יישום של assay Immunospot לטווח ארוך אינטרפרון-γ התרבותי אנזים צמוד להערכת תגובות תא מפעיל וזיכרון T בבקר

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך הן את תגובות תאי ה-T האפקטורים והן את תגובות תאי הזיכרון באמצעות מבחני נקודת אינטרפרון גמא L מתורבתים לטווח קצר וארוך בהתאמה. הערכת תגובת הזיכרון המרכזית מתבצעת על ידי גידול תאים חד-גרעיניים בדם היקפי של בקר תחת גירוי אנטיגני למשך 13 יום. התרבית ארוכת הטווח מאפשרת לתגובות תאי T אפקטורים להתרחש ולרדת.

אינטרלוקין 2 מתווסף לתרביות לתחזוקת תאי T זיכרון. ביום ה-13, תאים לטווח ארוך מועברים ללוחות נקודתיים L המצופים בנוגדנים ללכידת גמא IFN. התגובה של תאים ארוכי טווח לאנטיגנים מיקובקטריאליים בודדים מוערכת בנוכחות או בהיעדר תאים המציגים אנטיגן אוטולוגי.

נגמ"שים מבודדים מ-p BMCs טריים על ידי היצמדות ביום ה-13. בנוסף, התגובה של pbmc מבודד טרי בתנאי ex vivo מוערכת כמתאם של תגובות אפקטור. במספר מחקרים, הוכח כי תגובת ה-sbot המתורבת ארוכת הטווח של בקר לאנטיגנים מיקובקטריאליים לאחר החיסון נמצאת בקורלציה חיובית עם יעילות החיסון.

כמו כן, תרביות תאי T לטווח ארוך מכילות בעיקר תאי זיכרון מרכזיים הן בבני אדם והן בבקר על מנת לבצע את בדיקת נקודת L בתרבית ארוכת טווח. 60 מ"ל דם נאסף מבעלי חיים נגועים או מחוסנים על ידי צוואר, ניקור ורידים ו-P BMCs מבודדים לפי צפיפות. צנטריפוגה שיפוע.

יש להתאים את ריכוז התאים ל -4 מיליון תאים למ"ל. בשלמות RPMI Media מתחילה בציפוי של 500 מיקרוליטר של אנטיגנים מיקרובקטריאליים, במקרה זה TB 10.4 ואנטיגן 85 A ונגזרת החלבון המטוהר של תרבית em bovis הנקראת PPDB. לאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטר של pbmc מבודד מכל בעל חיים עם ארבעה שכפולים לכל חיה.

שימו לב שיש לעורר את כל הבארות. אין צורך בבקרות כגון אין גירוי או מיטוגנים בשלב זה, דגרו את הצלחת בטמפרטורה הרגילה של 39 מעלות צלזיוס למשך 13 יום. בימים השלישי והשביעי, השליכו 500 מיקרוליטר מכל באר בזהירות כדי לא להפריע לשכבת התאים בתחתית הבארות.

חדש את הנפח עם PMI מלא המכיל IL Two. מניחים את הצלחת בחממה ביום 10, זורקים 750 מיקרוליטר של הסופרנטנט מכל באר ממלאים ב-RPMI מלא ללא כל IL 2 ביום 12, פיפטה וזורקים מ"ל אחד של סופרנטנט מכל באר מחודשת ב-RPMI מלא ללא IL שתיים. הכן גם את לוחית הספוט L לציפוי ב- IFM Gamma לכידת נוגדנים פיפטה ראשונה 15 מיקרוליטר של 35% אלכוהול לכל באר באמצעות צינור רב ערוצי שלב זה מגדיל את הגדרת הנקודה.

שוטפים היטב שש פעמים עם 300 מיקרוליטר PBS. הוסף 100 מיקרוליטר של נוגדן לכידה בשמונה מיקרוגרם למ"ל ב-PBS. יש לבצע פיפטות בזהירות במהלך כל ההליכים, ולא לאפשר לקצות הפיפטות לגעת או לפגוע בקרום בתחתית הבאר, להניח את הצלחת בתוך שקית ניילון ולדגור בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.

ביום ה-13, אספו 60 מ"ל דם על ידי ניקוב וריד נבוב מאותם בעלי חיים שנדגמו ביום הראשון. יש לבודד את ה-pbmc ולהתאים את הריכוז ל-2 מיליון תאים למ"ל. סמן את לוחית הספוט L כראוי עבור כל סט של דגימות.

תאים לטווח ארוך בתוספת APCs תאים לטווח ארוך ללא APCs ותאי ex vivo. השלך נוגדן לכידה מבארות הכביסה של צלחת הספוט של אליס עם 300 מיקרוליטר PBS המכילים טווין. יש לחזור על הפעולה שש פעמים, להשליך, לשטוף נוזל ופיפטה.

50 מיקרוליטר של pBMCs מבודדים טריים לבארות שהוקצו לתאים ארוכי טווח. בנוסף נגמ"שים. חסום בארות אחרות של לוחית הספוט L עם 200 מיקרוליטר לבאר של RPMI שלם כדי להעריך את הפנוטיפ של תאים על ידי ציטומטריית זרימה במקביל ללוחית הבדיקה הנקודתית L.

50 מיקרוליטר של תאים מבודדים טריים בצלחת תחתונה עגולה עם 96 בארות. זוהי בדיקה נלווית שתבוצע בשילוב עם בדיקת הנקודה הצהובה כדי לקבוע את הפנוטיפ של התאים המגיבים. דגרו צלחות למשך 90 דקות בטמפרטורה של 39 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% CO2, מה שמאפשר לתאים המציגים אנטיגן להידבק.

דגרו גם 200 מ"ל של RPMI מלא כדי לחמם אותו במהלך שלב הדגירה הזה של 90 דקות. קצרו את התאים המתורבתים לטווח הארוך מצלחת 24 הבאר. שילוב הכפולים המרובעים מכל חיה לצינור חרוטי יחיד של 15 מיל.

צנטריפוגה את הצינורות למשך חמש דקות ב-400 Gs.השליכו את הסופרנטנט על ידי היפוך צינור, עקרו את כדור התא והוסיפו חמישה מ"ל של PBS השעו בעדינות את הגלולה במידת הצורך. שטפו תאים פעמיים ואז התאימו את ריכוז התאים ל -200, 000 תאים למ"ל. לאחר הדגירה של 90 דקות, קח את צלחת ה- LPO ואת ה- RPMI המלא מהחממה.

מניחים את צלחת ה- LPO על שייקר צלחת למשך 30 שניות. לאחר מכן הסר תאים שאינם נצמדים על ידי היפוך צלחת פיפטה 150 מיקרוליטר לבאר של RPMI שלם חם. לנער את הצלחת ולהשליך נוזל כביסה.

חזור על הפעולה שלוש פעמים, השליך כמה שיותר נוזלים והוסף מאה מיקרוליטר לבאר מכל אנטיגן לבארות המתאימות המכילות נגמ"שים דביקים. לאחר מכן פיפטה 100 מיקרוליטר לבאר של תרחיף תאים מתורבת לטווח ארוך. 200,000 תאים למ"ל לבארות המסומנות כתאים לטווח ארוך בתוספת APCs.

ודאו שהתאים לטווח ארוך שנוספו בשלב זה הם מאותה חיה כמו הנגמ"שים שכבר נמצאים בבאר. אין לערבב APCs ותאים מתורבתים לטווח ארוך מבעלי חיים שונים. כמו כן, פיפטה 100 מיקרוליטר לבאר של תרחיף תאים מתורבת לטווח ארוך בריכוז של 200,000 תאים למ"ל לבארות ללא APCs להערכת תגובות ארוכות טווח.

בהיעדר הצגת אנטיגן, הוסף 100 מיקרוליטר לבאר של תאים לטווח קצר, בתוספת בידוד טרי ומותאם ל-2 מיליון תאים למ"ל להערכת תגובה מחוץ לגוף. אם מבצעים ניתוח ציטומטריית זרימה, יש לשטוף את החלק התחתון העגול 96, צלחת הבאר ולהוסיף את התאים והאנטיגנים הטריים המבודדים לטווח הארוך לבארות בעקבות אותם הליכים. מועסק עבור IFN Gamma LPO plate Incubate Plates למשך הלילה ב-39 צלזיוס בחממה של 5% CO2.

ודא שהצלחות מונחות שטוחות ואל תערום צלחות ביום 14. השליכו נוזלים מבארות ושטפו צלחות שש פעמים עם 300 מיקרוליטר לבאר PBS המכילה טווין מונחים על שייקר הצלחות בכל פעם למשך 10 שניות לפני ובין השטיפות. לאחר מכן יש לשטוף פעם אחת באותו נפח של מים מזוקקים ושש פעמים נוספות עם PBS המכיל טווין.

לבסוף, שטפו תאים פעמיים עם 300 מיקרוליטר לבאר PBS. הסר את נוזל הכביסה על ידי הקשה על הצלחת על מגבות נייר או רפידות סופגות. הוסף 100 מיקרוליטר לבאר של נוגדן זיהוי בחמישה מיקרוגרם למ"ל מדולל ב-PBS עם אלבומין סרום בקר של 1%.

דגרו את הצלחות למשך 120 דקות בחום של 39 צלזיוס. במהלך שלב הדגירה הזה, הכינו את תמיסת הפוספטאז האלקליין מתקן ערכת VTA STAIN A BC AP בהתאם להוראות היצרן 30 דקות לפני השימוש או 90 דקות לאחר הוספת נוגדן זיהוי לבארות. לדלל את המגיב ב-PBS המכיל טווין לאחר דגירה של 120 דקות, להשליך נוגדנים לזיהוי על ידי היפוך צלחת שש פעמים עם 300 מיקרוליטר לבאר PBS המכילה טווין.

הסר את נוזל הכביסה על ידי הקשה על הצלחת על מגבות נייר. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר לבאר של תמיסת פוספטאז אלקליין. דגרו את הצלחות למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.

השליכו את הנוזל ושטפו כל צלחת שש פעמים עם PBS המכיל טווין. הכן את תמיסת המצע ממצע AP הכחול הווקטורי ערכת שלוש בהתאם להוראות היצרן. לדלל את הריאגנטים במאגר טריס HCL מולארי 0.1 ב-pH 8.2.

פיפטה 50 מיקרוליטר מצע D.כל באר דוגרת בטמפרטורת החדר עד שהצבע הכחול מתחיל להתפתח כ-30 דקות. השליכו נוזלים ושטפו צלחות בכמויות גדולות של מים מזוקקים. הסר את הצלחת התחתונה כדי לחשוף את הממברנה, לשטוף את גב הבארות ולאפשר לצלחת להתייבש באוויר.

מדוד את התגובה באמצעות מנתח תמונות נקודה חיסונית או שמור את הצלחות בחושך בטמפרטורת החדר עד למדידת התגובה. בגלל היציבות הגבוהה של איכות מצע התגובה נשמרת למספר שנים. אם מעריכים את הפנוטיפ ותגובת הציטוקינים על ידי זרימה ציטומטרית, בצע הליכי צביעה סטנדרטיים של התאים המצופים בתחתית העגולה 96, ובכן מייצג צלחת TCM בנוכחות או בהיעדר APCs, מוצגות תגובות נקודתיות מאוישות של IFN גמא L מבעלי חיים נגועים ובעלי חיים לא נגועים.

תגובות ספציפיות ל-m bovis מוערכות על ידי PBDB או ESAT 6, CFP 10 גירוי אנטיגני. הכתמים בתחתית הלוחות הם התוצר הצבעוני של בדיקת הכתמים הצהובים. כל נקודה מייצגת בדרך כלל תא מייצר ציטוקינים בודדים, ומספקת מדד כמותי של גמא IFN המייצר תאי T עם תאים מבעלי חיים נגועים.

תגובות נקודתיות ארוכות טווח של IFN גמא L המוצגות כתאים יוצרי כתמים או SFCs מוצגות בבירור מעט עד ללא ייצור גמא IFN בתגובה לגירוי אנטיגן נראה עם תאים מבקר לא נגוע ועם תאים לא מגורים מבקר נגוע או לא נגוע. תגובה חזקה של תאי T צריכה להתרחש בתגובה למיטוגן עשב תקוע כפי שמוצג תגובות TCM ו-ex vivo ל-PPDB ו-ESAT שש. CCFP 10 זוהו מכל בעלי החיים הנגועים ב-3M bovis ותגובות TCM ו-ex vivo מינימליות עד ללא התגלו מחיית הביקורת.

נוכחות של APCs נדרשה לתגובות אופטימליות של TCM על ידי בעלי חיים נגועים, כפי שהוכח על ידי התגובות המופחתות מאוד על ידי תאים ארוכי טווח שגודלו. בהיעדר APCs אוטולוגיים, הוצגו תאים יוצרי כתמים מבעלי חיים נגועים בבוביס ולא נגועים. מספר ה-SFCs מכל חיה חושב על ידי מספר ממוצע של SFCs ב-10 עד שישי תאים בדגימות כפולות בתגובה ל-PPDB פחות התגובה המתאימה למדיה בלבד התגובות השתנו בהתבסס על מצב ההדבקה, נוכחות או היעדר APCs ואורך התרבית, כלומר התרבית לטווח ארוך לעומת תרבית ex vivo.