Name: דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של Burnetii Coxiella מוטאנטים טרנספוזון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: חקור שיטות ליצירת מוטאנטים פלואורסצנטיים של Coxiella burnetii וניתוח פנוטיפים של פנימיות, שכפול ורעילות תאית. גלה גנים חיוניים במחזור ההדבקה של הנגיף התוך-תאי הזה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק Avenir/ATIP למתאו בונאצי ומארי קירי CIG (מס' 293731) לאריק מרטינז. המחברים רוצים להודות לד"ר רוברט היינזן על שיתוף הזנים, הנוגדנים והכלים של C. burnetii, וירג'יני ג'ורג'ט וסילבן דה-רוסי (Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier) על הסיוע הטכני וניתוח הנתונים.

<ol><li>Maurin, M., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+microbiology+reviews%22%5BJournal%5D)">Q fever.</a> Clinical microbiology reviews. 12 (4), 518-553 (1999).</li>
<li>Kim, S. G., Kim, E. H., Lafferty, C. J., Dubovi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coxiella+burnetii.+in+bulk+tank+milk+samples%2C+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Coxiella burnetii. in bulk tank milk samples, United States.</a> Emerging infectious diseases. 11, 619-621 (2005).</li>
<li>Kazar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coxiella+burnetii.+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Coxiella burnetii. infection.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1063, 105-114 (2005).</li>
<li>Madariaga, M. G., Rezai, K., Trenholme, G. M., Weinstein, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Q+fever%3A+a+biological+weapon+in+your+backyard%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Q fever: a biological weapon in your backyard.</a> The Lancet infectious diseases. 3, 709-721 (2003).</li>
<li>Der Hoek, W. V. an, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemic+Q+fever+in+humans+in+the+Netherlands%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Epidemic Q fever in humans in the Netherlands.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 984, 329-364 (2012).</li>
<li>Capo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+monocyte+functions+by+Coxiella+burnetii.%3A+impairment+of+the+cross-talk+between+alphavbeta3+integrin+and+CR3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Subversion of monocyte functions by Coxiella burnetii.: impairment of the cross-talk between alphavbeta3 integrin and CR3.</a> Journal of immunology. 163 (11), Baltimore, Md. 6078-6085 (1999).</li>
<li>Martinez, E., Cantet, F., Fava, L., Norville, I., Bonazzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+OmpA%2C+a+Coxiella+burnetii.+protein+involved+in+host+cell+invasion%2C+by+multi-phenotypic+high-content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Identification of OmpA, a Coxiella burnetii. protein involved in host cell invasion, by multi-phenotypic high-content screening.</a> PLoS pathogens. 10 (3), e1004013(2014).</li>
<li>Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Berón, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autophagic+pathway+is+actively+modulated+by+phase+II+Coxiella+burnetii.+to+efficiently+replicate+in+the+host+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+microbiology%22%5BJournal%5D)">The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii. to efficiently replicate in the host cell.</a> Cellular microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).</li>
<li>Newton, H. J., Mcdonough, J. a, Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+protein+translocation+by+the+Coxiella+burnetii.+Dot%2FIcm+type+IV+secretion+system+requires+endocytic+maturation+of+the+pathogen-occupied+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Effector protein translocation by the Coxiella burnetii. Dot/Icm type IV secretion system requires endocytic maturation of the pathogen-occupied vacuole.</a> PloS one. 8 (1), e54566(2013).</li>
<li>Vogel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+a+tiger+into+a+house+cat%3A+using+Legionella+pneumophila.+to+study+Coxiella+burnetii.%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Turning a tiger into a house cat: using Legionella pneumophila. to study Coxiella burnetii.</a> Trends in microbiology. 12 (3), 103-105 (2004).</li>
<li>Van Schaik, E. J., Chen, C., Mertens, K., Weber, M. M., Samuel, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathogenesis+of+the+obligate+intracellular+bacterium+Coxiella+burnetii%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Molecular pathogenesis of the obligate intracellular bacterium Coxiella burnetii.</a> Nature reviews. Microbiology. 11, 561-573 (2013).</li>
<li>Beare, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dot%2FIcm+type+IVB+secretion+system+requirements+for+Coxiella+burnetii+growth+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages.</a> mBio. 2, (2011).</li>
<li>Omsland, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+from+animal+tissue+and+genetic+transformation+of+Coxiella+burnetii.+are+facilitated+by+an+improved+axenic+growth+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii. are facilitated by an improved axenic growth medium.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (11), 3720-3725 (2011).</li>
<li>Beare, P. a, Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Advances+in+genetic+manipulation+of+obligate+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">a Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens.</a> Frontiers in microbiology. 2 (May), 97(2011).</li>
<li>Brodin, P., Christophe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+screening+in+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">High-content screening in infectious diseases.</a> Current opinion in chemical biology. 15 (4), 534-539 (2011).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

המחקר של אינטראקציות המארח / פתוגן הוכיח להיות שיטה יוצאת דופן כדי להבין בזיהומים חיידקיים ולפתח אסטרטגיות חלופיות כדי להתמודד עם מחלות זיהומיות. עם זאת, בשל המגוון של אסטרטגיות הרחיבו על ידי חיידקים פתוגנים שונה, זיהוי והאפיון של גורמים ארסי חיידקים ושל מארח מסלולי איתות שממוקדים בזיהומים מייצגים אתגר אמיתי. זה קורא לפיתוח גישות החדשות לזיהוי בקנה מידה גדולה של רכזות אינטראקציה המארח / פתוגן מפתח. הפיתוח האחרון של, תפוקה גבוהה חדשנית וטכניקות הקרנה גבוהות תוכן מייצג משאב יקר שיכול להיות מותאם למחקר של חיידקים פתוגנים תאית 15. הנה, יש לנו בשימוש burnetii Coxiella פתוגן חיידקי zoonotic כמודל לפיתוח גישות הקרנה המשלבות mutagenesis transposon ומבחני הקרינה מבוססת. Importantly, שיטת הקרנה זו מאפשרת ניטור סימולטני של שלבים מרובים של המחזור תאיים Coxiella, מתן סקירה עולמית של האסטרטגיות שפותחו על ידי חיידק זה לפלוש, לשכפל ולהתמיד בתאים נגועים. הגישה המתוארת כאן מבוססת על שתי טכניקות מבוססות היטב, mutagenesis transposon ומבחני הקרינה מבוסס, שיושמו בהצלחה למחקר של חיידקים פתוגנים. שילוב טכניקות אלה בהקשר של מסכי תפוקה גבוהה / גבוה תוכן מאפשר לנו להעריך את ההשפעות של מספר גבוה של מוטציות חיידקים על ידי ניתוח מספר גבוה מאוד של אירועים (בדרך כלל 15,000 תאים נגועים למוטציות חיידקים הם צילמו וניתחו). זה מספק ניתוח סטטיסטי חשוב של אירועים כגון פלישת חיידקים של תאי מארח ושכפול תאיים, שהם, על ידי הטבע, כפופים לשונות גבוהות. חשוב לציין כי שורות תאים אחרות מאשר EPithelial יכול לשמש לסוג זה של הקרנה. עם זאת, תאי האפיתל שטוחים וגדולים הם אופטימליים לניתוח תמונה כאברונים תא המארח הם קלים יותר לזהות. מכיוון שרוב המיקרוסקופים אוטומטיים באופן אוטומטי יכול להתמודד עם מספר רב של צלחות, יש כמעט אין גבול למספר מוטציות שיכולות להיות מוקרן בו זמנית. בהתאם לפתוגן, זכות פחית משתמשים השימוש בepifluorescence או מיקרוסקופ confocal. זמן רכישה של תמונה יהיה בעיקר תלוי ברגישות של המצלמה מיקרוסקופ, על מספר תחומים שנרכשו בכל טוב ובמספר הערוצים שנרכשו לשדה הראייה. המשתמש יכול להחליט כיצד להתאים גורמים אלה כדי לייעל את פרוטוקול ההקרנה. כדוגמא, אנחנו צילמו צלחת / hr 96-גם אחד באמצעות התנאים שצוינו בשלב 5.1. ניתוח תמונה תלוי במידה רבה במחשב (או המקבץ של מכונות) משמש. אנו משתמשים 12 ליבות (2 x 3.06 GHz 6 ליבות), תחנת עבודה RAM 48 GB. מכונה זו דורשת approxiשלו של הדבר 40 דקות כדי לנתח תמונות שנרכשו מצלחת אחת. היבט חשוב שיש לקחת בחשבון בעת ​​פיתוח מבחני אלה היא ההגדרה של חדש (או אופטימיזציה של קיימים) פרוטוקולים כדי לאפשר המניפולציה ועיבוד של מספר גדול של דגימות. דוגמא טיפוסית היא הפיתוח של הגישה אחת המושבה פריימר PCR, אשר אפשרה לנו להגביר ומהירות שברי רצף ה- DNA המכילים Coxiella האתר של החדרה של כל transposon, מדוגמאות קטנות מאוד. בהתבסס על הניסיון שלנו, פולימראז באיכות גבוהה צריך להיות שנבחר בקפידה ונבדק על מנת לקבל תוצאות לשחזור. המגבלה היחידה של גישה זו עשויה להסתיר בתצפית ש, ברוב המכריע של המקרים, כ -30% מהדגימות מעובד אינם ניצול, או בשל PCR או צעדי הרצף. עם זאת, בהתחשב בכך שהבידוד של מוטציות transposon Coxiella החדשות הוא לא צעד שער הגבלה, זה לא repreנשלח לנושא מרכזי. באופן דומה, הפיתוח של assay אמין לכמת את ריכוז החיידקים של מניות מוטציה היה מפתח לגישה זו. בשל הנטייה של Coxiella כדי לצבור כאשר בהשעיה, השימוש בקריאת צפיפות אופטית אינו ישימה לחישוב הריכוז של תרבויות Coxiella והחלופה היחידה הקיימת היה PCR כמותית (QPCR). כאן, שימוש סוכן intercalating DNA מתויג fluorescently של האיץ באופן משמעותי את quantitation חיידקים. גישה זו יכולה גם לנצל את השימוש בשורות תאי יציבות להביע סמני ניאון לכמה תאים תאיים בהתאם לפתוגן בשימוש. היבט חשוב נוסף הוא השימוש בתרבית תאי תקשורת נטולת פנול אדום. הבחנו כי יש אינדיקטור pH זה הקרינה טבעית המשתרעת הספקטרום האדום וירוק שמרווה את האות נרשמה על קורא הקרינה האוטומטית. Tהוא האסטרטגיה שהוצגה כאן מסתמכת על mutagenesis transposon האקראי. למוטציות של עניין, אנו ממליצים אימות חילופים וייחודיים (וclonality) באמצעות כתם הדרום וamplifications PCR של אתר הכנסת transposon. מלבד הציוד שתואר בסעיף הפרוטוקול, צוותי המעוניינים להשתמש בגישת ההקרנה שהוצגה כאן, ינצלו גדול בהקמה של מסדי נתונים יחסיים לאיסוף נתונים, שרת לאחסון נתונים ותחנת עבודה לניתוח תמונה מהיר. חשוב לציין, בשיטה שתוארה כאן מתאים למחקר של חיידקים פתוגנים תאיים אחרים הניתנת על שיטת mutagenesis אקראית קיימת לפתוגן, יכולות להיות נגועות שורות תאים על ידי פתוגן וזה אחד מציג פנוטיפ ספציפי בזיהום.

החיידק מתעוררים, אנדמי Coxiella burnetii אחראי להתפרצויות גדולות של קדחת Q, zoonosis דמוית שפעת מתישה עם בריאות חמורה והשפעה כלכלית 1. המאגרים העיקריים של Coxiella הם חיות בית ומשק, וההערכה היא כי יותר מ -90% מבקר לחלב בארה&quot;ב לשאת ג burnetii 2. בני אדם הם מארחים מקריים שנגועים על ידי שאיפה של אירוסולים מזוהמים. קדחת Q האנושית באה לידי ביטוי גם כמחלה אקוטית או כרונית, שעשויה להיות לי סיבוכים קטלניים עם שיעור תמותה מגיע 65% 1,3. עם מינון זיהומיות של 1 - 10 אורגניזמים, Coxiella הוא הפתוגן זיהומיות הידועים ביותר והוא נחקר כנשק ביו פוטנציאל 4. ההתפרצות האחרונה הנפץ של קדחת Q בהולנד (2007 - 2010), במקרי הסלמה מ-182 ליותר מ 2,000 בשנה, עומדת כדוגמא לאלימות הקשה של הפתוגן5. היעילות המדהימה של זיהומי Coxiella הוא צפוי הקשורים להתנגדותה ללחץ סביבתי, בשילוב עם ההתאמה הייחודית שלה לארח תאים. ואכן, Coxiella נמצא בסביבה בצורה של גרסאות מטבולית פעילה קטנות תא (SCV), אשר להפליא עמידים במספר תנאים קשים (התייבשות, טמפרטורה, וכו &#39;). SCVs נתפס על ידי תאי phagocytic באמצעות V α β 3 integrins 6 תוך פלישה של תאים שאינם phagocytic מתווכת על ידי ההדבקה / פלישת Coxiella 7 OmpA וקולט עדיין לא מזוהה. בעקבות ספיגה, Coxiella מתגורר בvacuoles ההדוק, חיובי לסמני endosomal המוקדמים Rab5 וEEA1 8. חיידקים להגיב להחמצת endosomal ידי המרה לגרסות מטבולית פעילה גדולות תא (LCVs) והפעלת מערכת דוט / ICM סוג 4 הפרשה (T4SS) 9, הומולוגי מאוד לזה של Legionella pneumophila 10. הפרשת effectors דוט / ICM תאפשר Coxiella ליצור תא גדול, LAMP1 חיובי חומצי המכיל אנזימי lysosomal פעילים בי חיידקים יכולים לשגשג ופעיל בהגנה על תאים נגועים מאפופטוזיס 11. לפיכך, המחזור תאיים של Coxiella נשלט על ידי טרנסלוקציה תיווך ICM דוט / של effectors חיידקי 12, לעומת זאת, גורמי החיידקים מעורבים בפלישת מארח תא, שכפול והפצה של חיידקי הזיהום יישארו במידה רבה לא ידועים. שילוב mutagenesis transposon ומבחני הקרינה מבוססת, אנו מפתחים גישות משוחדת לזיהוי בו זמני של גורמי חיידקים מעורבים בשלבים העיקריים של זיהומי Coxiella: 1) הפנמה בתוך תאי מארח, 2) שכפול תאיים, 3) התפשטות תא אל התא , ו 4) התמדה. עד כה, יש לנו יותר מ -1,000 מטר הוקרנוutations ב500 רצפי Coxiella קידוד, אשר סיפק לנו תובנות חסרות תקדים לתוך אינטראקציות מארח הפתוגן המסדירות פתוגנזה Coxiella 7. ראוי לציין, גישה זו יכולה להיות מיושמת על המחקר של פתוגנים תאיים אחרים שחולקים תכונות ביולוגיה של תא עם Coxiella.

<table><tbody><tr><td>חומצת לימון</td><td>סיגמא</td><td>C0759-500G</td><td>ACCM-2 רכיב בינוני</td></tr><tr><td>נתרן ציטראט</td><td>סיגמא</td><td>S4641-500G</td><td>ACCM-2 רכיב בינוני</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט</td><td>סיגמא</td><td>60218-100G</td><td>ACCM-2 רכיב בינוני</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>סיגמא</td><td>M2670-100G</td><td>ACCM-2 רכיב בינוני</td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>סיגמא</td><td>C5080-500G</td><td>ACCM-2 רכיב בינוני</td></tr><tr><td>ברזל גופרתי</td><td>סיגמא</td><td>F8633-250G</td><td>ACCM-2 רכיב בינוני</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא</td><td>S9625-500G</td><td>ACCM-2 רכיב בינוני</td></tr><tr><td>L-ציסטאין</td><td>סיגמא</td><td>C6852-25G</td><td>ACCM-2 רכיב בינוני</td></tr><tr><td>Bacto Neopeptone</td><td>BD (Beckton-Dickinson)</td><td>211681</td><td>ACCM-2 רכיב בינוני</td></tr><tr><td>חומצות קסמינו</td><td>BD (בקטון-דיקינסון)</td><td>223050</td><td>ACCM-2 רכיב בינוני</td></tr><tr><td>מתיל-B-ציקלודקסטרין</td><td>סיגמא</td><td>C4555-10G</td><td>ACCM-2 RPMI בינוני</td></tr><tr><td>עם גלוטמקס</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td>ACCM-2 RPMI בינוני</td></tr><tr><td>עם גלוטמקס, ללא פנול אדום</td><td>Gibco</td><td>32404-014</td><td>לתרבית תאים וזיהום</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>GE SH30071 בריאות</td><td></td><td>לתרבית תאים</td></tr><tr><td>טריפסין EDTA (0.25%)</td> <td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>לתרבית תאים</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>47036</td><td>לצביעת אימונופלואורסצנציה</td></tr><tr><td>אמוניום כלוריד</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td>לצביעה אימונופלואורסצנטית</td></tr><tr><td>אלבומין בסרום</td><td>בקר Sigma</td><td>A2153</td><td>לצביעה אימונופלואורסצנטית</td></tr><tr><td>קובטה אלקטרופורציה 0.1 ס"מ</td><td>Eurogentec</td><td>ce0001-50</td><td>לטרנספורמציה Coxiella</td></tr><tr><td>חברי מסלול מבריגים צינורות עליונים עם כובעים</td><td>Thermo Scientific</td><td>3741</td><td>2D ברקוד מיקרופלייט</td></tr><tr><td>96 בארות עם קירות שחורים ותחתית</td><td>גריינר</td><td>655076</td><td>תחתית כהה שטוחה, לכימות dsDNA</td></tr><tr><td>96 בארות PCR מיקרו-פלטה</td><td>Biorad</td><td>2239441</td> צלחת 96 בארות <td>ללא DNAse/RNAse</td></tr><tr><td>, Deepwell</td><td>Labcon</td><td>949481</td><td>לזיהומים מוטנטיים Coxiella</td></tr><tr><td>PicoGreen</td><td>Life Technologies</td><td>P7581</td><td>לכימות dsDNA</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284-500ML</td><td>לכימות dsDNA</td></tr><tr><td>Phusion פולימראז DNA בנאמנות גבוהה</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0530L</td><td>ליחיד פריימר מושבה PCR</td></tr><tr><td>Celltracker אדום CMTPX</td><td>Life Technologies</td><td>C34552</td><td>להדמיה</td></tr><tr><td>נוגדן Anti-LAMP1</td><td>Sigma</td><td>94403-1ML</td><td>לצביעה אימונופלואורסצנטית</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>L1418</td><td>להדמיה</td></tr><tr><td>קורא מיקרופלייט פלואורסצנטי אינסופי 200 Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אפיפלואורסצנציה מיקרוסקופ אוטומטי Cellomics</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; burnetii coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

פלישה והתישבות של תאי מארח על ידי חיידקים פתוגנים תלויה בפעילות של מספר רב של חלבוני פרוקריוטים, שהוגדר כגורמים ארסי, שיכול לערער ולשנות פונקציות מארח מפתח. המחקר של אינטראקציות המארח / פתוגן לכן חשוב מאוד להבין זיהומים חיידקיים ולפתח אסטרטגיות חלופיות כדי להתמודד עם מחלות זיהומיות. גישה זו לעומת זאת, דורשת הפיתוח של מבחני תפוקה גבוהה החדשים לזיהוי משוחד, אוטומטי והאפיון של גורמי אלימות חיידקים. כאן, אנו מתארים שיטה לייצור ספריית מוטציה מתויג GFP ידי mutagenesis transposon ופיתוח גבוה הקרנת תוכן גישות לזיהוי בו זמני של פנוטיפים הקשורים transposon מרובים. מודל העבודה שלנו הוא burnetii תאית חיידקי Coxiella הפתוגן, סוכן etiological של קדחת Q zoonosis, אשר מזוהה עם seVere התפרצויות עם בריאות כתוצאה מכך וניטל כלכלי. הטבע תאיים לחייב של הפתוגן זה, עד לאחרונה, הקשה מאוד על זיהוי של גורמי חיידקים מעורבים באינטראקציות הפתוגן מארח, מה שהופך את של Coxiella המודל האידיאלי ליישום תפוקה גבוהה / גבוה תוכן גישות.

עם הבידוד של מוטציות transposon, המושבה פריימר היחידה PCR הוא שיטה לזיהוי האתר של הכנסת transposon לכל מוטציה חזקה, תפוקה גבוהה. גישה זו נובעת מפרוטוקול PCR מקונן טיפוסי אבל כאן פריימר יחיד hybridizes ו / או שאינו ספציפי במיוחד לתבנית ה- DNA בהתאם לחומרה של חישול בטמפרטורה (איור 1 א). מוצרי ה- PCR הטיפוסיים מורכבים ממספר רב של שברי ה- DNA, שרובם ספציפיים (איור 1). השימוש בפריימר רצף שונה שanneals תקין במעלה הזרם של ITR transposon, ומורד זרם של הרצף מוכר על ידי פריימר ההגברה מספק סגוליות לצעד הרצף (איור 1 ג). תוכנה אוטומטית לניתוח רצף מיישרת את הרצפים שהתקבלו לגנום Coxiella מתן האתר של הוספות transposon (איור 1 ג) המדויק. כל הוספות transposon יכולות להיות אז אןotated על הגנום Coxiella (1D איור). כל מוטציה Coxiella מבודדת ומוגברת axenically בACCM-2 בינוניים לפני או אחסון או הקרנה. איור 2 מדגים דוגמא של 38 מוטציות transposon בנקודת 16 / גני Coxiella ICM (איור 2 א). כדי להעריך את הכדאיות של מוטציות Coxiella, עקומות גדילת axenic מתקבלות על ידי דגימת תרבויות חיידקים למשך 7 ימים לאחר חיסון ויישום assay ריכוז החיידקים מתואר ב1.5 (Figurie 2B). אז מוטציות מוגברות מודגרת עם תאי אפיתל, ב96-גם צלחות בשלושה עותקים למשך 7 ימים. כל מוטציות Coxiella נוצרו להיות מתויג GFP, עקומות גדילה תאיות מתקבלות על ידי מדידת עוצמת הקרינה GFP של כל טוב, בכל שעה 24, וקשירת קשר לערכים שנמדדו כפונקציה של זמן (איור 2 ג). Intrעקומות גדילה תאיות לספק ניתוח כמותי של פנוטיפים הקשורים כל הכנסת transposon בגנום Coxiella. כדי להוסיף מידע איכותי על אותו מוטציות transposon, בחרנו לרכישת תמונה אוטומטית וניתוח. שבעה ימים שלאחר זיהום, צלחות קבועות, מעובד לimmunofluorescence כמתואר ב 4 ונותחו באמצעות מיקרוסקופ, כמתואר ב5. תוכנת ניתוח תמונה אוטומטית כגון CellProfiler (Broad Institute, אוטומטי, epifluorescence <a href="http://www.cellprofiler.com/" target="_blank">www.cellprofiler.com)</a> מעבד את הערוצים שנרכשו באופן עצמאי ומגזרים מזוהים אובייקטים לניתוח השוואתי (איור 3). זה מאפשר זיהוי ואפיון מורפולוגי של גרעיני מארח תא, קווי המתאר תא, lysosomes ומושבות Coxiella (איור 3 פנלים העליונים). התאמת מושבות Coxiella עם תאים ומאפשר lysosomes identificatiובניתוח צורני ספציפי של vacuoles המכיל Coxiella (שהם LAMP1 החיובי, איור 3 פנל שמאלי תחתון). התאמת מושבות Coxiella עם קווי המתאר תא מארח מאפשר זיהוי וניתוח צורני ספציפי של תאים נגועים (איור 3 פנל מרכז תחתון). לבסוף, 4 הערוצים ימוזגו להמחשה ולמטרות בקרת איכות (איור 3 פנל ימני תחתון). נתונים שהתקבלו מניתוח תמונה אוטומטית ניתן להתוות אחד נגד השני כדי להשיג &quot;מגרשי פיזור רב פנוטיפי&quot;. כדוגמא, באיור 4 א השטח הממוצע (במיקרומטר 2) של מושבות Coxiella זממו נגד מספר מושבות לכל תא (איור 4 א), על מנת לזהות מוטציות המשפיעות על שכפול תאיים של Coxiella (פנוטיפ שכפול) ו / או היכולת של חיידקים לפלוש תאי מארח (internaפנוטיפ lization). ניתוח סטטיסטי המשמש להגדרת אזורים בעלילת פיזור וכתוצאה מכך המתאימה ולחמור (Z-ציון ≤ -4) פנוטיפים קלים (Z-ציון ≤ -2 -4 &lt;). מוטציות נצפו ב 3 אשכולות עיקריים: מוטציות שגרמו לצמיחה תאית פגומה של Coxiella קובצו בחלק השמאלי ביותר של העלילה (איור 4 א, ​​ורוד ונקודות אדומות); מוטציות שהשפיעו על הפנמת Coxiella בתאים קובצו בחלק התחתון של העלילה (איור 4 א, ​​נקודות אור והצבע כחולים כהה) ולבסוף, נקודות ירוקות בימני ביותר באזור של העלילה מתאימות למוטציות וכתוצאה מכך פנוטיפים שאינם משמעותיים ( Z-ציון&gt; -2). חשוב לציין, מוטציות שאינן מצליחין לשכפל אבל עדיין מסוגל לפלוש לתאי מארח, מזוהות לאחר 7 ימים של זיהום חיידקים בודדים, או מושבות קטנות, סמוכים לארח תא גרעינים (איור 4C, פנל שני). לפיכך, קולו הגודל של Coxiella &quot;nies &quot;יושפע באופן משמעותי, אך מספר התאים נגועים לא להשתנות בהשוואה לתאי -infected WT Coxiella. להיפך, מוטציות המשפיעות על היכולת של Coxiella לפלוש תאי מארח לגרום לירידה במספר מושבות / תא. כאשר מספר זה הוא נמוך משמעותי 1, הוא מציין כי, בממוצע, יש ירידה במספר הכולל של תאים נגועים. לחלופין, השטח הממוצע (במיקרומטר 2) של מושבות Coxiella ניתן להתוות נגד מספר תאי מארח שרדו זיהום (איור 4), לזהות מוטציות המעניקות רעיל לCoxiella (פנוטיפ ציטוטוקסיות). כאמור לעיל, ניתוח סטטיסטי המשמש להגדרת אזורים בעלילת פיזור וכתוצאה מכך המתאימה ולחמור (Z-ציון ≤ -4) פנוטיפים קלים (Z-ציון ≤ -2 -4 &lt;). רוב הוקרן מוטציות לא השפיעו באופן משמעותי הישרדות תא, ללא קשר לשכפול חיידקים בתוך מארחתאים (נקודות ירוקות איור 3). 37 מוטציות הישרדות תא מארח מושפעת במתינות (איור 3, נקודות אדומות אור), ו- 7 מוטציות היו הרסניות, במיוחד לארח הישרדות תא (איור 3, נקודות אדומות כהות). שים לב שפרמטרים נוספים שהושגו על ידי הליך ניתוח תמונה האוטומטי יכולים לשמש כדי להפיק תרשימים אחרים, בהתאם לצרכי ניסוי. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" width="700" /> איור 1:. המושבה פריימר יחידה רצף וביאור של מוטציות transposon Coxiella () PCR משמש כדי להגביר קטעי DNA המכילים את האתר של הכנסת transposon. פריימר הגברה (AMP) משמש גם כפריימר ספציפי ולא ספציפי, בהתאם לחומרה של חישול בטמפרטורה. תוצאה אופיינית של המושבה פריימר היחידה PCR (B). כל Reactiבמייצר מספר שברים בגודל משתנה, שחלקם מכילים את אתר הכנסת transposon; כמה אחרים הם מוגברים באופן אקראי כתוצרי לוואי של מחזור PCR חומרה הנמוכה. (ג) השימוש בפריימר רצף (Seq) שhybridizes לרצף transposon מאפשר הרצף של שברים של עניין. תוכנת ניתוח (ד &#39;) רצף מאפשרת ביאור האוטומטי של הוספות transposon על הגנום של החיידקים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" width="700" /> איור 2:. Axenic וצמיחה תאית של מוטציות transposon Coxiella (א) במסך הטייס, יש לנו מבודד, רצף והוקרנו 38 מוטציות transposon בגרם ליבה 16Enes של מערכת הפרשת הנקודה / ICM Coxiella (מצויינים באדום). (ב) על מנת להעריך את הכדאיות של כל מוטציה transposon, הצמיחה של כל הבודד במדיום תרבות axenic מנוטר על 8 ימים באמצעות מתויג fluorescently סוכן intercalating DNA. (ג) כל מוטציה משמשת אז כדי להדביק תאי אפיתל. כtransposon בעל קלטת GFP, התפתחות חיידקים תאית היא פיקוח על 7 ימים של זיהום על ידי ביצוע השינויים של הקרינה GFP קשורה לשכפול Coxiella, באמצעות קורא microplate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" width="700" /> איור 3: אוטומטי ניתוח תמונה של זיהומי Coxiella אוטומטי.מיקרוסקופ epifluorescence הזדווגו משמש לתמונה 21 עמדות בכל טוב של 96-גם צלחות בשלושה עותקים. מגזרי תוכנת ניתוח תמונת אובייקטים בכל ערוצים שנרכשו לכימות וניתוח. בכל המקרים, חפצים נוגעים בגבול של התמונות אינם נכללים. () ערוץ Hoechst משמש לזיהוי גרעין תא מארח (מוקף בעיגול ירוק). (ב) אלה משמשים כגרעינים לזהות קווי המתאר תא מארח בערוץ Cy3 (העמדה של גרעינים היא בעיגול כחול, קווי המתאר תא נמצאים בירוק). (C) ערוץ Cy5 משמש לזיהוי תאי LAMP1-חיובי (בעיגול ירוק); רק האובייקטים כלולים בקווי מתאר התא זוהה בעבר (באדום) נשמרים לניתוח תמונה. ערוץ ה- GFP (ד) משמש לזיהוי מושבות Coxiella (מוקף בעיגול ירוק). (ה) התאמת מושבות Coxiella עם תאי LAMP1 חיובי מאפשרת זיהוי של Coxiella </em&gt; Vacuoles המכיל (CCVs); רק האובייקטים הכלולים בקווי מתאר התא זוהה בעבר (בירוק) נשמרים לניתוח תמונה. (F) התאמת מושבות Coxiella עם קווי המתאר תא מאפשר זיהוי של תאים נגועים (pseudocolored). תמונות (G) שנרכשו בערוצי הקרינה 4 (המקביל למושבות Coxiella (ירוק), גרעיני תאי מארח (כחול), קרום פלזמה תא מארח (אפור), תאי LAMP1-חיובי (אדום)) ימוזגו ומשמש להמחשה ואיכות שליטה. בקנה מידה מונעת 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" width="700" /> איור 4: זיהוי בקנה מידה גדולה של גורמים המעורבים בCoxiella מארח / אינטראקציה הפתוגןהשטח הממוצע (במיקרומטר 2) של מושבות Coxiella זממו נגד המספר היחסי של מושבות לכל תא יונים. (א), לזהות פנוטיפים שכפול והפנמה של עניין. נקודות ירוקות מייצגות פנוטיפים שחורגים מWT Coxiella על ידי Z-ציון&gt; -2 (לא משמעותי). ורוד ונקודות בצבע תכלת מייצגים פנוטיפים שכפול והפנמת בהתאמה, עם Z-ציון בין -2 ו -4 (פנוטיפים קלים). אדום ונקודות בצבע כחולות כהות מייצגים פנוטיפים עם ≤ Z-ציון -4 (פנוטיפים חזקים). השטח הממוצע (במיקרומטר 2) (ב) למושבות Coxiella היה זמם נגד המספר הכולל של תאים (נגוע ולא נגוע) ששרדו 7 ימים של זיהום להעריך את ההשפעה הרעילה לתאים וכתוצאה מהוספות transposon. נקודות ירוקות מייצגות פנוטיפים שחורגים מWT Coxiella על ידי Z-ציון&gt; -2 (לא משמעותי). נקודות הוורודות מייצגות ph ציטוטוקסיותenotypes עם Z-ציון בין -2 ו -4 (פנוטיפים קלים). נקודות אדומות מייצגות פנוטיפים ציטוטוקסיות עם ≤ Z-ציון -4 (פנוטיפים חזקים). חצים מצביעים על מוטציות מאוירות על ידי האות קטנה המקבילה בג (ג) נציג תמונות של שכפול, הפנמה ופנוטיפים ציטוטוקסיות. בכל המקרים, גרעיני תא מארח הם באדום, מושבות Coxiella נמצאות בירוק. בקנה מידה מונעת 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

burnetii Coxiella הוא חיידק גראם שלילי תאיים לחייב אחראי לקדחת Q המחלה zoonotic. כאן אנו מתארים שיטות לדור של מוטציות transposon ניאון Coxiella כמו גם זיהוי האוטומטי וניתוח של פנוטיפים הפנמה, שכפול ורעיל לתאים וכתוצאה מכך.

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות בקנה מידה רחב את גורמי ה-COE המעורבים בשלבים מרכזיים של מחזור ההדבקה, כולל חדירה לתאי המאכסן, יצירה של נישה לשכפול חיידקי והישרדות. דבר זה מושג תחילה על ידי יצירת ספריית מוטנטים משולבת של GF PT באמצעות מוטגנזה של טרנספוזון.בשלב הבא, מדביקים את תאי המארח בכל אחד מהמוטנטים שבודדו. לאחר מכן, עוקבים בזמן אמת אחר השכפול התוך-תאי של כל מוטנט באמצעות קורא מיקרו-פלייט (microplate reader), וזאת כדי לזהות את המוטציות שפוגעות בצורה המשמעותית ביותר בזיהום ה-coxiella. לבסוף, התאים המודבקים ב-coxiella נסרקים באמצעות מיקרוסקופיה אוטומטית.בסופו של דבר, ניתוח תמונה אוטומטי מאפשר אפיון מורפולוגי של כל פנוטיפ שהתקבל, כדי לקשר כל גן מוטנטי לתפקוד משוער במחזור ההדבקה של ה-coxiella. שיטה זו יכולה לסייע בטיפול בסוגיות מרכזיות בתחום האינטראקציות בין מאחס לפתוגן, כגון זיהוי רחב-היקף של הגנים החיוניים של פתוגן נתון הדרושים לאינטראקציה עם התא השלם ולניצול המכניקה המולקולרית שלו לטובתו. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כיוון שהרישוע על מצע והבידוד של מושבות COE הם קשים להשגה.למעשה, COE יוצרות מושבות קטנות מאוד שיש לחלץ בזהירות מ-ACCM רך לאחר יומיים. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי זיהום מעבדתי של קוקים. ניתן ליישמה גם על חיידקים פתוגניים תוך-תאיים אחרים כגון salmonella, brucella, mycobacterium וכדומה.לאחר טרנספורמציה של חיידקי coxiella קומפטנטים עם פלסמידים של טרנספוזון וטרנספוזאז בהתאם לפרוטוקול הכתוב, כדי לבודד מוטנטים בודדים, הכינו אגר תחתון על ידי ערבוב של 10 מיליליטר של אגר 0.5% מומס עם 10 מיליליטר של accm 2X בתוך תא בטיחות מיקרוביולוגי (MSC), והוסיפו את האנטיביוטיקה המתאימה; שפכו מיד לתוך צלחת פטרי והניחו לה להתקרר ללא מכסה במשך 30 דקות, ולאחר מכן ייבשו באוויר במשך 20 דקות. להכנת אגר עליון, ערבבו 1.25 מיליליטר של accm 2X עם 0.75 מיליליטר של מים בתוך מבחנה פוליסטירן של 15 מיליליטר. הוסיפו את האנטיביוטיקה המתאימה והדגירו בטמפרטורה של 37 °C.לאחר מכן, הוסיפו 1 עד 100 µL של תרבית חיידקים וערבבו ב-vortex למשך חמש שניות. לאחר מכן, הוסיפו 0.5 mL של תערובת aros מומסת ושפכו מיד מעל שכבת ה-aros התחתונה. הניחו לצלחת להצטנן במשך 20 דקות.הניחו את המכסה מעל והדגירו בטמפרטורה של 4 °C למשך 20 דקות כדי לסייע בהתמצקות. לאחר מכן, הסירו את המכסה והניחו לצלחת להתייבש באוויר למשך 20 דקות לפני ההעברה לאינקובטור לח עם טמפרטורה של 37 °C, 5% carbon dioxide ו-2.5% oxygen למשך שישה עד שבעה ימים. ברגע שמושבות ניתנות לזיהוי, אספו אותן על ידי חיתוך קצה של טיפ פיפט של 1 mL והשתמשו בו כדי לבודד פלאגים המכילים מושבות בודדות.לאחר מכן, העבירו אותם לבבאירי של פלטת 24 בארות המכילה 1.5 milliliters של accm two. לאחר הכנת עקומי סטנדרט, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, כמתו כל תרחיף חיידקים על ידי חלוקה של 5 µL של 10% Triton X 100 לכל באר. במיקרופלטה בעלת 96 בארות עם דפנות ותחתית שחורות, הוסיפו 50 µL מהתרחיפים החיידקיים לכל באר והדגירו על מערער פלטות למשך 10 דקות.בטמפרטורת החדר, השתמשו בבופר XTE אחד כדי לדלל את ריאגנט הכמותיות של DNA דו-גלול ביחס של 1 ל-200, והוסיפו 55 µL מהריאגנט המדולל לכל דגימה. במיקרו-פלטה בעלת 96 בארות עם ניער פלטות (plate shaker), ערבבו היטב לפני דגירה בחושך ובטמפרטורת החדר למשך שתיים עד חמש דקות, ומדדו את הפלורסצנציה של הדגימות באמצעות קורא מיקרו-פלטות פלורסצנטי ומסננים לאורכי גל סטנדרטיים של פלואורסצאין. כדי להפיק את גרף ריכוז ה-DNA הבקטריאלי, חלקו את קריאות הפלורסצנציה בעקומת הסטנדרט שהוכנה מראש את ריכוז ה-DNA במסה של גנום coxiella כדי לקבל את הריכוז הבקטריאלי.הביע את התוצאות בשווה ערך גנומי למילליליטר לאחר ביצוע PCR של מושבות עם פריימר בודד וריצוף DNA בהתאם לפרוטוקול הכתוב. באמצעות תוכנה לניתוח רצפים, טען את הגנום המלא והמאושר של Coxiella Burnett I 4 93 NM one באמצעות פונקציית ההשוואה לרצף ייחוס (align to reference), טען והשווה את תוצאות הרצף באמצעות blast N וקבע את אתר הטרנספוזיציה. לאחר הכנת תרחיף תאי Vero בריכוז 10⁵ תאים למילליליטר במדיום RPMI, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, חלק 100 µL מהתרחיף לכל באער של פלטת 96 באערים שחורה בעלת תחתית שטוחה ושקופה, סבב את הפלטה בצנטריפוגה במהירות 400 ×g בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות, ודגור ב-37 °C וב-5% carbon dioxide למשך הלילה.ביום למחרת, השאר בטמפרטורה של החדר פלטות של 96 בארות המכילות את מוטנציות ה-Coxiella, ודלל 150 µL של תרחיפי חיידקים ב-300 µL של RPMI ללא phenol red ו-FBS בפלטת 96 בארות עמוקה. לאחר מכן, הסר את המצע מתאי ה-Vero והעבר 100 µL לכל בארה של מוטנציות Coxiella מדוללות. השתמש בבאר A1 כביקורת שלילית ובבארות A2 ו-A3 כביקורות חיוביות. באמצעות מחזיק פלטות לצנטריפוגה אטום לארוסול, סובב את הפלטה ב-400 ×g ובטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן, לאחר דגירה של הפלטה ב-37 °C באטמוספירה לחה של 5% CO2 למשך שעתיים, החלף את המצע המכיל את החיידקים ב-100 µL לכל בארה של מצע RPMI מלא וטרי. השתמש בקורא מיקרופלטות פלואורסצנטי עם מסננים עבור fluorescein.מדדו פלואורסצנציית GFP מדי יום במשך שבעה ימים. ביום השביעי לאחר ההדבקה, הסירו את המצע מהפלטה והחליפו אותו ב-50 microliters לבאר של מצע מלא טרי המכיל דילול של 1:1000 של צבע פלואורסצנטי חודר-תאים. דגרו את התאים במשך 30 עד 60 דקות; לאחר הדגירה, החליפו את המצע ב-50 microliters לבאר של 4%PFA ב-PBS ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, הסירו את הבאפר המכיל PFA ושטפו את הבארה שלוש פעמים באמצעות PBS. לאחר הסרת השטיפה האחרונה, העבירו 50 microliters של תמיסת חסימה לכל באר ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.לאחר מכן, החליפו את תמיסת החסימה ב-40 µL לבאר של תמיסת חסימה רעננה ובדילול של 1:500 של נוגדן anti lamp one. לאחר דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, הסירו את התמיסה והשתמשו בשוטת פלטות כדי לשטוף את הבארים חמש פעמים באמצעות 100 µL לבאר של PBS. לאחר מכן, הוסיפו 40 µL לבאר של תמיסת חסימה המכילה את הנוגדן המשני הפלואורסצנטי המתאים ו-hooked 3 3 2 5 8 בריכוז של 5 µg/mL.הדגירה תתבצע בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. יש לשטוף את הדגימות חמש פעמים ולהשאיר את שטיפת ה-PBS האחרונה בבארים כדי למנוע מהן להתייבש. לצורך רכישת תמונות, השתמשו במיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי-מואר (epi fluorescence) אוטומטי המצויד בעדשה עם הגדלה של 20 x ובערוצים של 348, 488, 550 ו-615 ננומטר.רכשו 21 שדות עצמאיים לכל באר על מנת לדגום לפחות 5,000 תאים לדגימה. בצעו מיקוד אוטומטי באמצעות ערוץ גרעיני התאים המארחים כנקודת ייחוס. לבסוף, השתמשו בניתוח תמונות אוטומטי כדי להסיק מספר מאפיינים רלוונטיים מהתמונות שנרכשו.איור זה ממחיש 38 טרנספוזונים במוטנטים ב-16 נקודות ICM Coxe L ב-Genes; עקומות גדילה המעריכות את חיוניות המוטנטים מוצגות כאן. עקומות גדילה תוך-תאיות עבור מוטנטים של coxiella שגודלו עם תאי אפיתל מספקות ניתוח כמותי של הפנוטיפים הקשורים להכנסות טרנספוזונים בגנום של coxiella. באיור זה, בוצעו רכישת תמונות אוטומטית כדי לזהות ולאפיין גרעיני תאי מאחסן, קווי מתאר של תאים, ליזוזומים ומושבות coxiella.המתאם בין מושבות coxiella לתאים וליסוזומים מאפשר ניתוח מורפולוגי של ואקואולות המכילות coxiella. התאם בין מושבות coxiella למתוואי תאי המאכסן מאפשר ניתוח מורפולוגי של תאים מזוהמים. לבסוף, ארבעת הערוצים ממוזגים.השטח הממוצע של מושבות coxiella ממופה אל מול מספר המושבות לתא, וזאת כדי לזהות מוטציות המשפיעות על השכפול התוך-תאי של coxiella ו/או על יכולת החיידקים לפלוש לתאי מאח$. מוטנטים נצפו בשלושה אשכולות: מוטציות שהשפיעו על הצמיחה התוך-תאית של coxiella, פנימיות (internalization) של coxiella בתאים, ופנוטיפים שאינם משמעותיים. כאן, השטח הממוצע של מושבות coxiella ממופה אל מול מספר תאי המאח ששרדו את הזיהום, כדי לזהות מוטציות המקנות ל-coxiella ציטוטוקסיות לאחר התפתחותה.טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הזיהומים החיידקיים לחקור אינטראקציות בין מאחס לפתוגן בקנה מידה רחב, וזיהתה מטרות במאחס ובחיידק לצורך פיתוח טיפולים חדשים למלחמה במחלות זיהומיות.

generation-multi-phenotypic-high-content-screening-coxiella-burnetii

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הליך culturing נוזלי מבוסס מחלק...

תפוקה גבוהה הקרנת ו biosensing עם פלורסנט ג elegans מתחים

אנו מתארים שיטה רגיש לזהות הרגולטורים postembryonic של ביטוי חלבונים לוקליזציה...

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

קדימה הגנטיקה היא שיטה רבת עוצמה לחשוף את הרמה המולקולרית של...

מסך גנטית לבודד Toxoplasma gondii מארח תאים יציאה מוטציות

בחיפוש יסודי ביולוגיה של התא היא להגדיר את המנגנונים העומדים בבסיס זהותה של האברונים המרכיבים התאים האיקריוטים. כאן אנו מציעים שיטה לזהות את הגנים האחראים על תקינות מורפולוגית ופונקציונלית של אברונים צמחים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואת הדור הבא של כלים רצף.

פלואורסצנטי, מיקרוסקופ הקרנת ואת הדור הבא הרצף: כלים שימושיים לזיהוי גנים המעורבים אברון Integrity

סרטון זה מדגים שיטה להערכת הצמיחה התוך-תאית של מוטציות Coxiella המתויגות ב-GFP בתוך תאי אפיתל בתרבית. הפנוטיפ המוטנטי הוא דמיינו באמצעות immunostaining ומיקרוסקופ epifluorescence, המאפשר לחקור את ההשפעה של המוטציה על הצמיחה התאית.

הערכת גדילה תוך-תאית של מוטנטים של קוקסיאלה בתוך תאים אאוקריוטים

sp Enterobacter. YSU גדל במדיום מלחים מינימאליים של גלוקוז. Auxotrophs מופקים על ידי הפיכתה עם transposome שמכניס את עצמו באופן אקראי לגנום המארח. מוטציות נמצאות על ידי ציפוי העתק מבינוני מורכבת עד בינוני מינימאלי. גנים נקטעו מזוהים על ידי הצלת גן ורצף.

דור של Enterobacter Sp. YSU Auxotrophs שימוש transposon mutagenesis

התנגדות מתח היא אחד מסימני ההיכר לאריכות ימים, והוא ידוע להיות נשלטת גנטי. כאן, פיתחנו שיטת תפוקה גבוהה משוחדת למסך למוטציות המעניקות התנגדות מתח בתאי גזע עובריים שבה לפתח מודלים של עכברים ללימודי אריכות ימים.

גישה גנטית קדימה ללחשוף גני התנגדות מתח בעכברים - מסך תפוקה גבוהה בתאי גזע עובריים

חוקר את יחסי הגומלין בין חיידקים פתוגנים מארחיהם הוא אזור חשוב של מחקר ביולוגי. כאן אנו מתארים טכניקות צורך למדוד טרנסלוקציה מפעיל ידי burnetii Coxiella במהלך להשתקת גנים siRNA שימוש המצע כלאם.

החלת העברת אנרגית תהודת קרינה (סריג) לבחינת יעילות טרנסלוקציה מפעיל ידי<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; במהלך siRNA השתקה

כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור המתחיל החוקרים ליזום phenotyping עבור סוג חיידקים חשובים פרמקולוגית של Streptomyces.

הערכות חזותי מיקרוסקופיים של מוטציות התפתחותית Streptomyces

אנו מתארים שיטה ליצירת ספריות מוטציה טרנספוסון רוויבחיידקים גראם שלילי והכנה לאחר מכן של ספריות amplicon DNA להמשך תפוקה גבוהה. כדוגמה, אנו מתמקדים בפתוגן ESKAPE, Acinetobacter baumannii, אבל פרוטוקול זה הוא נוח למגוון רחב של אורגניזמים גראם שלילי.

יצירת ספריות הכנסה Transposon בחיידקים גראם שלילי עבור רצף בתפוקה גבוהה

חקור שיטות ליצירת מוטאנטים פלואורסצנטיים של Coxiella burnetii וניתוח פנוטיפים של פנימיות, שכפול ורעילות תאית. גלה גנים חיוניים במחזור ההדבקה של הנגיף התוך-תאי הזה.

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של

גלה סרטונים נוספים