Name: בידוד וריבוי תאים סרטניים במחזור מסרטן מודל עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: למדו לבודד ולרבות תאים סרטניים ממחזור הדם במודל עכבר של מסרטן כבד. שיטה זו מספקת מודל שחזורי לחקר גרורות וליישומים קליניים עתידיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה במעבדה של ד"ר אוגונוובי נתמכת על ידי מענק של תוכנית מרכזי מחקר במוסדות מיעוטים מהמכון הלאומי לבריאות מיעוטים ופערי בריאות (MD007599) של המכונים הלאומיים לבריאות. התוכן של כתב יד זה הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של ה-NIMHD או ה-NIH.

הצהרת אתיקה: כל המחקרים בבעלי החיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) של האנטר קולג &#39;של האוניברסיטה של ​​העיר ניו יורק. 1. נהלים טרום ניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם ההגעה למתקן בעלי החיים, בתחילה בית 3 עכברי BALB / ג לכלוב עם מצעים העליונים ועץ שבב מסונן. ודא שיש לי העכברים גישה חופשית למזון, אוכל מכרסם פורינה, ומים. מצעים ומזון צריכים להיות מוחלפים פעמיים בשבוע בזמן שיש לנקות כלובי פעם בשבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום להרדמה כללית בעכברים באמצעות מכשיר אדים isoflurane יחד עם חמצן בקצב זרימה קבוע של 1 ליטר לדקה. המערכת היא עצמאית וכוללת מאדה דיוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעלי החיים מיקום בקופסא פלסטיק שיש מאדה הדיוק וגז / מערכת הרדמה המחוברת אליו. בתחילה להגדיר את מאדה 2.5 עד בעלי החיים הוא חסרי הכרה, ובשלב זה להפחית את האידוי 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באותו זמן, לעבורקו שסתום, איטום אותו לתיבה ולפתוח אותו לחרטום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את בעלי החיים לאזור ההכנה, עם החרטום ממוקם כראוי ומחובר (להרדמת תחזוקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 5 × 10 6 תאי HCC עכבר BNL 1ME A.7R.1 להשתלה לכל עכבר. BNL 1ME A.7R.1 צריך להיות גדל במדיום (10% חום מומת FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין ו -2 מ&quot;מ L- גלוטמין) דוגרים בצלחת תרבית תאים על 37 מעלות צלזיוס בחממה humidified עם אוויר ו -5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מזרק שיש 20 מחט G, של PBS 100 μl השתל המכיל 5 x 10 6 תאים קרצינומה hepatocellular עכבר BNL 1ME A.7R.1 לאונה של הכבד של עכברים / ג BALB לייצר גידולים הראשוניים. לאחר השתלה, בית העכברים / ג BALB בכלוב עם אותן דרישות הבית כטרום השרשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודת סיום הניסוי, עדות קלינית של קרצינומה hepatocellular היא נצפית כירידה משמעותית במצב גוףציון (בדרך כלל מזוהה לאחר 4 שבועות). בשלב זה, יש סיכוי שגידולים ראשוניים פיתחו בכבד ואילו פיקדונות גרורתי יצרו את הריאות. לאחר מכן, להתחיל התהליך של הבידוד והתפשטות תאים סרטניים במחזור. </li></ol> 2. אוסף של דם מלא למחזור בידוד תאים סרטניים הערה: כראוי מחוטאת אזור הניתוח ולוודא שהוא נטול עומס. החיטוי כל מכשירי הניתוח או לטבול בחומר חיטוי בהתאם להמלצת יצרן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב עכברים על ידי המתת חסד הומנית בנקודת סיום ניסוי (עדות קלינית של התפתחות גידולים). מתת חסד של עכברים צריכה לערב CO 2 מחנק. שים לב לעכברים כראוי כדי לאשר הרדמה מופץ בצורה נכונה. פחמן דו חמצני יש לשחרר באיטיות לתוך התא על פני תקופה של 5 - 10 דקות, גורמים לדום נשימה. עקוב ידי exsanguination וcervic intracardiacאל עקירה. 5 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במחט 25 G מצורפת מזרק 1 מיליליטר לאוסף של כל דם. Heparanize המזרק עם 0.01 מיליליטר הפרין. עור לנקב מייד עם המחט נחותה xyphisternum הזווית של 45 מעלות בכ. קידום מחט לאט לנקב את הלב, ואז להנמיך את הזווית של המחט. הולך ומתפשט המחט ומזרק במקום, ולצייר את 500 μl - 1,000 μl של כל דם מהלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המזרק ומחט ולהעביר את הדם לתוך צינור ללא pyrogen 1.5 מיליליטר שכותרתו מראש. צנטריפוגה כל הדם שנאסף לתוך 1.5 מיליליטר צינור ללא pyrogen ב1,167 XG במשך 5 דקות. הערה: צנטריפוגה שמפריד בין כל דגימת הדם לשלוש שכבות: השכבה התחתונה או המטוקריט המורכב מתאי דם אדומים, שכבת ביניים דקה של מעיל באפי, ושכבה עליונה פלזמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפלזמה בקפידה על ידי pipetting ואיסוף אותו לתוך צינור 1.5 מיליליטר pyrogen ללא נפרד לפירטניסויים אה כגון זיהוי של חומצות גרעין תא ללא 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבידוד של תאי גידול במחזור (CTCs), לאסוף את המעיל באפי לתוך צינור ללא pyrogen נפרד 1.5 מיליליטר בהכנה לתאי דם אדומים תמוגה (RBC). זה הכרחי כדי להסיר RBCs שייר בשכבת המעיל באפי. </li></ol> 3. מתכון לתאי דם אדומים (RBC) תמוגה מאגר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון 1 ליטר של חיץ תמוגה RBC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 500 מיליליטר של אמוניום כלוריד ו -500 מיליליטר של טריס. אז לערבב כדי ליצור פתרון 1 ליטר של חיץ תמוגה RBC עם ריכוז סופי של 155 מ&quot;מ של אמוניום כלוריד ו -10 מ&quot;מ של טריס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ הפתרון לpH של 7.5. אחסן את מאגר תמוגה RBC ב2-8 מעלות צלזיוס, ולהביא לRT מייד לפני שימוש. </li></ol> 4. RBC תמוגה של מעיל באפי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של חיץ תמוגה RBC לצינור 1.5 מיליליטר סטרילי ללא pyrogen מכיל מעיל באפי שנאסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את התוכן של הצינור על ידיהיפוך מספר רב של פעמים. דגירה התוכן מעורב של הצינור במשך 5 דקות ב RT על הספסל. צנטריפוגה התוכן המעורב במשך 5 דקות ב1,167 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, תתקבל גלולה לבנבן. בטל supernatant האדמדם לאט ובזהירות לאקונומיקה 10% ללא כל הפרעה לגלולה. אם גלולה היא לא לבנבן, מחדש לעשות צעדים 3.1-3.5. הגדלת זמן הדגירה במאגר תמוגה RBC עד 10 - 15 דקות יכולה להיות גם מועילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בבטחה להיפטר הפסולת הביולוגית פעם טיהור שפכים ביולוגיים באקונומיקת 10% תושלם לאחר 24 שעות. </li></ol> 5. ריבוי בתרבית תאים הערה: תאי גידול בדרך כלל גדלו במהירות תאי תאי דם לבנים שנמצאים בשפע בשילוב המקורי של תאי זרע לתוך הצלחת. בעקבות שינוי חוזר ונשנה של מדיום, והמעברים הבאים של CTCs, כל תאי הדם הלבנים יוסרו ואוכלוסייה טהורה יחסית של CTCs נשארה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחרהשלכת supernatant לתוך 10% אקונומיקה, לשטוף את הכדור לבנבן ב1 נאגר מלוח פוספט מיליליטר (PBS) לפחות פעם אחת, וגלול במדיום התרבות השלם לריבוי בתרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע לשטוף הושלם, להוסיף 1 מיליליטר של מדיום מלא BNL 1ME תרבות A.7R.1 (חום 10% מומת FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין ו2 מ&quot;מ L-גלוטמין) לגלולה וresuspend גלולה במדיום התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי תערובת resuspended של תאים לתוך צלחת תרבית תאים. דגירה צלחת תרבית תאים על 37 מעלות צלזיוס בחממה humidified עם האוויר ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את מדיום תרבית תאים בכל יומיים-שלושה. לאחר חמישה עד שבעה ימים, CTCs יהיה דבק בצלחת תרבית תאים והתחיל מתרבים. תאים אלה יישארו קיימא מעבר 25 קטעים ואחרי מחזורי הקפאה להפשרה חוזרים ונשנים 5. </li></ol> 6. אימות של Hepatocellular Carcinoma מחזור קו תאים סרטניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע APolymerase תגובת שרשרת שיטה מבוססת (PCR), כדי להגביר קטע DNA ספציפי אחד של גן העכבר β-גלובין כדי לאשר שהרומן הוקם שורות תאי CTC הן תאי עכבר כמו הקו המקורי המושתל BNL 1ME A.7R.1 HCC. שיטה שתוארה במקור ומאומתים על ידי Steube et al. 5,8 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע immunostaining לאלמנט התגובה cAMP סמן hepatocyte הספציפי מחייב חלבון 3 כמו-3 (CREB3L3) באמצעות נוגדן ספציפי. זה יאשר שהרומן CTCs הוקם אכן hepatocytes כמו קו התא המקורי המושתל BNL 1ME A.7R.1. 5 </li></ol>

<ol><li>Ashworth, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+case+of+cancer+in+which+cells+similar+to+those+in+the+tumors+were+seen+in+the+blood+after+death%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">A case of cancer in which cells similar to those in the tumors were seen in the blood after death.</a> Australian Medical Journal. 1869, 146-147 (14).</li>
<li>van de Stolpe, A., den Toonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Tumor+Cells%3A+What+Is+in+It+for+the+Patient%3F+A+Vision+towards+the+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Circulating Tumor Cells: What Is in It for the Patient? A Vision towards the Future.</a> Cancers. 6, 1195-1207 (2014).</li>
<li>Sheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture%2C+release+and+culture+of+circulating+tumor+cells+from+pancreatic+cancer+patients+using+an+enhanced+mixing+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip.</a> Lab on a chip. 14, 89-98 (2014).</li>
<li>George, T. J., Ogunwobi, O. O., Sheng, W., Fan, Z. H., Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Tissue+is+the+issue%22%3A+circulating+tumor+cells+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+gastrointestinal+cancer%22%5BJournal%5D)">"Tissue is the issue": circulating tumor cells in pancreatic cancer.</a> Journal of gastrointestinal cancer. , (2014).</li>
<li>Ogunwobi, O. O., Puszyk, W., Dong, H. J., Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+upregulation+of+HGF+and+c-Met+drives+metastasis+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Epigenetic upregulation of HGF and c-Met drives metastasis in hepatocellular carcinoma.</a> PloS one. 8, e63765(2013).</li>
<li>Cheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent%2C+biocompatible+nanostructured+surfaces+for+cancer+cell+capture+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Transparent, biocompatible nanostructured surfaces for cancer cell capture and culture.</a> International journal of nanomedicine. 9, 2569-2580 (2014).</li>
<li>Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+approaches+to+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization.</a> The Journal of cell biology. 192, 373-382 (2011).</li>
<li>Steube, K. G., Koelz, A. L., Drexler, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+verification+of+rodent+cell+lines+by+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Identification and verification of rodent cell lines by polymerase chain reaction.</a> Cytotechnology. 56, 49-56 (2008).</li>
<li>Pantel, K., Alix-Panabieres, C., Riethdorf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+micrometastases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Clinical+oncology%22%5BJournal%5D)">Cancer micrometastases.</a> Nature reviews. Clinical oncology. 6, 339-351 (2009).</li>
<li>Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+clinical+relevance+and+specific+biological+properties+of+disseminating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells.</a> Nature reviews. Cancer. 8, 329-340 (2008).</li>
<li>Cristofanilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%2C+disease+progression%2C+and+survival+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> The New England journal of medicine. 351, 781-791 (2004).</li>
<li>De Giorgi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+and+bone+metastases+as+detected+by+FDG-PET%2FCT+in+patients+with+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+oncology+%3A+official+journal+of+the+European+Society+for+Medical+Oncology+%2F+ESMO%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells and bone metastases as detected by FDG-PET/CT in patients with metastatic breast cancer.</a> Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO. 21, 33-39 (2010).</li>
<li>Eloubeidi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoscopic+ultrasound-guided+fine+needle+aspiration+biopsy+of+patients+with+suspected+pancreatic+cancer%3A+diagnostic+accuracy+and+acute+and+30-day+complications%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Endoscopic ultrasound-guided fine needle aspiration biopsy of patients with suspected pancreatic cancer: diagnostic accuracy and acute and 30-day complications.</a> The American journal of gastroenterology. 98, 2663-2668 (2003).</li>
<li>O'Toole, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+complications+of+EUS-guided+fine-needle+aspiration%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointestinal+endoscopy%22%5BJournal%5D)">Assessment of complications of EUS-guided fine-needle aspiration.</a> Gastrointestinal endoscopy. 53, 470-474 (2001).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

במחקר זה תוארו כיצד לבודד ולהפיץ CTCs מדם מלא של עכבר סינגני עם HCC. מטרת עבודה זו היא לשפר את המחקרים המתמשכים של מנגנוני הגרורות הסרטניות. 
גורם התורם לפרוגנוזה גרועה של סוגי סרטן רבים הוא היעדר גילוי בזמן וכתוצאה מכך הפצה נרחבת של הממאירות3. CTCs מקורם בסרטן ראשוני ומתפשטים דרך זרם הדם לאיברים מרוחקים. ככזה, CTCs חשובים בגרורות סרטניות ויש להם פוטנציאל ליישומים קליניים מרובים, כגון לאבחון3,9,10. זה נתמך על ידי נתונים ממספר מחקרים קליניים שהראו כי ל-CTCs יש מתאם חזק עם ...

קהילת חקר הסרטן ידעה על קיומם של תאי גידול במחזור (CTC) מאז שנצפו לראשונה על ידי תומאס אשוורת' בשנת 18691. מאז, CTCs הוכחו כחשובים בגרורות גידול ובהתקדמות המחלה2-5. כיום, גידולים מוצקים הם גורם עיקרי לתחלואה ותמותה ברחבי העולם. CTCs הם תאים נדירים שמקורם בגידולים ראשוניים ועוברים דרך זרם הדם לאיברים שונים שרק חלק קטן מהם מתפתח בסופו של דבר לגרורות2-5. יש לציין כי קיים מתאם חיובי בין גודל הגידול למספר CTC3,4. 
הבנה של ביולוגיה של CTC יכולה לתרום לחיפוש אחר טיפול ממוקד. יתר על כן, ל-CTCs עשויים להיות יישומי אבחון. כדי להשיג את היישומים הקליניים הפוטנציאליים הללו, יש להתגבר על כמה אתגרים עכשוויים לחקר CTCs. אתגר אחד קשור לעובדה ש-CTCs עשויים להיות נוכחים כתאים בודדים או כאשכולות והם עשויים אפילו להיות מסוגלים לשנות את הפנוטיפ שלהם בתגובה למיקרו-סביבת הדם2. יתר על כן, גילוי יכול להיות מאתגר מאוד, בין היתר בשל הספירה הנמוכה של CTCs (כמה עד מאות למיליליטר) בקרב מיליארד תאים המטולוגיים למיליליטר בדם6. עם זאת, בשנים האחרונות התעצם המחקר על היישומים הקליניים הפוטנציאליים של CTCs מסרטן איברים מוצקים.
למרות מאמצים אלה, האתגרים של לימוד והבנת תפקידם של CTCs נמשכים בשל נדירותם של CTCs וחוסר הכלים הטכנולוגיים הזמינים כיום. למרות האתגרים הללו, הפוטנציאל האדיר ליישומים קליניים ממשיך להוות תמריץ להמשיך במחקר על תפקידם של CTCs בגרורות סרטניות.
לאחרונה הצלחנו לבודד ולהתרבות CTCs בתרבית תאים ממודל עכבר סינגני אורתוטופי של גרורות קרצינומה הפטו-תאית (HCC)5. מטרת המאמר הנוכחי היא לתאר בפירוט את כל ההיבטים של המתודולוגיה המוצלחת. המשמעות של מתודולוגיה זו נעוצה בעובדה שניתן לשנות גישה זו על מנת לבודד ולהפיץ בהצלחה CTCs אנושיים בתרבית, ובכך לשפר את האפשרות למחקרי מבחנה של ביולוגיה של CTC. 
ישנם מספר יישומים קליניים פוטנציאליים לשימוש ב-CTCs. CTCs עשויים להיות שימושיים לפרוגנוזה, ניטור תגובה, סינון, ניטור דינמי של שינויים מולקולריים בגידול וטיפול מותאם אישית4. לכן, להבנה טובה יותר של הביולוגיה של CTCs יש פוטנציאל גבוה להשפעה קלינית.

<table><tbody><tr><td>מלח נתרן הפרין 1 גרם</td><td>VWR</td><td>89508-852</td><td></td></tr><tr><td>BTX שפופרת מיקרו 1.5 מ"ל שקוף NS</td><td>VWR</td><td>89511-254</td><td>1.5 מ"ל&nbsp; צינורות אפנדורף ללא פירוגן</td></tr><tr><td>מחט סטרילית Disp BD 25 גרם x 1 ב</td><td>- VWR</td><td>BD305125</td><td>25 גרם מחט</td></tr><tr><td>Slp Tip SRNG 1 מ"ל 200 כל אחד לחבילה</td><td>VWR</td><td>BD309659</td><td>1 מ"ל קצה מזרק</td></tr><tr><td>מזרק 1 מ"ל leur lok Pk 100</td><td>VWR</td><td>BD309628</td><td>1 מ"ל מזרק</td></tr><tr><td>VWR רקמות מלקחיים 6</td><td>VWR</td><td>82027-446</td><td>מלקחיים</td></tr><tr><td>Cyromold intrm 15 x 15 x 5 מ"מ PK 100</td><td>VWR</td><td>25608-924</td><td>Cyromold</td></tr><tr><td>Cryo-oct compund 4 oz</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>Oct compound</td></tr><tr><td>VWR Slide sprfrst 25 x 75 מ"מ PK72</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td>שקופיות</td></tr><tr><td>VWR כיסוי זכוכית #2 22 x 50 מ"מ</td><td>VWR</td><td>48-382-128</td><td>כיסוי זכוכית</td></tr><tr><td>VWR תיבת שקופיות אמיתי צפון fm pu</td><td>VWR</td><td>89140-278</td><td>תיבת שקופיות</td></tr><tr><td>סופר HT PAP עט</td><td>VWR</td><td>89427-058</td><td>PAP עט</td></tr><tr><td>מים RNASe ו- DNA חינם 2 L</td><td>VWR</td><td>101454-204</td><td>מאגר מים ללא נוקלאז</td></tr><tr><td>Tris Ultra טהור כיתה 500 גרם</td><td>VWR</td><td>97061-796</td><td>Tris Buffer</td></tr><tr><td>אמוניום כלוריד ACS כיתה 2, 5 ק"ג</td><td>VWR</td><td>97062-048</td><td>אמוניום כלוריד חוצץ</td></tr><tr><td>פלקון צלחת תרבית רקמות בז 60 x 15 מ"מ סגנון פוליסטירן</td><td>VWR</td><td>353002</td><td>צלחת תרבית רקמות</td></tr><tr><td>Clorox Germicidal Bleach, רגיל</td><td>VWR</td><td>89501-620</td><td>Clorox Bleach</td></tr><tr><td>PBS, 1x (מי מלח חוצץ פוספט) ללא סידן ומגנזיום (500 מ"ל)</td> <td>Thermo Fischer Scientific</td><td>21-040-CV</td><td>PBS, 1x</td></tr><tr><td>DMEM, 1x&nbsp; עם 4.5 גרם/ליטר גלוקוז & L-גלוטמין ללא נתרן פירובט</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>10-017-CV</td><td>DMEM 1x מדיה לתאי BNL 1ME A.7R.1</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>35-010-CV</td><td>FBS</td></tr><tr><td>פניצילין תמיסת סטרפטומיצין, 100x</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>30-002-Cl</td><td>פניצילין סטרפטומיצין</td></tr><tr><td>סורוול ביופוגה פיקו</td><td>תרמו פישר 75002411</td><td></td> <td>מדעיצנטריפוגה 13,000 סל"ד</td></tr></tbody></table>

בידוד וריבוי תאים סרטניים במחזור מסרטן מודל עכבר

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

גרורות סרטניות הן הגורם העיקרי למקרי מוות הקשורים לסרטן. מחקרים אחרונים הראו שתאי גידול במחזור (CTC) חשובים בגרורות סרטניות. ואכן, מספר ה-CTCs נמצא בקורלציה עם גודל הגידול. כאן, ניתן תיאור מפורט של מתודולוגיה לבידוד והתפשטות של CTCs ממודל עכבר סינגני של קרצינומה הפטו-תאית (HCC) המאפשר ניתוח במורד הזרם של מנגנונים מולקולריים בעלי פוטנציאל חשוב של גרורות גידול באיברים מוצקים. שיטה זו יעילה וניתנת לשחזור. זוהי טכניקה לא פולשנית ולכן יש לה פוטנציאל להחליף ביופסיה פולשנית של רקמות מבני אדם שעלולה להיות קשורה לסיבוכים. לכן, השיטה הנדונה כאן מאפשרת בידוד והתפשטות של CTCs מדגימות דם מלאות כך שניתן יהיה לבחון ולאפיין אותן. יש לכך פוטנציאל להסתגלות עתידית ליישומים קליניים כגון אבחון וטיפול ממוקד מותאם אישית.

המתודולוגיה שתוארה כאן הוכיחה כי יכול להיות מבודד CTCs. עכברים מורדמים אנושיים בנקודת סיום ניסוי. מחנק התהליך מעורב פחמן דו חמצני, exsanguination פנים-לב, ונקע בצוואר הרחם. סכמטי של שלבים העיקריים של ההליך הם באיור 2. דגימות דם כל שנאספו על ידי exsanguination פנים-לב עובדו באמצעות הפרוטוקול שתואר לעיל. לאחר ש, צנטריפוגה שימשה כדי לקבוע את שכבת מעיל באפי שהיה נתון לתמוגה RBC. זה היה לאחר מכן על ידי צנטריפוגה צעד אחר לאסוף גלולה לבנבן שנשטפה ב- PBS, וresuspended במד...

תאי גידול במחזור הדם (CTCs) הוכחו כממלאים תפקיד חשוב בגרורות גידול. כאן, מתוארת שיטה לבידוד והתפשטות של CTCs מהדם המלא של מודל גידול עכבר סינגני של גרורות קרצינומה של הכבד (HCC).

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לבודד ולהנמיח תאי גידול במחזור הדם מדם מלא של מודל עכבר סינגנאי של גידול עם גרורות של קרצינומה של התאים הכבדיים (hepatocellular carcinoma). פעולה זו מבוצעת תחילה על ידי צנטריפוגה של הדם המלא שנאסף מהעכברים ובידוד שכבת ה-buffy coat. לאחר מכן, תאי הדם האדומים בשכבת ה-buffy coat עוברים ליזיס ותאי הגידול במחזור הדם נאספים למשקע (pellet).לאחר מכן שוטפים את התאים, תולים אותם במצע גידול מלא ומגדלים אותם בתרבית תאים. תאי הגידול הגדלים במהירות נותרים חיוניים לאורך מעברים רבים וניתן לאמת את זהותם באמצעות טכניקות אבחון מולקולריות סטנדרטיות. המשמעות של בידוד תאי גידול נדודים באמצעות הטכניקה שלנו היא שהיא מספקת מודל הניתן לשחזור, אשר ניתן לאופטימיזציה לשימוש פוטנציאלי במסגרת קלינית.מי שתדגים את הפרוצדורה היא מישל נאדו (Michelle Nadu), סטודנטית לתואר ראשון מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, יש לאסוף דם מלא ממודל גידול Ciea Kamau עם גרורות של קרצינומה של תאי הכבד (hepatocellular carcinoma), כפי שמתואר ב-J of vertical נפרד. יש לסובב את הדם המלא שנאסף בצנטריפוגה במהירות של 1,167 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.לאחר ההפרדה לשכבות, הסר בזהירות את שכבת הפלזמה העליונה והעבר אותה למבחנה נ separate בנפח 1.5 milliliter שהיא ROGEN free עבור ניסויים נוספים, כגון גילוי חומצות גרעין חופשיות (cell-free nucleic acids). לאחר מכן, העבר את שכבת ה-Buffy coat למבחנה נפרדת בנפח 1.5 milliliter שהיא ROGEN free כהכנה לליזיס של תאי דם אדומים. פעולה זו נחוצה כדי להסיר תאי דם אדומים שנותרו בשכבת ה-Buffy coat לפני בידוד של תאי גידול במחזור הדם (circulating tumor cells).התחילו בהכנת תמיסת בופר לליזה של תאי דם אדומים בנפח של ליטר אחד, בריכוז סופי של 155 millimolar ammonium chloride ו-10 millimolar triss. התאימו את ה-pH של התמיסה ל-7.5. קחו אליקוט של כ-שני עד ארבעה milliliter ממלאי הבופר להליזה של תאי דם אדומים בנפח של ליטר אחד.לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של בופר לליזה של תאי דם אדומים למבחנה המכילה את שכבת ה-buffy coat שנאספה. ערבבו את תוכן המבחנה על ידי הפיכתה מספר פעמים. לאחר מכן, הדגירו את המבחנה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר על השולחן.בשלב הבא, סבב במצנטריפוגה את התוכן המעורב למשך חמש דקות. ב-1,167 ×g לאחר הסבב, יתקבל משקוף לבנבן. השלך את הנוזל העליון האדמדם לאט ובזהירות לתוך bleach 10%, ללא הפרעה למשקוף.לאחר השלכת הנוזל העליון (supernatant), שטפו את המשקע הלבנבן ב-1 ml של PBS. לאחר מכן, השקיפו את התאים שוב והמיסו אותם מחדש במצע גידול מלא. העבירו את התאים שהומסו מחדש לכלי גידול תאים והדגירו אותם בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח עם אוויר ו-5% carbon dioxide.החליפו את מצע תרבית התאים מדי יומיים עד שלושה ימים. לאחר חמישה עד שבעה ימים, תאי גידול גרורתיים (circulating tumor cells) יידבקו לכלי תרבית התאים ויתחילו להתרבות. כדי לוודא שתאי הגידול הגרורתיים של קרצינומה של תאי הכבד (hepatocellular carcinoma) בודדו כראוי.בצע PCR למקטע ספציפי של הגן beta globin בעכבר, כפי שתואר ותוקף על ידי Stu. לאחר מכן, בצע צביעה אימונוהיסטוכימית לתאים באמצעות נוגדן ספציפי לסמן התאי של ההפטוציטים Cyclic A MP responsive element binding protein three like three בשיטות סטנדרטיות המוצגות כאן; אלו הן תמונות מייצגות של תאי גידול במחזור הדם משני עכברים נפרדים.בתרבית ממודל עכבר סינגנאי אורתוטופי של קרצינומה של התאים הכבדיים (hepatocellular carcinoma). תאי גידול גרורתיים נצמדים לכלי התרבית ומתרבים במהירות. ניתן להרחיב אותם מעבר ל-25 מעברים, והם עמידים למחזורי הקפאה והפשרה חוזרים.לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מבודדים ומנמיים תאי גידול מעגליים חיוניים, וכן לגבי האופן שבו מאפיינים אותם הן ברמה המולקולרית והן ברמה התפקודית.

isolation-propagation-circulating-tumor-cells-from-mouse-cancer

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

הסרטון מתאר את הטכניקה להזרקה עקתית של תאים סרטניים לפיתוח מודל עכבר אורתוטופי עם גידולים אחידים ביותר. לכן, מודל העכבר האורתוטופי מאפשר הדמיה מציאותית של גרורות, ומספק כלי רב ערך לחקר השינויים בפנוטיפ במהלך צמיחת הגידול והפצתו.

הזרקת תאי גידול עקבתיים: טכניקה להעברת תאים סרטניים להקמת מודל עכבר אורתוטופי לסרטן המעי הגס

סרטון זה מתאר פרוטוקול מפורט לבידוד תאי גידול במחזור הדם מכל דגימת הדם של מודל עכבר גידול מעי גס שעבר המתת חסד. ניתן לתרבית CTCs מבודדים אלה ולהשתמש בהם לניתוח מיועד במורד הזרם.

בידוד CTC מדגימת דם שלמה: שיטה להשגת CTCs ממודל סרטן המעי הגס מורין

ההתפשטות הגרורה של הסרטן היא הסיבה העיקרית למוות הקשורים לסרטן. אנו מספקים תיאור מעמיק של מתודולוגיה ניתוח ההישרדות שלנו להקמת מערכת "חולה-כמו" orthotopic מודל עכבר syngeneic לחקר המנגנונים של גרורות בגידולים מוצקים איבר.

&quot;מטופל כמו&quot; Orthotopic syngeneic עכבר הדגם של Hepatocellular Carcinoma גרורה

אנו מדווחים על שיטה אמינה לבידוד ותרבית תאי אנדותל ראשוניים ספציפיים לגידול ממודלים של עכברים מהונדסים גנטית.

הרחבת בידוד והתרבות של תאי האנדותל גידול ספציפי

כתב יד זה מפרט שיטה המשמשת ליצירת קסנוגרפלים שמקורם בחולי סרטן הערמונית (PDX) מתאי גידול במחזור (CTCs). יצירת מודלים PDX מ-CTCs מספקת מודל ניסיוני חלופי לחקר סרטן הערמונית; הגידול המאובחן השכיח ביותר וסיבת מוות שכיחה מסרטן אצל גברים.

דור של חולה סרטן הערמונית נגזר מודלי xenograft ממחזור תאים סרטניים

אנו מתארים את הקמתם של גידולים המעי הגס אורטוטופיים באמצעות הזרקה של תאים סרטניים או אורגנואידים לתוך cecum של עכברים הבידוד הבאים של תאים סרטניים במחזור (CTCs) מן המודל הזה.

בידוד של תאים סרטניים במחזור מודל עכבר אורתופטי של סרטן המעי הגס

במודל חיה יש צורך לפענח את התפקיד של מחזורי תאים סרטניים (CTCs) בקידום קולוניזציה ריאות במהלך גרורות סרטן. . הנה, הקמנו, לבצע בהצלחה של ויוו assay לבדוק באופן ספציפי את הדרישה של הרכבה fibronectin פולימריים (polyFN) על CTCs ריאות קולוניזציה.

הקמת Assay קולוניזציה הריאה עבור מחזור הגידול ויזואליזציה תאים ברקמות הריאה

כאן, אנו מציגים זרימת עבודה משולבת כדי לזהות תכונות פנוטיפקס ומולקולריות המאפיינות תאים סרטניים במחזור (CTCs). אנו משלבים כתמים חיים ומיקרומניפולציה רובוטית של CTCs יחיד ומקובצים עם שיטות מבוססות תא יחיד עבור ניתוח המטה והערכה של גרורות-זריעת היכולת.

מיקרומניפולציה של במחזור תאים סרטניים לניתוח מולקולרי במורד הזרם והערכה פוטנציאלית גרורתית

פרוטוקול זה מתאר שיטה המיומנת לבידוד של תאים ראשוניים של העכבר השרירים, היווצרות tumorsphere וטיפול, השתלת השתלת החל בתרבויות tumorsphere.

והטיפול מתאי הגידול הראשוניים מבודדים מעכבר תמס שריר

Culturing CTCs מאפשר אפיון תפקודי עמוק יותר של סרטן, באמצעות הבעת ביטוי סמן ספציפי, והערכת עמידות לתרופות ואת היכולת ליישב את הכבד בין אפשרויות אחרות. בסך הכל, תרבות CTC יכולה להיות כלי קליני מבטיח לרפואה מותאמת אישית כדי לשפר את תוצאות המטופל.

קווי תאים סרטניים במחזור: כלי חדשני למחקר יסודי ותרגום

תרגום ממצאי המיקרוסקופ התוך-חיוני מאותגר על ידי חדירת העומק הרדוד שלו לרקמה. כאן אנו מתארים מודל עכבר תא חלון גבי המאפשר רישום משותף של מיקרוסקופיה תוך חיונית ושיטות הדמיה ישימות קלינית (למשל, CT, MRI) למתאם מרחבי ישיר, מה שעשוי לייעל את התרגום הקליני של ממצאי מיקרוסקופ תוך חיוני.

מודל עכבר גידול בתא החלון הגבי למיקרוסקופיה תוך-חיונית משולבת והדמיית תהודה מגנטית בחקר סרטן תרגומי

למדו לבודד ולרבות תאים סרטניים ממחזור הדם במודל עכבר של מסרטן כבד. שיטה זו מספקת מודל שחזורי לחקר גרורות וליישומים קליניים עתידיים.

בידוד וריבוי תאים סרטניים במחזור מסרטן מודל עכבר

גלה סרטונים נוספים