בו זמנית Vivo לשעבר בדיקות פונקציונליות של שתי הרשתיות על ידי In vivo

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את תפקודם של תאים מרשתית עכבר מבודדת באמצעות מערכת מסחרית in vivo, אלקטרורטינוגרמה או ERG יחד עם מתאם ex vivo. זה מושג על ידי ניתוח הרשתית משתי עיני העכבר. השלב השני הוא להרכיב את צד קולטני האור של הרשתית כלפי מעלה לתוך מחזיק דגימה.

לאחר מכן, מחזיק הדגימה מונח על צלחת חימום במערכת ה-ERG in vivo ומחובר לזילוף מבוקר כוח הכבידה. השלב האחרון הוא לחבר את האלקטרודות של מחזיק הדגימה למגבר ולעורר את הרשתית באור כדי לקבל תגובות ERG. בסופו של דבר, נעשה שימוש ב-ex vivo ERG כדי להראות כיצד ניתן לנתח מסלולי איתות בתיווך מוט וחרוט באמצעות פרמקולוגיה ופרוטוקולים מיוחדים לגירוי אור.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות אחרות, כגון in vivo, ERG או הקלטות תא בודד, הוא בכך שהיא מספקת יחס אות לרעש גבוה יותר הקלטות ארוכות ויציבות יותר, כמו גם אפשרות למניפולציות פרמקולוגיות קלות וכמותיות. בנוסף, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לסנן את היעילות והבטיחות של תרופות המיועדות לטיפול במחלות רשתית של פרימטים ותורמים אנושיים לפחות יום מראש, שנה את החלק התחתון של מחזיק הדגימה על ידי הדבקת נייר סינון אפור שחור לחלק העליון של הכיפות. השתמש באפוקסי דו-רכיבי חמש דקות לאורך שולי הכיפות, ובמידת הצורך השתמש במיקרוסקופ דיסקציה לאחר שהדבק מתייבש, לחץ על נייר הסינון שטוח לכיפה.

זה יהיה טוב לחודש של הקלטות. לאחר מכן הסר את הנייר ונקה את הכיפה עם 70% אתנול. כעת כדי להכין תחילה את האלקטרודה, מלאו את תעלות האלקטרודה בתמיסת אלקטרודה.

נסו להימנע מהכנסת בועות אוויר. לאחר מכן הברג אלקטרודות גלולה לתעלות האלקטרודות. חבר את החלקים העליונים והתחתונים של מחזיק הדגימה עם ארבעה ברגים ומלא את קווי הזלוף בתמיסת אלקטרודה.

לאחר מכן, מדוד את ההתנגדות והמתח בין המוליכים של זוגות האלקטרודות. ההתנגדות צריכה להיות מתחת ל 100 קילו אוהם והמתח מתחת ל -10 מילי-וולט. אם התעלות נטולות בועות והאלקטרודות במצב טוב, שפכו כעת 400 עד 700 מיליליטר של מדיית זלוף לבקבוק זכוכית לזלוף הדגימה.

כמו כן, שפכו 300 מיליליטר לנתיחה ושמרו במקרר. לאחר מכן הכניסו את צינור הזלוף דרך בלוק מחליף החום והניחו את הבלוק שחומם מראש על צלחת החימום. כעת עוטף את הבקבוק במכסה שיש לו כניסת גז וכניסת צינורות זלוף.

יש לחבר את כניסת הגז לאבן אוויר. שים את הבקבוק שחומם מראש במקום בו אמצעי הזלוף יישמר על 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן יש להניע את קווי הזלוף על ידי מילויים במדיית זלוף כדי ליזום את הזרימה המונעת על ידי הכבידה במערכת מדעית אוקוס.

הנח את הבקבוק בתוך כלוב פאראדיי כדי למזער את הרעש והשתמש בקווי פלט זלוף ארוכים ממחזיק הדגימה. ממוקם הרבה מתחת למפלס מחזיק הדגימה ובקבוק הזלוף מגן על קווי הפלט הללו ומחבר את המגן להארקה של המגבר דרך כלוב פאראדיי. כדי למנוע צימוד של הרעש האלקטרומגנטי לאות ה-ERG, חבר את בדיקת הטמפרטורה לחימוםtage.

כעת באמצעות רגולטורים, התאם את זרימת התמיסה לשלושה עד חמישה מיליליטר לדקה. לבסוף, במידת הצורך, הכניסו מכונית וגז לתמיסה והתאימו את הרגולטור לזרם קבוע של בועות מאבן האוויר. התחל במזיגת כ -200 מיליליטר תמיסת זלוף קרה בצלחת פטרי גדולה כך שניתן יהיה לטבול את כל החלק התחתון של מחזיק הדגימה במלואו.

המתת חסד של בעל חיים שגדל במחזור אור כהה של 12, 12 שעות ולאחר מכן חושך מותאם לשש עד 12 שעות לפני ההקלטות. יש לבצע את כל ההליכים הבאים באור אדום עמום או אינפרא אדום. לאחר בידוד כל עין, יש להניח אותן במדיום העין.

לאחר מכן העבירו עין אחת לפיסת נייר סינון קטנה על הנייר. אחזו בו בפינצטה וחתכו בו חריץ בערך באותה רמה כמו ההילה serrata מהחריץ. חותכים לאורך ההילה serrata או איפשהו קרוב יותר לקו המשווה כדי להסיר את הקרנית והעדשה.

לאחר מכן הסר את הקרנית ואת קצוות העדשה והעביר את העין בחזרה למדיה הקרה. חזור על אותו הליך עם העין השנייה. עכשיו עובדים עם עיניים, מבצעים חתך קטן מלמעלה לכיוון עצב הראייה.

שמור את המספריים בין הרשתית לסקלרה כך שהרשתית תישאר שלמה ככל האפשר. לאחר מכן, אחזו בסקלרה משני צידי החתך באמצעות שתי פינצטה ומשכו את הרקמה כדי לנתק את הרשתית. כדי לבודד את הרשתית, חתכו את עצב הראייה והסירו את הרשתית עם כמות מינימלית של מגע עם המשטח הדיסטלי שלה.

כעת, הרכיבו את הרשתית המבודדת על הכיפות של בעל הדגימה. ראשית, טבלו את החלק התחתון של מחזיק הדגימה בצלחת הפטרי עם הרשתית המנותחת. השקופית הבאה.

קולטן האור של הרשתית או הצד הקמור כלפי מעלה מעל הכיפה. לאחר מכן הרם בעדינות את מחזיק הדגימה כך שהרשתית תתחבר לנייר המסנן. לאחר מכן חזור על ההליך עבור הרשתית השנייה.

כעת יבש את לוחית המחזיק בזהירות כדי למנוע רעשי ערב-דיבור ועיתוק אותות. לאחר ייבוש המחזיק, הברג את החלק העליון ומלא את תעלות הזלוף בתמיסת זלוף ממזרק בעזרת מחט. הנח את מחזיק הדגימה ליד בלוק חילופי החום.

לאחר מכן חבר את קווי הזלוף של הקלט והפלט. השלם את ההתקנה על ידי חיבור האלקטרודות ל-ERG ampחיים יותר וחיבור יחידת בקרת הסטימולטור למחזיק הדגימה. שימוש במתאם כדי לקבל תגובות גדולות וניתנות לשימוש חוזר, חשוב לבצע חיתוך והרכבה זהירים של הרשתית, כמו גם לשמור על זלוף יציב ונטול בועות מעל הרשתית לפני איסוף הנתונים.

המתן 10 עד 20 דקות כך שתגובות ההבזק של טמפרטורת הרשתית ותפקודן ייצבו נרשמו משש רשתית שחורה מסוג C 57 מותאמת כהה תוך שימוש בתמיסות שפע סטנדרטיות שונות. צורות הגל והקינטיקה של התגובה נראו דומות במדיה של איימס ובמדיה של מנעולים. גם הרגישות של קולטני האור של רוד הייתה דומה.

מצד שני, בתמיסת רינגר חוצצת ערימות ללא תגובת ביקרבונט או קרבוגן, המשרעות היו קטנות משמעותית. יציבות ה-BWA נפגעה לעתים קרובות גם בצלצול של הערימה. הוספת 40 מיקרומולר של A PB הסירה ביעילות את גל B החיובי.

זה חשף גל שלילי גדול ואיטי שיוחס לפעילות תאי מולר, והוסיף 100 מיקרומולר של בריום שבוטלו. רכיב זה חושף את תגובת קולטני האור של אות ה-ERG ex vivo. ניתן לשלב שיטה זו עם כלים אחרים כמו פרמקולוגיה וגנטיקה כדי לענות על שאלות לגבי המנגנונים המולקולריים של איתות רשתית ומחלות עיוורון ביונקים, כולל רשתית אנושית.