Metaproteomics זרימת עבודה Aquatic מיקרוביאלית: מתאים לtryptic פפטידים מתאימים לניתוח מבוסס ספקטרומטריית מסת טנדם

מטרת הליך זה היא מיצוי של חלבון ו-DNA מביומסה מיקרוביאלית ממי שמים, ולאחר מכן יצירת פפטידים טריפטיים לצורך ניתוח פרוטאומי המבוסס על ספקטרומטריית מסות טנדם. פעולה זו מתבצעת תחילה על ידי ליזיס של תאים שנאספו מבעודם על מסנן מחשבט. השלב השני הוא ריכוז של הליזאט התאי באמצעות יחידות סינון אולטרה-צנטריפוגליות.

בשלב הבא, התסנין מופרד לשני חלקים, אחד להשקעת חלבונים ואחד להשקעת DNA. השלב הסופי הוא ביצוע עיכול של חלבונים באמצעות trypsin בתוך הג'ל (ingel trypsin digestion) ומיצוי פפטידים המתאימים לניתוח באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ומספקטרומטריית מסות בטור (tandem mass spectrometry). בסופו של דבר, ניתן להשתמש בניתוח ביו-אינפורמטיקה עוקב כדי לזהות חלבונים המבוטאים בדגימה, בעוד שה-DNA המבודד יכול לשמש לניתוח מטגנומי ו/או ניתוח של גן 16 S-R-R-N-A.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שניתן לבודד הן חלבון והן DNA מאותה דגימה בו-זמנית. כדי להתחיל, דחפו את תמיסת ייצוב ה-RNA מיחידת מסנן המחסנית אל תוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה בנפח 2 ml, באמצעות מזרק של 60 ml המחובר לקצה ה-lure lock של הצנטריפוגה עם המסנן. סובבו את מבחנת המיקרו-צנטריפוגה בנפח 2 ml למשך 10 דקות ב-17,000 ×g כדי לשקיע שאריות תאיים לאחר הצנטריפוגה. העבירו את העל-נוזל (supernatant) ליחידת מסנן אולטרה-צנטריפוגית של 10 K כדי ללכוד חלבונים המגיעים מתאים שעברו ליזיס מהדגימה.

אין להשליך את המשקע. בצעו סבב צנטריפוגה של יחידת מסנן an ultra centrifugal filter במהירות של 3,270 ×g למשך 30 דקות או עד שהנפח יצטמצם לכ-600 µL. בינתיים, המיסו את קצהו של טיפ P 10 וחסמו את הצד שאינו מסוג lure lock של יחידת מסנן המחסנית באמצעות הקצה הפתוח של הטיפ.

פעולה זו תבטיח ששום תמיסת מיצוי או ביומסה לא ידלפו במהלך השלבים הבאים. יש לתלות את המשקע ב-1 mL של תמיסת מיצוי SDS ולהעבירו בפיפטה אל יחידת מסנן המחסנית המקורית. הדרך הקלה ביותר להעביר נוזלים בפיפטה אל יחידת מסנן המחסנית היא להניח טיפ של P 200 על גבי טיפ של P 1000 ולהשתמש בטיפ כפול זה לצורך הפיפטור. הוסף 1 mL נוסף של תמיסת מיצוי SDS אל יחידת מסנן המחסנית, כך שהנפח הכולל יהיה כ-2 mL.

סרט פאראפילם (Para film). סגרו את קצה ה-lure lock של יחידת מסנן המחט (cartridge filter unit) והכניסו את יחידת מסנן המחט לתוך מבחנה של 50 milliliter. לאחר מכן, הניחו שלושה ניגוני מעבדה מקומטות בתחתית של מבחנה קונית של 50 milliliter.

סגור את המכסה והכנס את המבחנה לתנור ההיברידיזציה לדגירה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר תוך כדי סיבוב. לאחר 10 דקות, הנח את המסנן על צף ספוג ואבטח אותו במקומו באמצעות מזרק של 5 milliliters בקצה ה-lure lock; טען ודגור במקלח מים בטמפרטורה של 95 °C למשך 15 דקות. לאחר מכן, הנח ליחידת מסנן הקרטריג' להתקרר ולהסתובב בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. לאחר הקירור, דחף את תמיסת מיצוי ה-SDS של הליזט התאי מהמסנן באמצעות מזרק של 60 milliliters אל אותה יחידת מסנן אולטרה-צנטריפוגית.

כמו קודם לכן, יש להוסיף מיליליטר אחד של תמיסת מיצוי SDS טרייה ליחידת מסנן המחסנית ולערבב ידנית למשך 30 שניות. לאחר מכן, יש לדחוס את תכולת המסנן אל תוך יחידת מסנן העילטרה-צנטריפוגה באמצעות מזרק של 60 מיליליטר כדי לשטוף ולהבטיח שכל החלבונים הוסרו ונאספו. יש לבצע צנטריפוגה ליחידת מסנן העילטרה-צנטריפוגה למשך 45 דקות ב-3,270 ×g, או עד שהנפח ביחידת המסנן יהיה פחות מ-600 µL.

שפכו את הנוזל שעבר דרך המסנן (flow through) והוסיפו תמיסת מיצוי SDS רעננה ליחידת הסינון האולטרה-צנטריפוגלית. צנטריפוגו את יחידת הסינון למשך 45 דקות נוספות ב-3,270 ×g, וחזרו על שלב זה פעמיים נוספות. ודאו שהנפח הסופי ביחידת הסינון האולטרה-צנטריפוגלית הוא לכל היותר 600 µL בסיום הסבב האחרון.

בנקודה זו, מדדו את נפח התרכז וחלקו אותו לשניים. פракציה אחת תשמש להשקעת DNA והשנייה להשקעת חלבונים. להשקעת חלבונים, הוסיפו ארבעה נפחים של מתנול ואצטון ביחס של 50 ל-50 לנפח אחד של התרכז, ערבבו במכשיר vortex למשך 10 שניות, והדגירו למשך לילה בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס.

למחרת, סובב את התערובת בצנטריפוגה ב-17,000 ×g למשך 30 דקות. לאחר שפיכת הנוזל העליון (supernatant), ייבש את המשקע ב-speed vac למשך שעה אחת. אין לייבש את המשקע יתר על המידה, שכן הדבר עלול להקשות על תהליך הריסספנסיה (resuspension).

שַעֲלֶה את המשקע ב-25 microliters של תמיסת מיצוי SDS. המתן שעה אחת ולאחר מכן השַׁעֶה שוב על ידי פיפוט למעלה ולמטה. בצע SDS page לחלבונים כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב, תוך עבודה בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית כדי למזער זיהומים, וגזור את עודפי הג'ל מתחת לסימון סולם ה-10 kilodalton עבור כל נתיב.

כל נתיב ינותח במכשיר ספקטרומטר מסות טנדם. בנפרד, יש לחתוך כל נתיב לריבועים של מילימטר אחד על מילימטר אחד כדי להגדיל את שטח הפנים, ולהניח את כל הריבועים מאותו נתיב לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה בעלת קישור נמוך (low binding). תוך חזרה על הפעולה עבור כל הנתיבים, ניתן להשתמש ב-1% Acetic acid כדי למנוע מהג'ל להתייבש ולהפוך לקשה לחיתוך.

המשיכו בעיכול טריפסין בתוך הג'ל ובמיצוי פפטידים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, או בהשקעה של DNA בתמיסת מיצוי SDS של הפракציה המרוכזת שתשמש להשקעת ה-DNA עד לסימון של 500 microliter. שלב זה נועד פשוט להגדיל את נפח התמיסה כדי להקל על העבודה. לאחר מכן, הוסיפו 0.583 נפחים של ריאגנט להשקעת חלבונים, כגון MPC protein precipitation reagent, ובצעו ערבוב ב-vortex.

במשך 10 שניות, נוצר משקוף לבן; סבבו בצנטריפוגה ב-17,000 ×g ובטמפרטורה של 4°C למשך 10 דקות. לאחר הצנטריפוגה, העבירו את הנוזל העליון למבחנה אחרת של מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 milliliters והוסיפו 0.95 נפחים של isopropanol; הפכו את המבחנה 30 עד 40 פעמים לפני סבוב בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-4°C במהירות מרבית, ואז שפכו בזהירות והשליכו את הנוזל העליון. לאחר מכן, שטפו את המשקוף פעמיים עם 750 µL של 70% ethanol.

הסיר כמה שיותר אתנול באמצעות פיפטה, ולאחר מכן הנח למשקע להתייבש באוויר. אין לייבש את ה-DNA יתר על המידה, שכן הדבר עלול להקשות על הרסספנסיות לאחר הייבוש. השהה את המשקע ב-25 µL של low T buffer P eight.

כמת את ה-DNA באמצעות ערכה לבדיקת DNA דו-גדילי ובהתאם להוראות היצרן. כמו כן, בצע אלקטרופורזה על ג'ל אגרוז של 3 µL מה-DNA כדי לבחון את איכותו; פפטידים הועברו לניתוח ספקטרומטריה בשרשרת (tandem spectrometry). יותר מ-23,000 ספקטרומים הופקו לכל דגימה, מהם זוהו פפטידים וחלבונים.

ההרכב הטקסונומי והפונקציונלי של המטא-פרוטאומיים נותח באמצעות שילוב של blast P וחבילת התוכנה metagenome analyzer. חלבונים ששויכו ל-alpha proteobacteria היו בעלי הייצוג הגבוה ביותר במערך הנתונים, כאשר הרוב המכריע מהם שוייך לקלד SAR R 11.

גם קלד ה-Roter של Alpha Proteobacteria היה מיוצג מזוהה במידה רבה. לרוב במים השטחיים. חלבונים ששויכו למחלות חיידקיות היו מפוזרים באופן שווה בין השטח לבין מקסימום הכלורופיל, אך חלבונים של חיידקים בעלי שוטה (flagellated bacteria) זוהו במידה רבה יותר במקסימום הכלורופיל.

חלבונים של Gamma proteobacteria היו מפוזרים באופן אחיד לאורך עמוד המים, בעוד שחלבונים של beta proteobacteria נמצאו בעיקר בשכבה העליאית. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בתוך שלושה ימים אם היא מבוצעת כהלכה.