, בהתאם לטבלה.
לאחר מכן, שאבו את הג'לטין מכלי התרבית ופזרו את התאים ללא סיבוב של המכל. הניחו את התרביות באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. החליפו את המדיום בכל יום עד יומיים.
עם N2 B27 טרי, התאים יתחילו להבדיל את עצמם ולהפגין ביטוי של Sox1 תוך ארבעה עד שישה ימים. כדי לצבוע את התאים לצורך דימוי באימונופלואורסצנציה, הסר את מצע ההבדלה מהתרביות וקבע את התאים ב-500 µl של 4% Paraformaldehyde. לאחר 15 דקות, שטוף וחלחל את התאים פעמיים עם 2 mL של PBS עם tween. לאחר מכן, חסום קשירה לא ספציפית באמצעות אינקובציה של התאים למשך שעה אחת.
במיליליטר אחד של PBS tween מועשר בסרום, על נדנדה לצלחות (plate rocker), לאחר שטיפת התאים כפי שהודגם כעת. הוסף 500 microliters של mouse IgG נגד beta three tubulin לתרביות, לדגירה לילה שלם על נדנדת הצלחות בטמפרטורה של 4 °C. למחרת.
לאחר שטיפת התאים, דגרו את הדגימות עם נוגדן שני anti-US IgG המסומן פלואורסצנטית בטמפרטורת החדר, בהגנה מאור ובשעקשוק, למשך שעה אחת. שטפו את התאים שוב וצבעו אותם ב-500 microliters של DPI למשך חמש דקות. לבסוף, לאחר שטיפת התאים פעם אחרונה, אחסנו אותם ב-PBS tween למשך עד שבועיים בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius.
עד לצילום. בניסוי זה, נעשה שימוש בתאי גזע עובריים של עכבר עם רפורטר GFP אנדוגני של SOX1 כדי לעקוב אחר דיפרנציאציה עצבית. ביום השישי, התאים קובעו ונצבעו עבור הסמן הנוירונלי beta three tubulin.
בצפיפות האופטימלית, התאים התבדלו לתאי אב עצביים ולנוירונים, בעוד ששימוש בצפיפות גבוהה יותר הוביל לירידה במספר התאים החיוביים ל-SOX1 GFP ול-beta three tubulin. נפח כלי תרבית התאים משפיע אף הוא על צפיפות הזריעה האופטימלית. לדוגמה, תאים הגדלים בלוחית 96 בארות דורשים צפיפות תאים הגבוהה פי 10 בערך מזו.
התאים נזרעו בצלחת תרבית בעלת שישה בארות כדי להגיע לשתי צפיפויות תאים של התמזגות (confluence) אופטימלית. במהלך הגמישה, תאי גזע עובריים משנים בהדרגה את המורפולוגיה שלהם. לדוגמה, בתמונות אלו ניתן להוסיף את המורפולוגיה של התאים והמושבות מהיום הראשון ועד היום השישי לאחר הזריעה בצפיפות תאים אופטימלית.
ביום הרביעי, התאים מתחילים להפוך לתאי אב עצביים, כפי שמעיד הופעתו של אות פלואורסצנציה ירוקה מדוח ה-SOX1 GFP. ועד היום השישי, רוב התאים הם SOX1 חיוביים. עם זאת, קיומם של תאים שאינם עצביים הוא צפוי. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד להתחיל את ההבחנה העצבית של תאי גזע עובריים של עכבר בתרבית תאים בשכבה אחת.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט את ההבחנה של תאי גזע עובריים של עכבר לתאי מוצא עצביים באמצעות שיטת שכבה אחת (monolayer) ללא סרום. גישה זו מאפשרת יצירה של סוגי תאים עצביים בוגרים ומתאימה להרחבה לפורמט של מספר בארות לצורך סריקת תרכובות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- מחקר תאי גזע
רקע
- תאי גזע עובריים יכולים להתמיין לסוגי תאים שונים.
- תאי אב עצביים חיוניים לחקר ההתפתחות העצבית.
- שיטות תרבית נטולות סרום יכולות לשפר את השחזוריות.
- צפיפות זריעה נכונה היא קריטית להצלחת ההתמיינות.
מטרת המחקר
- ביסוס שיטה מהימנה להפקת תאי מוצא עצביים (neural progenitors).
- סיוע בחקר תהליכים של התמיינות עצבית (neural specification).
- אפשרות לסריקה בקיבולת גבוהה (high-throughput screening) של תרכובות המשפיעות על התמיינות עצבית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ציפוי של כלי תרבית בג'לטין.
- יצירת סספנזיית תאים בודדים של תאי גזע עובריים.
- זריעת תאים על גבי פלטות מצופות ג'לטין.
- שימוש במיקרוסקופיה של אימונופלורסצנציה לאישור הצלחת הדיפרנציאציה.
תוצאות עיקריות
- דיפרנציאציה מוצלחת של תאי גזע עובריים לתאי אב עצביים.
- ויזואליזציה של סמנים עצביים מאשרת את הדיפרנציאציה.
- קביעת צפיפויות זריעה אופטימליות לדיפרנציאציה יעילה.
- השיטה ניתנת להרחבה (scalable) עבור יישומים של סריקת תרכובות.
מסקנות
- שיטת השכבה הבודדת (monolayer) ללא סרום יעילה להפקת תאי מוצא עצביים.
- אימונופלורסצנציה היא טכניקה מהימנה להערכתה של דיפרנציאציה.
- ניתן להתאים פרוטוקול זה ליישומים מחקריים מגוונים במדעי המוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר ייצור בר-הרחבה של תאי אב עצביים מתאי גזע עובריים של עכבר במערכת מונושכבה מוגדרת וללא סרום, התומכת בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים ובצמצום סיכונים מכניסטיים בגילוי תרופות למדעי העצבים. השיטה מספקת פלטפורמה כמותית וניתנת לשחזור להערכת השפעות של תרכובות על התמיינות עצבית, ובכך מקלה על זיהוי מובילים (leads) ועל רמת הביטחון החזויה בצינורות פיתוח פרה-קליניים. התאימות שלה עם קווי דגמי דגלים (reporter lines) ופורמטים של תרביות בצפיפות גבוהה מאפשרת שילוב בתהליכי סריקה לבדיקת מודולציה של מסלולים ומחקרי מעורבות מטרה (target engagement).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של מנגנוני התמיינות עצבית ותיקוף תפקודי של יעדים להתפתחות נוירולוגית באמצעות בידול מכוון.
- ערך תפעולי: מספק מערכת מוגדרת ללא סרום המפחיתה שונות ומשפרת את השחזוריות בין ניסויים וקווי תאים שונים.
- ערך ניבוי: תומך בהערכת שינויים הנגרמים על ידי תרכובות ביבול של תאי אב עצביים ובביטוי סמנים, ובכך מספק מידע על מעורבות יעדים וסימון מסלולים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: יוצר אוכלוסייה הומוגנית של תאי מוצא עצביים המתאימה לסריקת תרכובות ולהערכה פנוטיפית של התמיינות עצבית.
- ערך תפעולי: ניתן להתאמה לפורמטים של רב-בארים (למשל 96-well) עם אופטימיזציה ניתנת להרחבה של צפיפות הזריעה, מה שמאפשר יישומים בעוצמה בינונית עד גבוהה.
- מוכנות הבדיקה: תואם לאימונופלואורסצנציה, ציטומטריה של זרימה ומדדים מולקולריים לצורך ניתוח רב-פרמטרי של יעילות ההתמיינות וביטוי סמנים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מאפשרת מעבר מיצירת תאי מוצא עצביים לבשלות של נוירונים וגליות תפקודיים, ובכך תומכת במידול הרלוונטי למחלה.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאפשרת מחקר של מחויבות השושלת ודינמיקה של דיפרנציאציה באמצעות קווי דגלים (למשל, SOX1-GFP) לניטור הספציפיקציה העצבית בזמן אמת.
- תועלת פרה-קלינית: מאפשרת הערכה של השפעות תרכובות על הבשלות העצבית ודיפרנציאציה גליאלית, ובכך תומכת במחקרי פרמקולוגיה של בטיחות ובמחקרי מנגנון פעולה.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי המוקדם, תומכת בתיקוף מטרות באמצעות בחינה מכניסטית של דיפרנציאציה עצבית, ומאפשרת פיתוח של בדיקות (assays) לסריקת תרכובות בפורטפוליו של מדעי העצבים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי מסלולים של התפתחות עצבית ובתיקוף מטרות באמצעות דיפרנציאציה מכוונת ומדדי סמן.
- סריקה: מאפשרת סטנדרטיזציה ושחזור של בדיקות בתרבית מונושכבה, כאשר צפיפות הזריעה מהווה פרמטר קריטי ליצירה עקבית של תאי אב עצביים.
- אנליטיקה: מספקת פלטיים כמותיים באמצעות אימונופלורסצנציה (למשל, SOX1-GFP, βIII-tubulin) וציטומטריה של זרימה למדידת יעילות הדיפרנציאציה והתגובה לתרכובות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין יצירת תאי אב עצביים מוקדמים לבין הבשלה מאוחרת לנוירונים וגליה פונקציונליים, ובכך תומך ברציפות פרה-קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: פרוטוקול מוגדר וניתן להרחבה התומך בשימוש חוזר במספר קווי ESC, כלי תרבית ומסעות סריקה, ובכך מפחית את המאמץ לפיתוח מחדש.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרה על ידי הפחתת עמימות מנגונית במסלולי התמיינות עצבית.
- ערך תפעולי: תנאים סטנדרטיים ללא סרום משפרים את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) בין מעבדות וקווי תאים שונים.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות המשך (go/no-go) על ידי מתן אפשרות להערכה מוקדמת של השפעת תרכובות על מחויבות לשושבת עצבית ויעילות ההתמיינות.
- השפעה על תיק הפרויקטים: תומך בתיעדוף של מטרות במדעי העצבים המותאם לסיכון, באמצעות הפחתת סיכונים מנגונית ותיקוף מסלולים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות תאי גזע, בטכניקות דיפרנציאציה ובמיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה.
- תלוי בגישה לדגרה CO2, צנטריפוגות, מיקרוסקופים וריאגנטים כגון ג'לטין, N2B27, ריאגנטים לפירוק (dissociation) ונוגדנים.
- מחייב סטנדרטיזציה של צפיפות הזריעה ושל נהלי ציפוי הג'לטין בין משתמשים ואתרים שונים כדי להבטיח הדירות (reproducibility).
- התאמה לקווי ESC שונים או לקונסטרוקטים של דוחות (reporter constructs) עשויה לדרוש אופטימיזציה של צפיפות הזריעה ותזמון הדיפרנציאציה.
- מגבלות מעשיות כוללות רגישות לצפיפות הזריעה ואת הצורך בפירוק זהיר של השכבה החד-שכבתיות (monolayer) כדי למנוע התגבשות או השגה לא מלאה של תרחיף תאים בודדים.
