בידוד וריבוי תאים סרטניים במחזור מסרטן מודל עכבר

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבודד ולהנמיח תאי גידול במחזור הדם מדם מלא של מודל עכבר סינגנאי של גידול עם גרורות של קרצינומה של התאים הכבדיים (hepatocellular carcinoma). פעולה זו מבוצעת תחילה על ידי צנטריפוגה של הדם המלא שנאסף מהעכברים ובידוד שכבת ה-buffy coat. לאחר מכן, תאי הדם האדומים בשכבת ה-buffy coat עוברים ליזיס ותאי הגידול במחזור הדם נאספים למשקע (pellet).

לאחר מכן שוטפים את התאים, תולים אותם במצע גידול מלא ומגדלים אותם בתרבית תאים. תאי הגידול הגדלים במהירות נותרים חיוניים לאורך מעברים רבים וניתן לאמת את זהותם באמצעות טכניקות אבחון מולקולריות סטנדרטיות. המשמעות של בידוד תאי גידול נדודים באמצעות הטכניקה שלנו היא שהיא מספקת מודל הניתן לשחזור, אשר ניתן לאופטימיזציה לשימוש פוטנציאלי במסגרת קלינית.

מי שתדגים את הפרוצדורה היא מישל נאדו (Michelle Nadu), סטודנטית לתואר ראשון מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, יש לאסוף דם מלא ממודל גידול Ciea Kamau עם גרורות של קרצינומה של תאי הכבד (hepatocellular carcinoma), כפי שמתואר ב-J of vertical נפרד. יש לסובב את הדם המלא שנאסף בצנטריפוגה במהירות של 1,167 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר ההפרדה לשכבות, הסר בזהירות את שכבת הפלזמה העליונה והעבר אותה למבחנה נ separate בנפח 1.5 milliliter שהיא ROGEN free עבור ניסויים נוספים, כגון גילוי חומצות גרעין חופשיות (cell-free nucleic acids). לאחר מכן, העבר את שכבת ה-Buffy coat למבחנה נפרדת בנפח 1.5 milliliter שהיא ROGEN free כהכנה לליזיס של תאי דם אדומים. פעולה זו נחוצה כדי להסיר תאי דם אדומים שנותרו בשכבת ה-Buffy coat לפני בידוד של תאי גידול במחזור הדם (circulating tumor cells).

התחילו בהכנת תמיסת בופר לליזה של תאי דם אדומים בנפח של ליטר אחד, בריכוז סופי של 155 millimolar ammonium chloride ו-10 millimolar triss. התאימו את ה-pH של התמיסה ל-7.5. קחו אליקוט של כ-שני עד ארבעה milliliter ממלאי הבופר להליזה של תאי דם אדומים בנפח של ליטר אחד.

לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של בופר לליזה של תאי דם אדומים למבחנה המכילה את שכבת ה-buffy coat שנאספה. ערבבו את תוכן המבחנה על ידי הפיכתה מספר פעמים. לאחר מכן, הדגירו את המבחנה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר על השולחן.

בשלב הבא, סבב במצנטריפוגה את התוכן המעורב למשך חמש דקות. ב-1,167 ×g לאחר הסבב, יתקבל משקוף לבנבן. השלך את הנוזל העליון האדמדם לאט ובזהירות לתוך bleach 10%, ללא הפרעה למשקוף.

לאחר השלכת הנוזל העליון (supernatant), שטפו את המשקע הלבנבן ב-1 ml של PBS. לאחר מכן, השקיפו את התאים שוב והמיסו אותם מחדש במצע גידול מלא. העבירו את התאים שהומסו מחדש לכלי גידול תאים והדגירו אותם בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח עם אוויר ו-5% carbon dioxide.

החליפו את מצע תרבית התאים מדי יומיים עד שלושה ימים. לאחר חמישה עד שבעה ימים, תאי גידול גרורתיים (circulating tumor cells) יידבקו לכלי תרבית התאים ויתחילו להתרבות. כדי לוודא שתאי הגידול הגרורתיים של קרצינומה של תאי הכבד (hepatocellular carcinoma) בודדו כראוי.

בצע PCR למקטע ספציפי של הגן beta globin בעכבר, כפי שתואר ותוקף על ידי Stu. לאחר מכן, בצע צביעה אימונוהיסטוכימית לתאים באמצעות נוגדן ספציפי לסמן התאי של ההפטוציטים Cyclic A MP responsive element binding protein three like three בשיטות סטנדרטיות המוצגות כאן; אלו הן תמונות מייצגות של תאי גידול במחזור הדם משני עכברים נפרדים.

בתרבית ממודל עכבר סינגנאי אורתוטופי של קרצינומה של התאים הכבדיים (hepatocellular carcinoma). תאי גידול גרורתיים נצמדים לכלי התרבית ומתרבים במהירות. ניתן להרחיב אותם מעבר ל-25 מעברים, והם עמידים למחזורי הקפאה והפשרה חוזרים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מבודדים ומנמיים תאי גידול מעגליים חיוניים, וכן לגבי האופן שבו מאפיינים אותם הן ברמה המולקולרית והן ברמה התפקודית.