Name: בו זמנית Vivo לשעבר בדיקות פונקציונליות של שתי הרשתיות על ידי In vivo (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: למדו את שיטת ERG ex vivo להערכת פעילות תאי הרשתית בעכברים. הטכניקה מאפשרת ניתוח מסלולי העברת אותות של מקלות וקונוסים באמצעות גירוי אור ותרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי NIH EY019312 מענקים וEY021126 (VJK), EY002687 למחלקת העיניים ומדעים חזותיים באוניברסיטת וושינגטון, ועל ידי מחקר למניעת עיוורון.

כל פרוטוקולי הניסוי היו בהתאם המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה ואושרו על ידי ועדת בעלי החיים המחקרים המוסדית באוניברסיטת וושינגטון. 1. הגדרה מחזיק זלוף והדגימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון לזלוף הרשתית טרי ביום של הניסוי. השתמש במים מזוקקים וללא יונים. השתמש באחד משלושת הפתרונות הבאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן יקרבונט המכיל &#39;הפתרון (1 ליטר): 1 בקבוק איימס&#39; איימס התקשורת ו1.9 גרם של NaHCO 3, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון של לוק (מ&quot;מ): 112.5 NaCl, 3.6 KCl, 2.4 MgCl 2, 1.2 CaCl 2, 10.0 HEPES, 20.0 3 NaHCO, 3.0 Na succinate, 0.5 גלוטמט Na, 0.02 EDTA, ו10.0 גלוקוז, ויטמיני ממ 0.1% ואמין חומצות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון HEPES שנאגר להכין רינגר (מ&quot;מ): 133.3 NaCl, 3.3 KCl, 2.0 MgCl 2, 1.0 CaCl 2, 10.0 גלוקוז, 0.01 EDTA, 12.0 HEPES, pHמותאם ל7.5 עם ~ 5.8 מיליליטר של 1 M NaOH, להוסיף L-15 0.72 גר &#39;/ בינוני תרבות L ליבוביץ. השתמש 20-50 מיקרומטר DL-AP4 ו50-100 מיקרומטר BaCl 2 לבודד את תגובת קולטי האור בכל מדיה זלוף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון לאלקטרודות 28 (מ&quot;מ): 140.0 NaCl, 3.6 KCl, 2.4 MgCl 2, 1.2 CaCl 2, 3 HEPES, 0.01 EDTA ולהתאים את ה- pH ל7.4-7.5 עם NaOH. פתרון אלקטרודה ניתן לאחסן ב RT במשך כמה חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין ולבדוק את בעל הדגימה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דבק נייר שחור / אפור מסנן על גבי הכיפות של חלק התחתון של בעל הדגימה (ראה איור 1 א). מורחים דבק אפוקסי 5 דקות שני מרכיבים בזהירות מסביב לקצוות של צמרות שטוחות של הכיפות. אם יש צורך, לעשות את זה תחת מיקרוסקופ לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה עד שהדבק הוא (כ -4 דקות) כמעט יבשות ולחץ על נייר הסינון על הכיפות באמצעות פריט שטוח. נייר סינון דבק לפחות יום אחד לפני הניסוי.נייר סינון ניתן להשתמש מספר פעמים אבל יש להחליף אחרי חודש של הקלטות. השתמש 70% אתנול לנקות כיפות בזהירות מכל שאריות דבק לפני התקנת נייר ההחלפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את ערוצי אלקטרודה עם פתרון אלקטרודה מנסה להימנע מכל בועות אוויר ולדפוק אלקטרודות גלולה סגורות עם מתאם הברגה לערוצי אלקטרודה (ראה איורים 1 א &#39;וב&#39;). חבר את החתיכות העליונה ותחתונים של בעל הדגימה עם ארבעה ברגים ולמלא את שורות זלוף עם פתרון אלקטרודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את ההתנגדות ומתח בין המוביל של כל זוג האלקטרודה באמצעות מודד (איור 1). התנגדות צריכה להיות מתחת ל -100 Ωk והמתח מתחת ל -10 mV אם הערוצים ללא בועה ואלקטרודות נמצאות במצב טוב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 400-700 מיליליטר של תקשורת זלוף בבקבוק הזכוכית. נפרד עוד 300 מיליליטר לשימוש בנתיחה של הרשתית ושלקרע אותו במקרר. הגדר את צינורות טפטוף בבלוק מחליף חום ולמקם את הבלוק שחומם מראש על צלחת החימום (ראה איור 1D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקף את הבקבוק עם מכסה שיש לו קשרים ל- CO 2 / O 2 גז (אם לוק של איימס &quot;או משמש) ולצינורות טפטוף (ראה איור 1D). מחממים את הבקבוק עם התקשורת עד 37 מעלות צלסיוס ולמקם אותו על צלחת החימום או על החלק העליון של יחידת גירוי האור באמבט מים מוגדר 37 - C 39 O 17. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראש קווי זלוף על ידי מילוי אותם עם תקשורת זלוף ליזום הזרימה מונעת כוח המשיכה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במערכת LKC, הנח את הבקבוק בחלק העליון של יחידת ממריץ 17 כדי לספק זרימה הכבידתית משמעותית שמותאמת לאחר מכן על ידי רגולטורי זרימת שיעור בלי שהושפע מרמת ההפחתה של פתרון זלוף בבקבוק במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במערכת Ocuscience, למקם את pבקבוק erfusion בתוך כלוב פאראדיי כדי למזער את הרעש ואת מקום קווי פלט זלוף ארוך מבעל הדגימה (ראה שלב 2.8) הרבה מתחת לרמתו של בעל הדגימה (ובקבוק זלוף) כדי להגדיל את כונן הכבידה של הפתרון. להגן על קווי פלט אלה ולחבר את המגן לקרקע של המגבר כדי למנוע צימוד של רעש האלקטרומגנטים לאות ERG. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את זלוף - 3 5 מיליליטר / דקה באמצעות רגולטורי ספיקה. חבר 2/95% גז 5% CO 2 O מגליל עם רגולטור נכון ולהתאים את קצב הזרימה על מנת להבטיח מבעבע קבועה של התקשורת בבקבוק באמצעות אבן אוויר. </li></ol> הכנת 2. דוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב מכשירי נתיחה נקיים וחדים כולל microscissors ישר-להב, אחד או שתיים 45 o פינצטה, סכין גילוח ופיסת נייר סינון מלבני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים כ -200 מיליליטר של perfu הקרפתרון שיאון בצלחת פטרי גדולה כל כך שכל החלק התחתון של בעל הדגימה (כולל כיפות) יכול להיות שקוע בפתרון. צעד זה הופך להיות חשוב כאשר ההרכבה הרשתית על הכיפות (ראה שלב 2.6). למרות כמה פתרונות נועדו להיות רווי בcarbogen (5% CO 2/95% O 2), זה לא חיוני לצורך הנתיחה ולא נעשה בניסויים שתוארו כאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניסוי טיפוסי, לשמור על בעלי חיים ב12/12 שעות אפלים מחזור האור / וכהה להתאימם ל6-12 שעות לפני ההקלטות. להרדים את החיה משאיפת CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם תחת אור אדום עמום ולעשות את כל ההליכים תחת אור אדום או IR העמום הבאים (השתמש למשל, מסנן אדום מול מקור מיקרוסקופ האור). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את העיניים החוצה באמצעות פינצטה ולשים אותם בתקשורת. מניחים עין אחת בכל פעם על פיסת נייר קטנה (למשל, כמה נייר סינון רגיל) ולעשות כהדליק כ ברמה של serrata אורה תוך החזקת עין עם פינצטה (זה נעשה מחוץ לפתרון כאן). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך לאורך serrata אורה (או קרוב יותר לקו המשווה של העין) עם microscissors ולהסיר את הקרנית והעדשה. מניחים את כוס עין בתקשורת הקרה בצלחת פטרי הגדולה וחזור על אותו התהליך עם העין השנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך חתך קטן מהחלק העליון של כוס עין לכיוון עצב הראייה על ידי שמירה על המספריים בין הרשתית ולובן העין על מנת לשמור על הרשתית כשלמה ככל האפשר. אחיזה בלובן העין משני צידי החתך באמצעות שתי פינצטה ולמשוך את פינצטה אחד משני כדי לנתק את הרשתית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את עצב הראייה ולנסות לבודד את הרשתית עם כמות מינימאלית של מגע פיזי אל פני השטח דיסטלי. הרשתית תהיה בעיקר לנתק באופן אוטומטי מהרשתית במהלך תהליך הנתיחה. חשוב יותר, כדי למנוע הפרעה מכאנית של הרשתית מאשר לבצענתיחה במהירות, בדרך כלל ניתן מודגרות רשתית לפחות 30 דקות בפתרון ללא השפעה משמעותית על מאפייני התגובה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר הרשתית על הכיפות של בעל הדגימה (איור 1 ג). לטבול את החלק התחתון של בעל הדגימה בצלחת פטרי עם הרשתיות גזור. חלק את הרשתית, צד קולטי האור (המשטח הקמור של הרשתית המבודדת) כלפי מעלה, מעל לכיפה ולהרים את בעל הדגימה כך שהרשתית מצרפת על נייר הסינון. חזור על התהליך עבור הרשתית אחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את צלחת בעל בזהירות כדי למנוע crosstalk החשמלי בין הרשתיות כמו גם הסטת רעש ואות. יש בעל דגימת O- טבעות סביב כיפות חלק התחתונה כדי למנוע דליפת פתרון בין התחתית והחלקים העליונים של בעל, כמו גם לעזור לבידוד חשמלי של הצדדים קולטי האור ותא גנגליון של הרשתית בודדת. צרף את החלק העליון של בעל עם ארבעה ברגים (ראה איור 1) ולמלא את ערוצי זלוף עם פתרון זלוף באמצעות מזרק ומחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את בעל הדגימה ליד הבלוק מחליף החום ולחבר את קווי קלט והפלט זלוף לבעל הדגימה (1D איור). חבר את האלקטרודות למגבר ERG (אלקטרודות העליונה להתחבר לאדמה / מינוס הסיכה במגבר) ולצרף את יחידת ממריץ / שליטה בבעל הדגימה באמצעות מתאם או להחליק את כרית החימום ליחידת ממריץ תלוי באיזה in vivo משמשת מערכת ERG. </li></ol> 3. הקלטות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הגדרות מגבר וגירוי באמצעות התוכנה של מערכת in vivo. הגדר את תדירות הרכישה לערך בין 1 kHz ו -10 ונמוך לעבור סינון 300 הרץ. אל תשתמש בסינון גבוה לעבור. השתמש 60 הרץ (או 50 הרץ באירופה) לחרוץ מסנן במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא בסיס ללא גירוי ושנינות אורh גירוי עמום (למשל., אור הירוק של -35 dB או 0.3 מ&quot;ר MCD -2) לבדיקת חיבור חשמלי טוב בין האלקטרודות ומדגם רשתית. חכה 10 - 20 דקות לפני תחילת איסוף הנתונים, כך שטמפרטורה ובתפקוד רשתית להגיע למצב יציב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פרמטרים גירוי פי כל ניסוי ספציפי ולהתחיל איסוף הנתונים. לדוגמא, משתמשת באור ירוק מ -40 עד 0 dB או מ0.1 עד 1,000 מ&quot;ר MCD -2 למשפחת תגובת scotopic. השתמש על 2 עד 3 יומן-יחידות בהירות הבזקים בהקלטות photopic בי מוטות צריכה להיות מורחק על ידי אור הרקע (3-30 CDM -2) או הבזק בדיקה (מ&quot;ר על 1.3 Cd -2 = dB 1, ראה איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זאת, יש לזכור כי ערכי עוצמת אור המדויקים עשויים להיות מעט תלויים בכיול המערכת ותנאי ניסוי שלך. ככלל אצבע, בעוצמות בקנה מידה על ידי 5-10 פי לעומת in vivo </eמ &#39;&gt; הקלטות בעת שימוש באור ירוק 17. כיסוי שחור עם פתחים מעל הרשתית (הכלולה במערכת המתאם המסחרית) ניתן להשתמש כדי להפחית את פיזור אור בבעל הדגימה ולהקל גירוי אחיד ושווה של שני הרשתיות על ידי כדור Ganzfeld של במסחר vivo מערכות. הערה: להקלטות מרשתית כהה מותאם, בעוצמות של הבזקי בדיקה המשמשים באקונומיקת ניסוי טיפוסית חלק זניח בלבד של פיגמנט, כך שחוסר ההתחדשות מונעת הרשתית היא לא בעיה. בנוסף, זה כבר הראה בעבר כי התחדשות פיגמנט החרוט עדיין יכולה להתרחש ברשתית המבודדת באמצעות תא מולר המחזור 20 החזותי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כניסויים יימשכו בדרך כלל בין 30 דקות עד כמה שעות, לפקח להיסחף בסיסיים, רמת רעש ויציבות תגובה במהלך הניסוי כשינויים באלה עלולים להצביע על בעיות טכניות. רעש מוגבר או ירידה: הערהאמפליטודות תגובת ד עשויה להצביע על בועות אוויר בערוצי זלוף או אלקטרודה, טמפרטורה נמוכה מדי או גבוהה, פתרון דליפה / שפך או עקירה של הרשתית. </li></ol> 4. ניקוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את בעל דגימה מקווי זלוף, לפתוח אותו ולשטוף את הרשתית מנייר הסינון. הסר את האלקטרודות ולשטוף אותם במים מזוקקים (לא משתמש באתנול). נקה את בעל הדגימה (כולל ערוצי זלוף) עם אתנול ו / או מים מזוקקים. צינורות סומק זלוף בזהירות עם&gt; 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את בקבוק זלוף עם מים מזוקקים (לא משתמש בחומרי ניקוי). אתנול יכול לשמש גם כדי לנקות את הבקבוק. </li></ol>

<ol><li>Armington, J. C. The Electroretinogram. , Elsevier Science & Technology Books. (1974).</li>
<li>Einthoven, W., Jolly, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+form+and+magnitude+of+the+electrical+response+of+the+eye+to+stimulation+by+light+at+various+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Q+J+Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">The form and magnitude of the electrical response of the eye to stimulation by light at various intensities.</a> Q J Exp Physiol. 1, 43(1908).</li>
<li>Granit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+components+of+the+retinal+action+potential+in+mammals+and+their+relation+to+the+discharge+in+the+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve.</a> J. Physiol. 77, 207-239 (1933).</li>
<li>Penn, R. D., Hagins, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transmission+along+retinal+rods+and+the+origin+of+the+electroretinographic+a-wave%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signal transmission along retinal rods and the origin of the electroretinographic a-wave.</a> Nature. 223, 201-204 (1969).</li>
<li>Stockton, R. A., Slaughter, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-wave+of+the+electroretinogram.+A+reflection+of+ON+bipolar+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">B-wave of the electroretinogram. A reflection of ON bipolar cell activity.</a> J. Gen. Physiol. 93, 101-122 (1989).</li>
<li>Robson, J. G., Frishman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+linearity+and+kinetics+of+the+cat+retina%3A+the+bipolar+cell+component+of+the+dark-adapted+electroretinogram%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Response linearity and kinetics of the cat retina: the bipolar cell component of the dark-adapted electroretinogram.</a> Vis. Neurosci. 12, 837-850 (1995).</li>
<li>Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dissection+of+the+electroretinogram+from+the+isolated+rat+retina+with+microelectrodes+and+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs.</a> Vis. Neurosci. 16, 727-741 (1999).</li>
<li>Steinberg, R. H., Schmidt, R., Brown, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+responses+to+light+from+cat+pigment+epithelium%3A+origin+of+the+electroretinogram+c-wave%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intracellular responses to light from cat pigment epithelium: origin of the electroretinogram c-wave.</a> Nature. 227, 728-730 (1970).</li>
<li>Wilson, W. S., Shahidullah, M., Millar, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bovine+arterially-perfused+eye%3A+an+in+vitro+method+for+the+study+of+drug+mechanisms+on+IOP%2C+aqueous+humour+formation+and+uveal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The bovine arterially-perfused eye: an in vitro method for the study of drug mechanisms on IOP, aqueous humour formation and uveal vasculature.</a> Curr. Eye Res. 12, 609-620 (1993).</li>
<li>Frank, R. N., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+photoproducts%3A+effects+on+electroretinogram+sensitivity+in+isolated+perfused+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina.</a> Science. 161, 487-489 (1968).</li>
<li>Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-dependence+of+rod+photoresponses+from+the+aspartate-treated+retina+of+the+frog+%28Rana+temporaria%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol.+Scand%22%5BJournal%5D)">Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria).</a> Acta Physiol. Scand. 134, 535-541 (1988).</li>
<li>Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+properties+of+a+new+isolated+rat+retina+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation.</a> Vision Res. 39, 2165-2177 (1999).</li>
<li>Hamasaki, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+sodium+ion+concentration+on+the+electroretinogram+of+the+isolated+retina+of+the+frog%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog.</a> J. Physiol. 167, 156-168 (1963).</li>
<li>Luke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+perfused+bovine+retina--a+sensitive+tool+for+pharmacological+research+on+retinal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 16, 27-36 (2005).</li>
<li>Bastian, B. L., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+adaptation+in+toad+rods%3A+requirement+for+an+internal+messenger+which+is+not+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Light adaptation in toad rods: requirement for an internal messenger which is not calcium.</a> J. Physiol. 297, 493-520 (1979).</li>
<li>Arden, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+gradients+across+the+receptor+layer+of+the+isolated+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Voltage gradients across the receptor layer of the isolated rat retina.</a> J. Physiol. 256, 333-360 (1976).</li>
<li>Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+ERG+analysis+of+photoreceptors+using+an+in+vivo+ERG+system%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system.</a> Vision Res. 101, 108-117 (2014).</li>
<li>Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+responses+and+light+adaptation+in+rat+retinal+rods+at+different+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures.</a> J. Physiol. 567, 923-938 (2005).</li>
<li>Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cone+photoresponses+obtained+with+electroretinogram+from+the+isolated+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina.</a> Vision Res. 48, 264-272 (2008).</li>
<li>Wang, J. S., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+pathway+mediates+the+mouse+and+human+cone+visual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle.</a> Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).</li>
<li>Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barium+suppresses+slow+PIII+in+perfused+bullfrog+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina.</a> Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).</li>
<li>Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+conductance+block+by+barium+in+amphibian+Muller+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Potassium conductance block by barium in amphibian Muller cells.</a> Brain Res. 498, 308-314 (1989).</li>
<li>Oakley, B. 2nd, Katz, B. J., Xu, Z., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+buffering+of+extracellular+potassium+by+Muller+%28glial%29+cells+in+the+toad+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Spatial buffering of extracellular potassium by Muller (glial) cells in the toad retina.</a> Exp. Eye Res. 55, 539-550 (1992).</li>
<li>Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+measuring+free+drug+concentration%3A+retinal+tissue+as+a+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 2583-2588 (2006).</li>
<li>Walter, P., Luke, C., Sickel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotics+and+light+responses+in+superfused+bovine+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Antibiotics and light responses in superfused bovine retina.</a> Cell. Mol. Neurobiol. 19, 87-92 (1999).</li>
<li>Luke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+safety+profile+of+alkylphosphocholines+in+the+model+of+the+isolated+perfused+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The safety profile of alkylphosphocholines in the model of the isolated perfused vertebrate retina.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 248, 511-518 (2010).</li>
<li>Januschowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+toxicity+testing+of+VEGF+Trap-Eye+in+an+isolated+perfused+vertebrate+retina+organ+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological toxicity testing of VEGF Trap-Eye in an isolated perfused vertebrate retina organ culture model.</a> Acta Ophthalmol. 92, e305-e311 (2014).</li>
<li>Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transretinal+ERG+recordings+from+mouse+retina%3A+rod+and+cone+photoresponses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transretinal ERG recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Koskelainen, A., Hemila, S., Donner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+sensitivities+of+short-+and+long-wavelength+sensitive+cone+mechanisms+in+the+frog+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol.+Scand%22%5BJournal%5D)">Spectral sensitivities of short- and long-wavelength sensitive cone mechanisms in the frog retina.</a> Acta Physiol. Scand. 152, 115-124 (1994).</li>
<li>Lyubarsky, A. L., Falsini, B., Pennesi, M. E., Valentini, P., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV-+and+midwave-sensitive+cone-driven+retinal+responses+of+the+mouse%3A+a+possible+phenotype+for+coexpression+of+cone+photopigments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">UV- and midwave-sensitive cone-driven retinal responses of the mouse: a possible phenotype for coexpression of cone photopigments.</a> J. Neurosci. 19, 442-455 (1999).</li>
<li>Lyubarsky, A. L., Daniele, L. L., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+candelas+to+photoisomerizations+in+the+mouse+eye+by+rhodopsin+bleaching+in+situ+and+the+light-rearing+dependence+of+the+major+components+of+the+mouse+ERG%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">From candelas to photoisomerizations in the mouse eye by rhodopsin bleaching in situ and the light-rearing dependence of the major components of the mouse ERG.</a> Vision Res. 44, 3235-3251 (2004).</li>
<li>Azevedo, A. W., Rieke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+protocols+alter+phototransduction%3A+the+implications+for+retinal+processing+at+visual+threshold%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Experimental protocols alter phototransduction: the implications for retinal processing at visual threshold.</a> J. Neurosci. 31, 3670-3682 (2011).</li>
<li>Carter-Dawson, L. D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rods+and+cones+in+the+mouse+retina.+I.+Structural+analysis+using+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Rods and cones in the mouse retina. I. Structural analysis using light and electron microscopy.</a> J. Comp. Neurol. 188, 245-262 (1979).</li>
<li>Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+in+vertebrate+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Adaptation in vertebrate photoreceptors.</a> Physiol. Rev. 81, 117-151 (2001).</li>
<li>Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-driven+translocation+of+signaling+proteins+in+vertebrate+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors.</a> Trends Cell Biol. 16, 560-568 (2006).</li>
<li>Schneeweis, D. M., Schnapf, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photovoltage+of+macaque+cone+photoreceptors%3A+adaptation%2C+noise%2C+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The photovoltage of macaque cone photoreceptors: adaptation, noise, and kinetics.</a> J. Neurosci. 19, 1203-1216 (1999).</li>
<li>Heikkinen, H., Vinberg, F., Nymark, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesopic+background+lights+enhance+dark-adapted+cone+ERG+flash+responses+in+the+intact+mouse+retina%3A+a+possible+role+for+gap+junctional+decoupling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Mesopic background lights enhance dark-adapted cone ERG flash responses in the intact mouse retina: a possible role for gap junctional decoupling.</a> J. Neurophysiol. 105, 2309-2318 (2011).</li>
<li>Gouras, P., MacKay, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+in+amplitude+of+the+human+cone+electroretinogram+with+light+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Growth in amplitude of the human cone electroretinogram with light adaptation.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30, 625-630 (1989).</li>
<li>Peachey, N. S., Goto, Y., al-Ubaidi, M. R., Naash, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+mouse+cone-mediated+electroretinogram+during+light+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Properties of the mouse cone-mediated electroretinogram during light adaptation.</a> Neurosci. Lett. 162, 9-11 (1993).</li>
</ol>

יש אוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס הסכם רישיון עם Xenotec, Inc. ועשויה לקבל תמלוגים ממכירת מתאם vivo לשעבר.

<html> אנו מדגימים כאן את השלבים הקריטיים להשגת הקלטות vivo ERG לשעבר באיכות גבוהה בו זמנית משתי רשתיות עכבר מבודדות באמצעות רכיבים במערכת vivo ERG יחד עם vivo לשעבר מתאם ERG. במחקר זה אנו perfused שני הרשתיות מבעלי החיים עם אותו הפתרון (או איימס &#39;, לוק של או רינגר) אבל זה גם אפשרי לינקב כל רשתית עם למשל פתרון שונה, למטרות בדיקת סמים. הצעדים החשובים ביותר לקבלת נתונים באיכות גבוהה הם מיגון מרעש אלקטרומגנטים, לנתיחה זהירה של ...

Electroretinogram (ERG) הוא טכניקה מבוססת היטב כי ניתן להשתמש כדי להקליט את הפעילות החשמלית של הרשתית מופעלת על ידי אור. אות ERG מופקת בעיקר משינויי מתח שנגרמו על ידי זרמי רדיאלי (לאורך הציר של קולטני האור ותאים דו קוטביים) זורמים במרחב תאי ההתנגדות של הרשתית. אות ERG הראשונה נרשמה בשנת 1865 על ידי הולמגרן מפני שטח של עין דג 1. Einthoven וJolly 1,908 2 חילקו את תגובת ERG לתחילתה של אור לשלושה גלים שונים, נקראת a-, B-, וג-גלים, שכיום ידועים שישקפו בעיקר את הפעילות של קולטני האור, על תאים דו קוטביים, ואפיתל הפיגמנט תאים, בהתאמה 3-8. ניתן להקליט ERG מהעיניים של בעלי חיים או בני אדם (in vivo) בהרדמה, מהכנת עין מבודדת 9, על פני רשתית שלמה מבודדת (לשעבר vivo) 3,10-15 או על פני שכבות רשתית ספציפיות עם microelectrodes (מקומיERG) 4,16. מבין אלה, in vivo ERG הוא כיום השיטה הנפוצה ביותר להערכת תפקוד רשתית. זוהי טכניקה לא פולשנית שיכול לשמש למטרות אבחון או למעקב ההתקדמות של מחלות רשתית בבעלי חיים או חולים. עם זאת, בvivo הקלטות ERG לייצר אות מורכבת עם מספר מרכיבים חופפים, לעתים קרובות מזוהמות ברעש extraocular הפיזיולוגי (למשל, נשימה ופעילות לב). ERG המקומי ניתן להשתמש כדי להקליט את האות על פני שכבות מסוימות של הרשתית אבל זה חודרני ביותר ויש לו את היחס הנמוך ביותר אות לרעש (SNR) בהשוואה לתצורות הקלטת ERG האחרות. ERG המקומי הוא גם תובעני מבחינה טכנית ודורש ציוד יקר (למשל, מיקרוסקופ וmicromanipulators). Transretinal ERG מהרשתית שלמה, מבודדת (לשעבר vivo ERG) מציע פשרה בין in vivo ושיטות ERG מקומיים המאפשרת יציב וHIGהקלטות h SNR מרשתית שלמה של בעלי חיים או בני אדם 17. לאחרונה, שיטה זו שמשה בהצלחה ללמוד לתפקד מוט וקולטי אור חרוט ברשתית של יונקים, קופים ובני אדם 18-20. בנוסף, בשל היעדר אפיתל הפיגמנט ברשתית vivo לשעבר, מרכיב ג-הגל החיובי של אות ERG מוסר ורכיב איטי שלילי בולט PIII מתגלה בvivo לשעבר ההקלטות. רכיב PIII האיטי הוכח מקורן את הפעילות של תאי גליה מולר ב21-23 הרשתית. לפיכך, לשעבר vivo שיטת ERG יכול לשמש גם כדי ללמוד תאי מולר ברשתית ללא פגע. גם מספר מחקרים הראו כי vivo לשעבר הקלטות ERG יכולים לשמש למדידת ריכוז של סוכנים תרופתיים סביב 24 הרשתית ולבדוק את הבטיחות ויעילות של תרופות 25-27. מסחרי מרובים במערכות vivo זמינים ומשמש במעבדות רבות שלא בהכרח יש לי רקע אלקטרופיזיולוגיה נרחב. לעומת זאת, מכשירי vivo לשעבר לא היו זמינים עד לאחרונה 17 וכתוצאה מכך רק מעט מאוד מעבדות כיום מנצלות טכניקה רבת עוצמה זו. זה יהיה מועיל לבצע הקלטות vivo לשעבר ERG זמינים ליותר מעבדות במטרה לקדם את הידע שלנו על פיזיולוגיה והפתולוגיה ברשתית, ולפתח טיפולים חדשים למחלות מסנוורים. אנו מדגימים כאן מכשיר vivo לשעבר ERG פשוט ובמחיר סביר 17 ולהראות כיצד ניתן להשתמש בו בשילוב עם מספר מערכות vivo ERG הזמינים מסחרי בלהקליט איתות rod- ותיווך קונוס (a- וB-גלים) והפונקציה של תאי מולר (להאט PIII) מרשתית עכבר wild-type בשלמותה.

<table><tbody><tr><td>In vivo מערכת ERG</td><td>OcuScience</td><td>HMsERG</td><td><a href="http://www.ocuscience.us/id77.html">www.ocuscience.us/id77.html</a></td></tr><tr><td>In vivo מערכת ERG</td><td>LKC Technologies</td><td>UTAS-E 3000</td><td><a href="http://www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html">www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html</a></td></tr><tr><td>Ex מתאם vivo מתאם</td><td>OcuScience</td><td>Ex VIVO ERG</td> <td><a href="http://www.ocuscience.us/id107.html">www.ocuscience.us/id107.html</a></td></tr><tr><td>דיסקציה מיקרוסקופ</td><td>North Central Instruments</td><td>Leica M80</td><td><a href="http://www.ncimicro.com/store/ListProduct.asp?bSub=T&amp; idCategory=27">רשאי להשתמש בכל פולט מותג</a></td></tr><tr><td>IR</td><td>Opto Diode Corp.</td><td>OD-50L</td><td><a href="http://www.optodiode.com/">www.optodiode.com</a></td></tr><tr><td>Prowler ראיית לילה היקפי</td><td>B.E. Meyers אלקטרואופטיקה</td><td>D4300-I</td><td>מוצר בדרגה צבאית.</td></tr><tr><td>מסנן אדום</td><td>Rosco Laboratories</td><td>Roscolux #27 אדום בינוני</td><td>ניתן להשתמש במקום מערכת IR</td></tr><tr><td>אור ראש אדום</td><td>OcuScience</td><td>ERGX011</td><td><a href="http://www.ocuscience.us/catalog/i29.html">www.ocuscience.us/catalog/i29.html</a></td></tr><tr><td>Microscissors</td><td>WPI, Inc.</td><td>500086</td><td><a href="http://www.wpiinc.com/">www.wpiinc.com/</a></td></tr><tr><td>Dumont פינצטה #5</td><td>WPI, Inc.</td><td>14101</td><td></td></tr><tr><td>סכיני גילוח</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72000</td><td><a href="http://www.emsdiasum.com/">www.emsdiasum.com</a></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Metler Toledo</td><td>AB54-S/FACT</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/">רשאי להשתמש בכל מד ואלקטרודה </a>pH של המותג</td></tr> <tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>pHI 350</td><td>רשאי להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">רשאי להשתמש בכל מותג</a></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60129</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">רשאי להשתמש בכל מותג</a></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63020</td><td>1.0 M תמיסה</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21114</td><td>1.0 M פתרון</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431788</td><td>עשוי להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>עשוי להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>עשוי להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>Ames medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td>עשוי להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>BaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0750</td><td>עשוי להשתמש כל מותג</td></tr><tr><td>DL-AP4</td><td>Tocris Bioscience</td><td>101</td><td>רשאי להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>חומצה סוקסינית מלח דיסודיום</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224731</td><td>רשאי להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>L-חומצה גלוטמית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2834</td><td>עשוי להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>עשוי להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>מדיום תרבית לייבוביץ L-15</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4386</td><td>עשוי להשתמש בכל מותג</td></tr><tr><td>ויטמינים MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>חומצות אמינו MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5550</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Airgas</td><td>UN3156</td><td>5% CO2</td></tr></tbody></table>

בו זמנית<em&gt; vivo לשעבר</em&gt; בדיקות פונקציונליות של שתי הרשתיות על ידי<em&gt; in vivo</emמערכת electroretinogram&gt;

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

אות אלקטרורטינוגרמה in vivo (ERG) מורכב ממספר רכיבים חופפים שמקורם בסוגי תאי רשתית שונים, כמו גם רעש ממקורות חוץ-רשתיים. אקס ויוו ERG מספק שיטה יעילה לניתוח תפקוד תאי הרשתית ישירות מרשתית מבודדת שלמה של בעלי חיים או עיניים תורמות. בנוסף, ניתן להשתמש ב-ex vivo ERG כדי לבדוק את היעילות והבטיחות של חומרים טיפוליים פוטנציאליים ברקמת הרשתית מבעלי חיים או בני אדם. אנו מראים כאן כיצד ניתן להשתמש במערכות ERG in vivo הזמינות מסחרית לביצוע הקלטות ERG ex vivo מרשתית עכבר מבודדת. אנו משלבים את גירוי האור, היחידות האלקטרוניות והחימום של מערכת in vivo סטנדרטית עם מחזיק דגימה מעוצב בהתאמה אישית, מערכת זלוף מבוקרת כוח הכבידה ומיגון רעשים אלקטרומגנטי כדי להקליט אותות ERG ex vivo עם רעש נמוך בו-זמנית משתי רשתית עם תוכנת הרכישה הכלולה במסחרי in vivo מערכות. יתר על כן, אנו מדגימים כיצד להשתמש בשיטה זו בשילוב עם טיפולים תרופתיים המסירים רכיבי ERG ספציפיים על מנת לנתח את התפקוד של סוגי תאי רשתית מסוימים.

הקלטנו תגובות הבזק מסוג wild-כהה מותאם (WT) C57BL / 6 רשתית עכבר ידי ביצוע פרוטוקולי הניסוי שתואר לעיל ושמודגמים באיור 1 על ידי שימוש בפתרוני זלוף סטנדרטיים שונים (איור 2). גל התגובה וקינטיקה כמו גם הרגישות של קולטני אור מוט הופיעו דומים באיימס &#39;והתקשורת של לוק (איור 2 א&#39; וב &#39;). מצד השני, תחת פתרון HEPES שנאגר רינגר (לא O CO 2/95% ביקרבונט או 5% 2) אמפליטודות התגובה היתה קטנה יותר...

Ex vivo ERG יכול לשמש לתיעוד פעילות חשמלית של תאי רשתית ישירות מרשתית שלמה מבודדת של בעלי חיים או בני אדם. אנו מדגימים כאן כיצד ניתן להתאים מערכות ERG in vivo להקלטות ERG ex vivo על מנת לנתח את הפעילות החשמלית של תאי הרשתית.

בו זמנית<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; בדיקות פונקציונליות של שתי הרשתיות על ידי<em&gt; In vivo</emמערכת electroretinogram&gt;

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להעריך את תפקוד התאים מרשתית עכבר מבודדת באמצעות מערכת מסחרית לביצוע אלקטרו-רטינוגרמה (ERG) in vivo, יחד עם מתאם ex vivo. דבר זה מושג תחילה על ידי דיסקציה של הרשתיות משתי עיני העכבר. השלב השני הוא קיבוע הרשתיות למחזיק דגימות כאשר צד הפוטורספטורים פונה כלפי מעלה.בשלב הבא, את מחזיק הדגימה מניחים על לוח חימום במערכת ה-ERG in vivo ומחברים אותו למערכת פוזיה הנשלטת על ידי כבידה. השלב האחרון הוא חיבור האלקטרודות של מחזיק הדגימה למגבר ועירור הרשתיות באמצעות אור כדי לקבל תגובות ERG. בסופו של דבר, נעשה שימוש ב-ERG ex vivo כדי להדגים כיצד ניתן לנתח מסלולי העברה המתווכים על ידי קולגבלים וקונוסים באמצעות פרמקולוגיה ופרוטוקולי גירוי אור ספציפיים.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות אחרות, כגון בדיקות in vivo, ERGs או הקלטות של תא בודד, הוא שהיא מספקת יחס אות לרעש גבוה יותר, הקלטות ארוכות ויציבות יותר, וכן אפשרות למניפולציות פרמקולוגיות קלות וכמותיות. בנוסף, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לסרוק את היעילות והבטיחות של תרופות המיועדות לטיפול במחלות רשתית ברשתית של תורמים אנושיים ופרימטים. לפחות יום אחד מראש, שנו את החלק התחתון של מחזיק הדגימה על ידי הדבקת נייר מסנן שחור-אפור לחלק העליון של הכיפות. השתמשו בדבק אפוקסי דו-מרכיבי בעל זמן התייבשות של חמש דקות לאורך שולי הכיפות, ובמידת הצורך, השתמשו במיקרוסקופ דיסקציה. לאחר התייבסות הדבק, הצמידו את נייר המסנן בצורה שטוחה אל הכיפה.המצב יהיה תקין למשך כחודש של הקלטה. לאחר מכן, הסירו את הנייר ונקו את כיפת המכשיר עם 70% ethanol. כעת, להכנת האלקטרודה, מלאו תחילה את תעלות האלקטרודה בתמיסת אלקטרודות.נסו להימנע מהחדרת בועות אוויר. לאחר מכן, הברגו את אלקטרודות הפלט (pellet electrodes) לתוך תעלות האלקטרודות. חברו את החלקים העליון והתחתון של מחזיק הדגימה באמצעות ארבעה ברגים ומלאו את קווי הפרפוזיה בתמיסת אלקטרודות.בשלב הבא, מדדו את ההתנגדות והמתח בין המוליכים של זוגות האלקטרודות. ההתנגדות צריכה להיות נמוכה מ-100 kilo ohms והמתח נמוך מ-10 millivolts. אם הערוצים נקיים מבועות והאלקטרודות במצב תקין, מזגו כעת 400 עד 700 milliliters של מדיום פרפוזיה לבקבוק זכוכית עבור פרפוזיית הדגימה.בנוסף, שפכו 300 milliliters עבור הנתיחה ואחסנו אותם במקרר. לאחר מכן, העבירו את צינור הפרפוזיה דרך בלוק מחליף החום והניחו את הבלוק שחומם מראש על פלטת החימום. כעת, סגרו את הבקבוק במכסה הכולל כניסת גז וכניסה לצינור הפרפוזיה.יש לחבר את כניסת הגז לאבן אוויר. הניחו את הבקבוק שחומם מראש, שבו יישמר מדיום הפרפוזיה בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, המריאו את קווי הפרפוזיה על ידי מילואם במדיום הפרפוזיה כדי להפעיל את הזרימה מונחית הכבידה במערכת ocus science.הניחו את הבקבוק בתוך כלוב פאראדיי כדי למזער רעשים והשתמשו בקווי פלט של פרפוזיה ארוכים מהמחזיק של הדגימה. מנעו את השפעת הרעשים על קווי הפלט הללו על ידי מיקומם נמוך משמעותית מגובה המחזיק של הדגימה וממגן בקבוק הפרפוזיה, וחברו את המגן להארקת המגבר דרך כלוב פאראדיי. כדי למנוע צימוד של רעש אלקטרומגנטי לאות ה-ERG, חברו את חיישן הטמפרטורה לבמת החימום.כעת, באמצעות הווסתים, כוון את זרימת התמיסה לשלושה עד חמישה מיליליטרים לדקה. לבסוף, במידת הצורך, הזרם אוויר וגז אל התמיסה וכוון את הווסת להשגת זרם בועות קבוע מאבן האוורור. התחל במזיגת כ-200 מיליליטרים של תמיסת פרפוזיה קרה לצלח פטרי גדול, כך שכל החלק התחתון של מחזיק הדגימה יהיה טבול במלואו.יש להקריב בעל חיים שגודל במחזור של 12 שעות אור ו-12 שעות חשיכה, אשר עבר הסתגלות לחשיכה למשך שש עד 12 שעות לפני ההקלטות. את כל הפעולות הבאות יש לבצע תחת תאורה אדומה עמומה או תאורה באינפרא-אדום. לאחר בידוד כל עין, יש להניח אותן בתוך תמיסת העין.לאחר מכן, העבירו עין אחת לחתיכה קטנה של נייר מסנן על גבי הנייר. אחזו בה בעזרת פינצטה וחלקו בה חריץ בגובה דומה לזה של ה-aura serrata. גזרו לאורך ה-aura serrata או בנקודה קרובה יותר לקו המשווה כדי להסיר את קרנית העין ואת העדשה.לאחר מכן, הסירו את הקרנית ואת קצוות העדשה והעבירו את גביע העין בחזרה למצע הקר. חזרו על אותו הליך בעין השנייה. כעת, בעבודה עם גביע עין, בצעו חתך קטן מהחלק העליון לכיוון העצב האופטי.שמרו את המספריים בין הרשתית לבין הסקלרה כך שהרשתית תישאר שלמה ככל האפשר. לאחר מכן, אחזו בסקלרה משני צדי החתך באמצעות שתי פינצטות ומשכו את הרקמה כדי להפריד את הרשתית. כדי לבודד את הרשתית, חתכו את העצב האופטי והוציאו את הרשתית תוך מגע מינימלי עם פני השטח הדיסטליים שלה.כעת, קבעו את הרשתות המבודדות על כיפות מחזיק הדגימות. ראשית, טבלו את החלק התחתון של מחזיק הדגימות בצלחת הפטרי עם הרשתות המנוסחגות. לשקופית הבאה.הניחו את הפוטורספטורים של הרשתית או את הצד הקמור כלפי מעלה מעל כיפת המכשיר. לאחר מכן, הרימו בעדינות את מחזיק הדגימה כך שהרשתית תיצמד לנייר המסנן. חזרו על הפרוצדורה עבור הרשתית השנייה.כעת ייבשו את פלטת התמיכה בזהירות כדי למנוע רעשי דיבדוף (crosstalk) וקצרי אות. לאחר ייבוש התמיכה, הבריגו את החלק העליון ומלאו את תעלולי הפרפוזיה בתמיסת פרפוזיה באמצעות מזרק עם מחט. הניחו את מחזיק הדגימה לצד בלוק חילוף החום.לאחר מכן, חברו את קווי הפרפוזיה של הכניסה והיציאה. השלימו את ההכנה על ידי חיבור האלקטרודות למגבר ה-ERG וחיבור יחידת הבקר של הגירוי למחזיק הדגימה. באמצעות מתאם, כדי לקבל תגובות גדולות וניתנות למחזור, חשוב לבצע דיסקציה והרכבה קפדנית של הרשתות, וכן לשמור על פרפוזיה יציבה ונקיה מבועות מעל הרשתות לפני איסוף הנתונים.המתינו 10 עד 20 דקות כדי שטמפרטורת הרשתית ותפקודה יתייצבו; תגובות הבזק נרשמו מרשתיות של עכברים מסוג C 57 black six מסוג בר (wild type) שהותאמו לחושך, תוך שימוש בתמיסות פרפוזיה סטנדרטיות שונות. צורות הגל והקינטיקה של התגובה נראו דומות במצע Ames ובמצע Locke. גם הרגישות של הפוטורצפטורים מסוג Rod הייתה דומה.מצד שני, בתמיסת Heaps buffered ringer ללא ביקרבונט או תגובת carbogen, האמפליטודות היו קטנות באופן משמעותי. יציבות ה-BWA הייתה לרוב פגועה גם היא ב-heap's ringer. הוספה של 40 µM של A PB הסירה ביעילות את גל B החיובי.ממצאים אלו חשפו גל שלילי גדול ואיטי שיוחס לפעילות תאי מילר (Mueller cell), אשר בוטל על ידי הוספה של 100 micromolar של בריום. רכיב זה חושף את תגובת הפוטורספטורים של אות ה-ERG ex vivo. ניתן לשלב שיטה זו עם כלים אחרים, כגון פרמקולוגיה וגנטיקה, כדי לענות על שאלות הנוגעות למנגנונים המולקולריים של סיגנלינג רשתית ומחלות עיוורון ביונקים, כולל רשתית אנושית.

simultaneous-ex-vivo-functional-testing-two-retinas-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הפיתוח של electroretinogram multifocal (mfERG) היא מקדמה חשובה האבחנה ואפיון של רטינופתיה. Electroretinograms multifocal הם ממוצע מתמטי של קירוב של גל ב. התוכנות ניתן לגזור מן ERGs יותר ממאה אזורים ברשתית בעוד כמה דקות לכל עין. Scotomas תפקוד הרשתית ניתן למפות לכמת.

Multifocal Electroretinograms

אנו מתארים שיטה פשוטה יחסית של transretinal electroretinogram (ERG) הקלטות להשגת photoresponses מוט חרוט מן הרשתית העכבר ללא פגע. גישה זו מנצלת את הבלוק של הולכה סינפטית מ photoreceptors לבודד תגובות אור שלהם ולהקליט אותם באמצעות אלקטרודות המונחות על פני שטח הרשתית שטוח רכוב מבודד.

Transretinal ERG הקלטות של רשתית עכבר: רוד Photoresponses חרוט

מאמר זה מתאר את ההקלטה של ​​תאים בודדים מאוכלוסיות העצבית מתויג fluorescently ברשתית עכבר ללא פגע. באמצעות שני הפוטונים עירור בתאי אינפרא אדום שכותרתו transgenetically היו מטרה הקלטה תיקון-clamp ללמוד לאור התגובות שלהם, מאפייני שדה פתוח, ומורפולוגיה.

אפיון אלקטרו של ה-GFP, הבעת אוכלוסיות תאים ברשתית אינטקט

סרטון זה מדגים כיצד להקליט אלקטרורטינוגרמה (ERG) ופוטנציאל מעורר חזותי (VEP) בחולדה מודעת. החולדה, עם אלקטרודות שהושתלו בניתוח, עוברת תחילה הסתגלות כהה. לאחר החלת טיפות מרחיבות, החיה מונחת בריסן וממוקמת בקערת גנצפלד. אותות ERG ו- VEP נרשמים לאחר מכן.

הקלטה של אלקטרורטינוגרמה ופוטנציאל חזותי מעורר בחולדה

האלקטרורטינוגרמה (ERG) היא פוטנציאל חשמלי שנוצר על ידי הרשתית בתגובה לאור. מאמר זה מתאר כיצד להשתמש ב-ERG כדי להעריך את תפקוד הרשתית, בחולדות מותאמות לחושך, וכיצד ניתן להשתמש בו כדי להעריך התערבות נוירו-פרוטקטיבית, במקרה הנוכחי התניה איסכמית מרחוק.

שימוש בelectroretinogram כדי להעריך את התפקוד ברשתית מכרסמים וההשפעות המגנות של האיבר המרוחק איסכמי אכשור קד

פרוטוקול זה מתאר מדידה סימולטנית של אלקטרורטינוגרמה ופוטנציאלים מעוררים חזותיים בחולדות מורדמות.

הקלטה בו זמנית של Electroretinography ופוטנציאלים חזותיים מעוררים אצל חולדות הרדימו

כאן, אנו מציגים שיטה להקלטת תגובות חשמליות אור-עורר של אפיתל פיגמנט רשתית (RPE) בעכברים באמצעות טכניקה המכונה DC-ERGs שתואר לראשונה על ידי מרמורשטיין, Peachey, ועמיתים בתחילת שנות ה-2000.

אלקטרורטינוגרמה ישירה (DC-ERG) להקלטת התגובות החשמליות המעוררות אור של אפיתל פיגמנט רשתית העכבר

דבקות בסטנדרטים בינלאומיים ושמירה על הסתגלות כהה רשתית הם קריטיים כדי לרכוש תגובות אלקטרורטינוגרם שדה מלא תקפות באבחון וניהול של מחלות רשתית תורשתית בירושה. פרוטוקול מעשי באמצעות חדר חושך נייד מסופק כדי לקבל אלקטרורטינוגרמה שדה מלא עבור תינוקות וילדים תחת הרדמה או הרדמה כללית בהגדרת חדר הניתוח.

הקלטת אלקטרורטינוגרם לתינוקות וילדים תחת הרדמה כדי להשיג הסתגלות כהה אופטימלית וסטנדרטים בינלאומיים

הדמיית in vivo היא כלי רב עוצמה לחקר הביולוגיה בבריאות ובמחלות. פרוטוקול זה מתאר הדמיה טרנס-אימונית של רשתית העכבר באמצעות מיקרוסקופ סטנדרטי של שני פוטונים. הוא גם מדגים שיטות שונות של הדמיה חיה כדי לתייג פלואורסצנטיות קבוצות תאים מרובות של הרשתית.

הדמיה טרנס-אימונית של שני פוטונים In vivo של רשתית העכבר

שינוי של מערך multielectrode קיים או ציוד מהדק תיקון עושה את ex vivo electroretinogram נגיש יותר. שיטות משופרות לתיעוד ושמירה על תגובות אור ex vivo מקלות על חקר תפקוד התאים הפוטורצפטורים וה-ON-דו-קוטביים ברשתית הבריאה, מודלים של בעלי חיים של מחלות עיניים ורשתיות של תורמים אנושיים.

אופטימיזציה של ההגדרה והתנאים עבור אלקטרורטינוגרמה של Ex Vivo כדי לחקור את תפקוד הרשתית בעיניים קטנות וגדולות

פרוטוקול זה מציג ומתאר שלבים לבידוד, דיסקציה, התרבות והכתמה של צמחי רשתית המתקבלים מעכבר בוגר. שיטה זו מועילה כמודל ex vivo לחקר מחלות נוירו-וסקולריות שונות ברשתית כגון רטינופתיה סוכרתית.

השתלת הרשתית של הרשתית של עכבר בוגר כמודל ex vivo לחקר מחלות נוירו-וסקולריות ברשתית

למדו את שיטת ERG ex vivo להערכת פעילות תאי הרשתית בעכברים. הטכניקה מאפשרת ניתוח מסלולי העברת אותות של מקלות וקונוסים באמצעות גירוי אור ותרופות.

בו זמנית

גלה סרטונים נוספים