באתרו איתור של חיידקים בתוך רקמות מוטבעות-פרפין באמצעות DNA בדיקה שכותרת Digoxin מיקוד 16S rRNA

המטרה הכוללת של הליך זה היא למקם חיידקים בתוך רקמות משובצות פרפין באמצעות DIG המסומן 16 s ריבוזומלי, RNA, המכוון לבדיקות DNA. זה מושג על ידי הכנת הגשושית תחילה עם הגברת PCR ותיוג DIG. השלב השני הוא להכין את חלקי הרקמה כך שיהיו להם אתרי יעד נגישים יותר ופחות קשירת רקע.

לאחר מכן, קטעי הרקמה המוכנים מוכלאים עם הגשושית המסומנת בחפירה. לבסוף, הגשושית ההיברידית מזוהה עם פוספטאז אלקליין, המסומן נוגדנים נגד חפירת D. בסופו של דבר, זו בשיטת הכלאה של C 2 יכולה להראות נוכחות של חיידקים עם רקמות משובצות פרפין.

יתרון התחום של זיהוי זה על פני שיטה קיימת כמו ING הוא ששיטה זו יכולה לזהות חיידקים SHS בהקשר של מבנים היסטולוגיים מסוימים. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הפתוגנזה, אך תהיה דלקתית שונה כגון דלקת חניכיים וכוכב לכת R. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה להפעיל את הכנת הרקמות ושלבי העיכול ההיברידיים מכיוון שקטעי הרקמה נפגעים בקלות.

כדי ליצור את בדיקת חיידקי U השתמש בזוג בסיסים של 70, שבר DNA כתבנית ושני פריימרים של 15 זוגות בסיסים כדי להגביר את הגשושית על ידי PCR. אסוף את האמפליקון במאגר בריכוז ידוע. לאחר מכן סמן את הגשושית עם ערכת תיוג וזיהוי DNA חפירה.

ראשית מערבבים שלושה מיקרוגרם של הגשושית ל -15 מיקרוליטר מים. דנטורציה של הגשושית בגוש החום למשך 10 דקות בחום של 95 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הניחו את הגשושית המפוקפקת על קרח.

לאחר מכן, הוסף שני מיקרוליטר של 10 נוקלאוטידים XH, שני מיקרוליטר של DN NTPs ומיקרוליטר אחד של אנזים תעלה. לאחר הערבוב, הניחו לבדיקה לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 עד 48 שעות לאחר מכן. עצור את התגובה על ידי חימום התערובת ל 65 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן מדוד את ריכוז ה-DNA של הגשושית המסומנת ב-260 ננומטר והתאם את הריכוז ל-100 ננוגרם למיקרוליטר. בעזרת הערכה, בדוק תחילה את רגישות הבדיקות על קרום ניילון טען מיקרוליטר אחד של בקרה חיובית מדוללת סדרתית. בדיקה וחפירה עם תווית גשושית.

תן לקרום להתייבש במשך חמש דקות. לאחר הייבוש, טבלו לזמן קצר את הממברנה לשני XSSC ולאחר מכן העבירו אותה לאינקובטור של 80 מעלות צלזיוס למשך שעה. כדי לשתק את ה-DNA לאחר הדגירה, יש להשרות לזמן קצר את הממברנה במאגר חומצה מאלית, ואז להעביר אותה למאגר חוסם מרוכז בנוגדנים מצומדים AP בדילול של 1 עד 5,000 לאחר חצי שעה.

שוטפים את הממברנה ב- MABT. לאחר מכן מערבבים 40 מיקרוליטר של N-B-T-B-C-I-P לשני מיליליטר של מאגר זיהוי. ואחרי האמבטיה, הוסיפו את התערובת הזו לקרום למשך דקה.

לאחר הסרת הפרפין והחזרת הלחות של חלקי הרקמה כמתואר בפרוטוקול הטקסט, הכינו אותם להכלאה של C 2 טבלו תחילה את השקופיות בחומצה הידרוכלורית רגילה למשך 20 דקות. לאחר אמבט החומצה, שטפו את המגלשות במים שטופלו על ידי DEPC למשך 30 שניות. לאחר מכן בעזרת עט שעווה מתאר את הדגימות בכל שקופית.

לאחר מכן, הוסף 50 עד 400 מיקרוליטר של תמיסת פרוטאינאז K לדגימות, תלוי בגודלן. אפשר לאנזים לעבוד במשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן שטוף את השקופיות ב-DEPC שטופל ב-XPBS אחד למשך דקה אחת. כעת העבירו את השקופיות ל-4% אלדהיד פרפורם ב-PBS שטופל ב-DEPC למשך 10 דקות.

שטפו את הקיבוע עם PBS כמו קודם. לאחר מכן רחצו את המגלשות ב-0.1 טריאתנולאמין הידרוכלוריד מולארי ב-pH שמונה עם 0.5% אצטי והידריד לאחר 20 דקות, שטפו את המגלשות במים נקיים כמו קודם. כעת התחל את ה- C two על ידי טבילה ראשונה של השקופיות בשני XSSC למשך 20 דקות.

בינתיים, יש לדלל את הגשושית המסומנת לננוגרם אחד למיקרוליטר במאגר הכלאה לבקרה שלילית. השתמש פי 10 בריכוז של בדיקה שאינה מסומנת. לאחר מכן דנטורציה של הגשושיות על ידי חימום שלהן ב-90 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן קירור מהיר שלהן על קרח.

לאחר מכן, החל את אותו נפח של דילול בדיקה על כל שקופית כמו פרוטאינאז K שהוחל בעבר. לאחר מכן מכסים בזהירות חלקים להחליק ולאטום בעזרת לק. כעת, מחממים את השקופיות על בלוק מכונת PCR ב-90 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ומעבירים אותן לאינקובטור לח של 45 מעלות צלזיוס למשך הלילה למחרת.

מצננים את המגלשות בארבע מעלות צלזיוס למשך חצי שעה, ואז מסירים בזהירות את החלקות הכיסוי. הרקמות שבירות. לבסוף, העבירו את השקופיות דרך סדרה של מאגר SSC בטמפרטורת החדר.

ראשית, שטפו את שתי השקופיות ההיברידיות של NC למשך חמש דקות ב-MABT. לאחר מכן יש למרוח 50 עד 400 מיקרוליטר של תמיסת חסימה ב-1% בין 20 למשך 20 דקות. לאחר דגירה של הבלוק יש למרוח 50 עד 400 מיקרוליטר של אחד עד 1000 נוגדן פוספטאז אלקליין אנטי-D חפירה ותמיסת חסימה.

תן לו להיקשר למשך 90 דקות ב-37 מעלות צלזיוס לאחר מריחת הפריימריז. שוטפים את השקופיות ב-MABT למשך 10 דקות. לאחר מכן, למשך חמש דקות, הכניסו את השקופיות למאגר זיהוי עם 1% בין 20.

כעת יש למרוח 50 עד 400 מיקרוליטר של תמיסת חיץ זיהוי של מילי-מולרית אחת על כל שקופית, ולדגור אותם למשך חמש דקות כדי לנטרל את הפוספטאז האלקליין האנדוגני. לאחר מכן, הוסף 50 עד 400 מיקרוליטר של N-B-T-B-C-I-P מדולל בזיהוי. חוצץ ב-1 עד 100 לכל מגלשה, ותן למגלשות לדגור במשך שעתיים-שלוש בתא לח על סמך ניסיון.

שטפו את השקופיות במי DI, ולאחר מכן מרחו מתיל ירוק ב-0.05% משקל בנפח ותנו לכתם הנגד לעבוד על הרקמה למשך 10 דקות. ב-37 מעלות צלזיוס. שטפו שוב את המגלשות במי DI, ולאחר מכן יבשו אותן עם 100% אתנול, ולאחר מכן טבילה בקסילן.

לבסוף, החל 80 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה והחלקת כיסוי. השקופיות לאחר בדיקות החפירה סומנו. הרגישות שלהם הושוותה לדילול של בדיקת בקרה חיובית.

הגשושית הספציפית של 3 43 זוגות בסיסים p gingivalis הייתה רגישה פי 25 מבדיקת החיידקים המהונדסת של 70 זוגות בסיסים. לאחר מכן יושמו שתי הבדיקות על רקמות חניכיים של חולים עם דלקת חניכיים כרונית בהגדלה גבוהה. ניתן היה להבחין בצורות השונות של חיידקים באמצעות בדיקת החיידקים.

בעוד שהבדיקה הספציפית p gingivalis זיהתה רק חיידקים בצורת מוט, צומת הדוק המשבש את הכימיקל DSS הוחל על רירית החניכיים של עכברים. דגימות רקמה מעכברים אלה שימשו להשוואת הבדיקות בהקשר אחר. כאן, גשושית חיידקי U הצליחה לזהות את החיידקים שהשני לא הצליח.

מכן נבדקה בדיקת חיידק U על יכולתה לזהות חיידקים אחרים בחלקי רקמת ריאה המכילים גידולים. חיידקים התגלו מחוץ לגידול כמו גם בתוך הגידול. בבדיקת רקמות מחולים עם חזזית פלנוס בפה, מחלה של אטיולוגיה לא ידועה, בדיקת החיידקים זיהתה אותות חיידקיים בתוך תאי האפיתל והלמינה פרופריה שבהם נצפתה חדירה דלקתית.

מאז פיתוחה, טכניקה זו סייעה לחוקר בתחום המחלות הזיהומיות לחקור פלישת חיידקים לרקמות בבני אדם ובבעלי חיים כאחד. שיטות אחרות כמו זיהוי אימונוכימי של גידול לסמן תאים יכולות להיות ED על מנת לענות על שאלות נוספות כמו איזה סוג תאים מכילים את החיידקים בתוך הרקמות.