עיצוב ובנייה של תאי מטריקס המלאכותי (aECM) חלבונים מ Coli Escherichia להנדסת רקמות עור

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים את השלבים הכרוכים בבנייה וייצור של חלבוני ECM מלאכותיים או ECM המכיל אלסטין כמו חזרות. זה מושג על ידי בניית גנים רקומביננטיים המקודדים את חלבוני ה-ECM A. לאחר מכן, הגנים הרקומביננטיים מוחדרים למארחי חיידקים.

בשלב זה, החלבונים הרקומביננטיים באים לידי ביטוי במארחי החיידקים ולאחר מכן נקצרים לאחר מיצוי חלבון באמצעות ליזה של תאים. השלב האחרון הוא טיהור החלבונים באמצעות מחזור מעבר הפוך או ITC, המנצל את התנהגות מעבר הפאזה הייחודית של אלסטין. כמו פוליפפטידים.

מחזורי צנטריפוגה נעשים בארבע מעלות צלזיוס ו-37 מעלות צלזיוס. בסופו של דבר, אלקטרופורזה של ג'ל וטכניקות כתמים מערביים משמשות לזיהוי החלבונים הרקומביננטיים ולקבוע את טוהרם. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו עמודות זיקה, הוא שאנו יכולים להפיק כמות גדולה של חלבונים בזול יחסית.

התחל הליך זה עם כל עיצוב הרצועות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר השגת האוליגומרים, יש לחבר את אוליגומרים ה-DNA כדי להשיג את רצף הגנים הרצוי. ראשית ממיסים אוליגונוקלאוטידים של DNA במאגר אוליגו DNA לריכוז סופי של מיקרוגרם אחד למיקרוליטר.

הוסף ארבעה מיקרוליטר מכל רצועה ל-32 מיקרוליטר של DNA ומאגר כריעה כדי להשיג תערובת כוללת של 40 מיקרוליטר. לאחר מכן מרתיחים מים בעזרת פלטה חמה וטובלים את התערובת למשך חמש דקות. בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס, הסר את הכוס וקרר בהדרגה את כל ההתקנה בקופסת קלקר למשך הלילה, האוליגומרים היו כעת כרועים ומוכנים לעיכול.

הוסף את אנזימי ההגבלה המתאימים כדי לעכל את האוליגומרים והווקטורים המארחים בנפרד כמתואר בטקסט תקציר פרוטוקול למשך שלוש עד ארבע שעות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר הפעלת מוצרי העיכול על ג'ל אגרוז וטיהור ה-DNA, שלב את הגן המעניין ברצף על ידי קשירת הכנסת ה-DNA המעוכל לווקטור הפלסמיד עם T ארבע ליגאז. בעזרת המתכון שנמצא בפרוטוקול הטקסט, דגרו את תערובת הקשירה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.

לאחר מכן, הפוך את התאים באמצעות הלם חום מאת עלי. ציטוט של 50 מיקרוליטר של תאים מוכשרים לצינורות מיקרו צנטריפוגות נקיים ומקוררים מראש. פיפטה חמישה מיקרוליטרים מתערובת הקשירה לתוך התאים שמזלפים בעדינות למעלה ולמטה כדי לערבב.

השאירו את התערובת על קרח למשך 20 דקות. לאחר מכן טבלו את צינור המיקרו צנטריפוגה המכיל את תערובת התאים באמבט מים של 42 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות והחזירו לקרח למשך שתי דקות. הוסף 500 מיקרוליטר של מדיה SOC לתוך צינור המיקרו צנטריפוגה ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור למשך שעה.

לאחר הדגירה, מורחים 50 עד 500 מיקרוליטר מתערובת קשירת התאים על צלחת מקדחת YT פעמיים המכילה אמפיצילין שחומם מראש לטמפרטורת החדר. דגרו את הצלחות הפוכות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, בחר מושבות DNA מצלחת המקדחה באמצעות קצות פיפטה נקיים.

גדל את המושבות בחמישה מיליליטר של פעמיים. מדיה YT המכילה אמפיצילין בלילה ב-37 מעלות צלזיוס בלילה עם רעידות למחרת. השתמש בערכת בידוד פלסמיד על פי פרוטוקול היצרן כדי לחלץ את פלסמידי ה-DNA עבור כל מושבה.

נקטף, ה-DNA עם 50 מיקרוליטר מים לאחר הפיכת הפלסמיד הרקומביננטי למארח הביטוי החיידקי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. בחר מושבה מצלחת המקדחה שעברה טרנספורמציה עם חיסון קצה פיפטה. 10 מיליליטר של מרק סטרילי ונהדר או חומר שחפת המכיל גם אנטיביוטיקה אמפיצילין וגם כלורמפניקול במבחנה.

דגרו על תרבית המתנע הזו ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם טלטול ב-225 סל"ד. לאחר מכן העבירו 10 מיליליטר מתרבית המתנע לליטר אחד של מדיה שחפת טרייה וסטרילית. בתוספת אותה אנטיביוטיקה בבקבוק ארלין מאייר בנפח שלושה ליטר.

דגרו על התרבית ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-225 RRP M למשך שעתיים-שלוש. התבונן בצפיפות האופטית של התרבית ב-600 ננומטר או OD 600 כדי לאשר שהיא הגיעה ל-0.6 עד 0.8 על ידי הזרמת מיליליטר אחד של תרבית לתוך וטרינר Q ריק לקריאה. לאחר מכן, גרמו לתרבית עם IPTG לריכוז סופי של מילימולר אחד ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-225 סל"ד למשך ארבע שעות נוספות.

קצרו את התאים על ידי העברת התרבית לצנטריפוגה של ליטר אחד, בקבוקים וצנטריפוגה ב-12,000 גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלכת הסופרנטנט שקלו את כדורי התא והשעו מחדש ב-10 מאגר ב-0.5 גרם למיליליטר. הקפיאו את תרבית התאים המושהה במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

למחרת יש להפשיר את תרבית התאים הקפואים באמבט מים בטמפרטורת החדר או על קרח. ל-L התאים מוסיפים דאוקסי ריבונוקלאז אחד ריבונוקלאז a ופניל מתיל סואן פלואוריד. תוך כדי הפשרת התמיסה, הומוגניזציה של התמיסה תוך ערבוב איטי.

לאחר הפשרת כל התאים המרחפים, התאם את התמיסה ל-pH 9.0 כדי להגביר את מסיסות החלבון במים בזהירות רבה. הוספת שישה N נתרן הידרוקסיד טיפה תוך ערבוב על קרח להשגת עקביות הומוגנית. לאחר מכן כינים את התאים על ידי שיבוש קולי למשך 20 דקות על קרח, באמצעות קצה שטוח בקוטר שני מילימטר ופולס של חמש שניות.

צנטריפוגה את תמיסת התא ב-12,000 גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את הסופרנאט לבקבוק נקי וריק ואחסנו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס לטיהור מאוחר יותר. בינתיים, השעו שוב את כדור התא עם 10 מאגר וחסכו 20 מיקרוליטר של ליזאט התא.

לאפיון דף SDS, הקפיאו מחדש את כדור התא התלוי במינוס 80 מעלות צלזיוס כדי להשלים את ליזיס התאים. חזור על תהליך ההקפאה, ההפשרה והסוניקציה עד שלוש פעמים. לאסוף את הליזאט של התא מקודם ולהמשיך לטהר את חלבוני ה-ECM באמצעות ITC שבו מחזורי צנטריפוגה מבוצעים בטמפרטורות שונות בתנאי מלח גבוהים.

פצלו את הליזאט של התא לצנטריפוגה של 50 מיליליטר, בקבוקים וצנטריפוגה ב-40,000 גרם למשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט על ידי פיפטינג כדי לקבל הפרדה נקייה מהגלולה. אוספים את הסופרנטנט בבקבוקי צנטריפוגות נקיים ומוסיפים נתרן כלורי לריכוז סופי של טוחנת אחת.

מחממים את התמיסה ל-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים עם ניעור ב-225 סל"ד. הצנטריפוגה הבאה. הסופרנטנט ב-40,000 גרם למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר הניקוי, הסופרנטנט מועך את הגלולה באמצעות מרית מתכת ומשעה מחדש את חתיכות הכדור בקרח. מים מזוקקים קרים תוך ערבוב נמרץ למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס באמצעות מוט ערבוב וצלחת מגנטיים עד להמסה מלאה של הגלולה. חזור על מחזורים אלה עד שהכדור ב-37 מעלות צלזיוס לבן, ואז ניתן להמיס אותו במים למשך הלילה ובצנטריפוגה.

כדי להשיג את תמיסת החלבון, יש להמליח את תמיסת החלבון על ידי דיאליזה כנגד מים מזוקקים בארבע מעלות צלזיוס, החלפת המים כל ארבע שעות או שמונה שעות למשך הלילה למשך יומיים-שלושה לאחר שמירת 20 מיקרוליטר מהחלבון המטוהר עבור דף SDS ליופיליזציה של שאר החלבון המטוהר כפי שמוצג כאן. פס חלבון אינטנסיבי נמצא במשקל המולקולרי החזוי בדגימה המושרה. כמו כן מוצג ג'ל דף SDS המכיל דגימת חלבון מטוהרת במשקל מולקולרי של 22 קילודלטון המתאים ללמינין 5 A ECM.

הטוהר המשוער של חלבוני A ECM הוא כ-90 עד 95%ערך זה נגזר על ידי השוואת היחסים בין עוצמות הפס של חלבון המטרה ורצועות חלבון אחרות הקיימות בג'ל SDS. לבסוף, כדי לקבוע אם החלבון המטוהר הוא אכן חלבוני A ECM, בוצע כאן הכתמה מערבית. טוהר החלבון של שלושת חלבוני A ECM מוצג עם ג'ל דף SDS ומושווה לתמונה של קרום הניטרוצלולוז עבור Western Blotting.

הניתוח חושף את נוכחותם של חלבוני המטרה קולגן 4 A ECM, ולמינציה 5 A ECM המתויגים באמצעות נוגדנים אנטי hexa histidine tag מצומדים עם פרוקסידאז צנון סוס. התשואות הסופיות של חלבוני A ECM נעו בין 60 מיליגרם לליטר ל-120 מיליגרם לליטר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לכווץ ולטהר חלבונים המכילים תחומי אור אלסטין עבור היישום הספציפי שלך.