Name: בידוד של לויקוציטים מממשק האדם-האימהי העוברי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: למדו לבודד לויקוציטים מהדצידואה האנושית באמצעות פירוק מכני ועיכול אנזימטי. שיטה זו שומרת על סמני שטח תאיים לניתוח ציטומטרי ומאפשרת יישומים במחקר אימונולוגי של ממשק האם-עובר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מכון יוניס קנדי שרייבר הלאומי לבריאות ילד והתפתחות אדם, NIH / DHHS. עבודה זו נתמכה גם, בחלקו, על ידי Perinatal אוניברסיטת היוזמה ויין מדינה באימהי, Perinatal ובריאות ילד. הכרת תודה אנו מודים מורין McGerty (אוניברסיטת ויין סטייט) לקריאה הביקורתית של כתב היד.

פרוטוקול זה מתאים לבידוד יקוציט מbasalis decidua וparietalis decidua בהכנה לimmunophenotyping ידי cytometry זרימה. יתר על כן, התאים המבודדים יכולים לשמש למיון תא, תרבית תאים, בידוד RNA, וציטולוגיה. לפני העבודה עם הדגימות שהוזכרו בפרוטוקול זה, יש לקבל את האישור אתי אנושי מהוועדה המקומית לחקר האתיקה ולוחות סקירה מוסדית. האיסוף והניצול של דגימות אנושיות למטרות מחקר אושרו על ידי לוחות הסקירה המוסדית של המכון הלאומי יוניס קנדי שרייבר לבריאות ילד והתפתחות אדם (NICHD), מכון הלאומי לבריאות (NIH), מחלקת בריאות ושירותי אנוש (DHHS , Bethesda, MD, ארה&quot;ב) והאוניברסיטה ויין סטייט (דטרויט, מישיגן, ארה&quot;ב). נכתב הסכמה מהדעת התקבלה מכל הנשים בהריון לפני האוסף של דגימות רקמה. הערה: בעת שעבדה בדם של בעלי חיים, תאים, או מפגעסוכני היחידות הארגוניות כאמור בפרוטוקול זה, זה חיוני כי בטיחות ביולוגית נכונה ופעולות בטיחות במעבדה להיות אחריו. 1. Dissection של רקמות Decidual האדם הערה: צלחת הבסיס היא הבסיס מתחת ומחובר לשליה ומייצגת את פני השטח האימהיים. קרומי chorioamniotic כוללים amnion וסיסי. הצלחת הבסיסית כוללת basalis decidua והסיסי כולל parietalis decidua (איור 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Decidua basalis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח פיסת הצלחת הבסיסית מטבורית אחד של השליה (איורים 1 א ו -1 B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים אותו על קרש חיתוך סטרילי עם villi השליה פונה כלפי מעלה. הצד מראה villi השליה הוא בדרך כלל אדום מדם עם רקמת שעיר במראה. צלחת הבסיס חלקה וחיוורת בצבע אדום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים חדים, מספריים ועדין נקודה כדי להסיר את Villכלי רקמה ודם היחידות הארגוניות. לשמור על הרקמה הספוגה ב1x PBS (Ca 2 + - וMg 2 + - ללא תשלום) בתהליך (איור 1 ג). לאסוף 2-3 חתיכות אלה ולשטוף אותם ביסודיות עם 1x PBS להסיר הדם (1D איור). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Decidua Parietalis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח פיסת קרום chorioamniotic (כ 10 סנטימטרים x 10 סנטימטר, איור 1E). מניחים אותו על הלוח עם סיסית פונה כלפי מעלה. צד השליה מכיל קרישי דם, והוא בדרך כלל אור בצבע צהבהב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים עדין נקודה כדי להסיר כמה שיותר קרישי הדם ככל האפשר (איור 1E). יש לשטוף את הקרום בסטרילי 1X PBS כדי לנקות את הדם העודף מהקרום עד PBS 1x פועל ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מגרד תא סטרילי חד פעמי כדי לגרד את שכבת decidual מן הקרום בעדינות. החל סטרילי 1X PBS על ממBrane בעת השלמת תהליך זה (איור 1F). אסוף את רקמות decidual ולמקם אותם בצינור פלסטיק 50 מיליליטר עם סטרילי 1X PBS (איור 1G). </li></ol></li></ol> 2. מכאני disaggregation ואנזימתי עיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הרקמה גזור מbasalis decidua (משלב 1.1.3) או parietalis decidua (משלב 1.2.3) עם סטרילי 1X PBS בצינור פלסטיק 50 מיליליטר. לאסוף כדורי רקמה על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות על RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant ממוקם מעל גלולה הרקמה בזהירות מבלי להפריע גלולה. הערה: בשלב זה, את כדורים הם רופפים מאוד משום שהם מכילים תאי דם אדומים. אם הנפח של גלולה הוא על או פחות מ 3 מיליליטר, מחדש להשעות את גלולה ב 6 מיליליטר של תמיסת ניתוק תא מחומם מראש ל -37 מעלות צלזיוס. אם גלולה היא גדולה יותר מאשר 3 מיליליטר של נפח, להוסיף עוד פתרון ניתוק תא (להוסיף על פי 2 הדואר נפח של דגימות הרקמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הרקמות הומוגני (basalis decidua + parietalis פתרון או decidua ניתוק תא + פתרון ניתוק תא) לצינור C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינור C בDissociator האוטומטי ולהפעיל את התכנית המתאימה. הערה: התכנית לbasalis decidua פועלת לשניות 17 עם 668 סיבובים הכולל לטווח. התכנית לparietalis decidua פועלת לשניות 37 עם 235 סיבובים הכולל לטווח. תוכניות אלה מותאמים אישית כדי לבודד לויקוציטים מbasalis decidua או parietalis decidua עם תשואה טובה וכדאיויות תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות disaggregation המכני של הרקמות, לעכל את הרקמות עם פתרון ניתוק תא זמין מסחרי כגון Accutase; (קוקטייל המכיל מפרקי חלבונים ואנזימי collagenolytic) במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה. </li></ol> 3. בידוד של לויקוציטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, להוסיף 10 מיליליטר של 1x PBS לDIGEתערובת stion ולהעביר אותו דרך מסננת תא 100 מיקרומטר לתוך צינור פלסטיק 50 מיליליטר. בהתאם לדביקות של תערובת העיכול, אחד ייתכן שיצטרך להשתמש בכמה מסננות תא לתערובת אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את הצינור עם 1x PBS ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות על RT. הסר את PBS 1x מעל כדורי התא בזהירות מחדש להשעות את כדורים עם 5 מיליליטר של חיץ FACS קר כקרח. הערה: כדי ללמוד את כדוריות דם לבנות polymorphonuclear וmononuclear יחד, עבור לשלב 6.1; ללמוד לויקוציטים mononuclear, המשך לשלב 3.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיליליטר של 20% תקשורת שיפוע צפיפות (1.077 + 0.001 g / מיליליטר) לצינור פלסטיק 15 מיליליטר וכיסוי לאט ההשעיה התא על גבי מדיה שיפוע צפיפות. בעוד שכבות המדגם, חשוב לא לערבב תקשורת שיפוע צפיפות עם ההשעיה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה עם הרוטור את נדנדה-XG ב 500 במשך 30 דקות ב 4 C ללא הבלם. זה מאוד חשוב כדי לכבות את הבלם כדי למנוע ערבוב התאים וlosing השיפוע. לויקוציטים יימצא בממשק בין תקשורת שיפוע צפיפות וחיץ FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השכבה העליונה המכילה את המאגר ופסולת תא FACS בזהירות בעזרת פיפטה. הלהקה בממשק מכילה תאי mononuclear decidual וחלק מכדוריות הדם לבנות polymorphonuclear. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את התאים בממשק לחלוטין לצינור פלסטיק 15 מיליליטר חדש. הוסף עוד נפח לפחות 3 פעמים של חיץ FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות לpelletize התאים. לשאוב supernatant ולשטוף את התאים עם חיץ FACS. Pelletize את התאים עם צנטריפוגה אחרת ב XG 300 במשך 5 דקות על RT. הערה: כדי לבצע את תרבית התאים, ראה שלב 4. כדי לבצע מיון תא, ראה שלב 5. כדי לבצע immunophenotyping, ראה שלב 6. </li></ol> 4. יישומים - תרבות סלולארי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות מחדש התאים משלב 3.7 ב 1 מיליליטר של מדיום תרבות RPMI 1640. ספירת תאי קיימא using דלפק אוטומטי תא או hemocytometer ופתרון trypan כחול 0.4%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף את הסכום של מדיום תרבות RPMI לעשות ריכוז תא של 1 x 10 6 תאים / מיליליטר. תאים מוכנים לתרבות החברה. </li></ol> 5. יישומים - בידוד של המקרופאגים לתרבית תאים ראשוניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבודד CD14 + תאים, מגנטי התווית התאים משלב 3.7 עם microbeads CD14 (20 חרוזים μl לכל 10 7 תאים), דגירה במשך 15 דקות ב 4 C, וCD14 נפרד + תאים מסוגים אחרים של תאים על ידי הפעלת שדה מגנטי. לאחר 2 שטיפות עם חיץ MACS וההסרה של השדה המגנטי, elute תאי CD14 + עודפים המגנטיים עם חיץ MACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות צנטריפוגה, מחדש להשעות את כדורי התא בינוני תרבות RPMI 1640. התאים מוכנים לציפוי (איור 2). </li></ol> 6. יישומים - immunophenotyping <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשתמש בתאים לimmunophenotyping, מחדש להשעות את התאים משלב 3.7 ב 1 מיליליטר של 1x PBS. ספירת תאי קיימא באמצעות דלפק אוטומטי תא או hemocytometer ופתרון trypan כחול 0.4%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית התאים עם צבע ניתן לתקן כדאיות (איור 3). לשטוף את התאים פעמיים עם חיץ FACS מחדש להשעות את התאים במאגר כתם. דגירה עם חוסם FCR במשך 15 דקות על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף נוגדנים תאיים מצומדת לfluorochromes. לדוגמא, בפרוטוקול זה, להשתמש באנטי-CD3, נוגדנים נגד CD19, אנטי CD14, אנטי CD15, ואנטי-CD56 (טבלה 1). דגירה של 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2 שטיפות עם 1x PBS, התאים ינותחו ב500 μl של חיץ כתם באמצעות cytometer זרימה. ייצוג של אסטרטגית gating להשתמש כדי לנתח את תת-האוכלוסיות לויקוציטים נמצאו ברקמות decidual מוצג באיור 4. </li></ol>

המחברים אינם חושפים ניגודי אינטרסים.

אפיון התכונות הפונקציונליות ופנוטיפי של חדירה לויקוציטים בממשק אימהי-העוברי האנושי הוא חיוני להבנה של מנגנוני החיסון שיובילו להפרעות הריון. כמה טכניקות שתוארו כדי לבודד לויקוציטים מהממשק אימהי-העוברי האנושי במהלך הריון 10,14,25,28,37,42,43. עם זאת, כל אחד מטכניקות אלה הוא שונה, שימושים שונים אנזימים או שילובי אנזים, דורש פעמים ניתוק שונות, אינו מציין כמויות של רקמה, והכי חשוב, לא תמיד לציין את הכדאיות של התאים המבודדים. הפרוטוקול המתואר במסמך זה מאפשר הבידוד של חדירה לו...

הריון מאופיין בשלושה שלבים ברורים חיסוניים: 1) השתלה וplacentation המוקדם הקשורים בתגובה פרו-דלקתית (כלומר, השתלה דומה &quot;פצע פתוח&quot;); 2) השליש השני ורוב השליש השלישי של הריון כאשר הומאוסטזיס חיסון מושגת באמצעות מדינה בעיקר אנטי דלקתית בממשק אימהי-העוברי; והמלטה 3), מדינה פרו-דלקתית 1-7. תאים חיסוניים יש תפקיד חשוב בויסות התגובה הדלקתית בממשק אימהי-העוברי שבו השפע שלהם ושינוי הלוקליזציה במהלך הריון 6-9. בבני אדם, הממשק אימהי-עוברי מייצג אזור של קשר ישיר בין האימהי (decidua) ועובר (סיסית או trophoblast) רקמות. ממשק זה כולל: 1) decidua parietalis שקווי חלל הרחם אינו מכוסה על ידי השליה והוא בסמיכותלlaeve סיסית; ו -2) basalis decidua, ממוקם בצלחת הבסיס של השליה שבו הוא פלש trophoblasts ביניים 10 (איור 1). האינטימיות של תחומי מגע אלה יוצר תנאים לחשיפה עוברית לאנטיגני 11-13 המערכת החיסונית של האם. שלא במפתיע, לויקוציטים מהווים עד 30-40% מתאי decidual 8,9,14,15 בנוסף לתאי סטרומה-סוג טיפוסיים ותאי בלוטות 8,14,16. התפקיד של לויקוציטים בממשק אימהי-העוברי כולל מספר רב של תהליכים הכוללים הגבלה של פלישת trophoblast 17, שיפוץ של עורקים סליליים 18,19, תחזוקה של סובלנות מצד 12,20, וחניכה של עבודת 21-26. לויקוציטים של שתי ההסתגלות וגפיים מולדים של מערכת החיסון, כלומר, תאי T, מקרופאגים, נויטרופילים, תאי B, תאים דנדריטים, ותאי NK, זוהו ברקמות decidual, ופרופורציות ומצב הפעלה הוכחו להשתנות מרחב ובזמן בכל הריון 6-10,12,14,24,27-30. הפרעות באוכלוסיית יקוציט ו / או הפונקציה משויכות הפלה ספונטנית 31, רעלת הריון 32, הגבלת גדילה תוך-רחמית 32,33, וצירים מוקדמים 7,24. לכן, המחקר של המאפיינים פנוטיפי והפונקציונליות של לויקוציטים בממשק אימהי-העוברי האנושי יאפשר הבהרת המסלולים החיסוניים dysregulated בהפרעות הריון. טכנולוגיה אחד הכלים החזקים ביותר המשמשים לקביעת הפנוטיפ ומאפיינים פונקציונליים של לויקוציטים הוא cytometry זרימה, המאפשרת ניתוח כמותי של פרמטרים מרובים בו זמנית 34-36. כדי לנתח לויקוציטים ידי cytometry זרימה, נדרש בידוד של כדוריות דם לבנות בהשעית תא בודד. לכן, שיטה להפריד הסתננות Leuיש צורך kocytes מהממשק האימהי-העוברי ללמוד פנוטיפי ומאפיינים פונקציונליים. כמה שיטות שתוארו לבודד את כדוריות דם לבנות מהממשק אימהי-העוברי האנושי 10,14,25,27,37-39. בעוד כמה להחיל disaggregation המכני 10,25,27,38, אחרים משתמשים עיכול אנזימטי 37,40 לניתוק רקמה. בגלל disaggregation המכני מייצר תשואה נמוכה וכדאיות מופחתת 41, וניתוק האנזימטית יכול להשפיע על כדאיות ופני תא שמירת סמן 42, בשיטה המתוארת במסמך זה משלב ניתוק מכאני עדין עם האנזימטית מראש טיפול להגדיל את התשואה של לויקוציטים המבודד מבלי להתפשר על כדאיות תא. שילוב דומה של שיטות הודגם כיעיל בבידוד של כדוריות דם לבנות מרקמות decidual בממשק האימהי-העוברי 39. לכן, הפרוטוקול המתואר במסמך זה כרוך Mechadisaggregation nical עם Dissociator רקמה אוטומטי שמגדיל עקביות תוך חיסכון בזמן ועבודה בהשוואה לגנדרני מסורתי עם אזמלים מנוגדים, סכיני גילוח, או מספריים כירורגיות 10,28. האנזים שנבחר לניתוק רקמה היה Accutase. שלא כמו collagenase הנפוץ 43, dispase 44, וטריפסין 45, Accutase (פתרון ניתוק תא) משלב את שני מפרקי חלבונים כלליים ופעילויות collagenolytic שתורמות לניתוק עדיין עדין יעיל 46,47. לאחר ניתוק, לויקוציטים מועשר מהאוכלוסייה הכוללת של תאי decidual ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות. תקשורת שיפוע צפיפות שונות כבר נוצלה בעבר, הנפוץ ביותר מהם Percoll (השעיה של חלקיקי סיליקה colloidal) 48 וFicoll (פולימר של סוכרוז עם משקל מולקולרי סינטטי גבוה) 49. היעילות מעולה של בידוד על ידי פולימר סוכרוז כבר previoמוצג usly 50, והפרוטוקול המתואר במסמך נוסף מוכיח שתקשורת שיפוע צפיפות זו מייצרת טוהר גבוה מספיק של לויקוציטים mononuclear. לפיכך, הפרוטוקול המתואר במסמך זה משלב disaggregation הרקמה המכני עם Dissociator אוטומטי רקמות, עיכול אנזימטי עם פתרון ניתוק תא, והפרדה לויקוציטים עם תקשורת שיפוע צפיפות (1.077 + 0.001 g / מיליליטר) כדי לבודד לויקוציטים מרקמות decidual אנושיות. פרוטוקול זה הוכח לשמר אנטיגנים פני תא יחד עם כדאיות תא. לויקוציטים המבודד יכול לשמש ליישומים מרובים הכוללים immunophenotyping עם cytometry זרימה ומחקרים תפקודיים במבחנה.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Dissection</td></tr><tr><td>כלי דיסקציה סטריליים: מספריים כירורגיים, מלקחיים ופינצטה עדינה&nbsp;</td><td>כל ספק</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>1X פוספט חוצץ מלח (PBS)</td> <td>Life Technologies</td><td></td> <td>(1X PBS)</td></tr> <tr><td>צלחות פטרי גדולות וקטנות</td><td>כל ספק</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>דיסוציאציה</חזק></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td> <td>(פתרון ניתוק תאים)</td></tr> <tr><td>סטרילי 2 מ"ל צינורות חרוטיים נעילה בטוחה</td><td>כל ספק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטי</td><td>כל ספק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 ומיקרו; מסנני תאים m</td><td>FALCON/Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל מבחנות פוליסטירן תחתון עגול</td><td>כל ספק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>העברת פיפטות</td><td>כל ספק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינורות C</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>תרבית תאים</חזקה>תרבית</td></tr> <tr><td>RPMI בינונית 1640&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>22400-089</td>(<td>1X) (10% FBS ו-1% P/S)</td></tr> <tr><td>מגלשות תא פלסטיק</td><td>Thermo Scientific</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo Scientific Corporation</td><td>HEPA Class 100</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>ISOTEMP 110</td><td></td></tr><tr><td>מונה תאים</td><td>Nexelcom</td><td>Cellometer Auto2000</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>אולימפוס CKX41</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>הפרדת תאים</חזק></td></tr><tr><td>MS עמודות</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>מפריד תאים</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td></td></tr><tr><td>30 &mu; m מסנני הפרדה מראש</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-40</td><td></td></tr><tr><td>Multistand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות חרוטיים נעילה בטוחה</td><td>כל ספק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS buffer&nbsp;</td><td></td><td></td><td>(0.5% אלבומין בסרום בקר, 2 מ"מ EDTA ו-1X PBS)<</td></tr><tr>td colspan="4"><חזק>ריאגנטים</חזקים></td></tr><tr><td>FcR חוסמים</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td> <td>(Fc Block)</td></tr><tr><td>נוגדנים אנטי-אנושיים אנטי-פני תאים&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>(טבלה 1)</td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>צבע חי/מת כדאיות</td><td>BD Biosciences</td><td>564406</td><td></td></tr><tr><td>מאגר Lyse/Fix&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>346202</td><td></td></tr><tr><td>מאגר FACS&nbsp;</td><td></td><td></td><td>(0.1% BSA, 0.05% נתרן אזיד ו-1X PBS, pH = 7.4)</td></tr> <tr><td>מאגר מכתים&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>554656</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue solution 0.4%</td> <td>Life Technologies</td><td>15250-011</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>מדיה שיפוע בצפיפות 20% (1.077 + 0.001 גרם/מ"ל)</td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>מכשירים נוספים</חזק></td></tr><tr><td>אינקובטור עם שייקר</td><td>Thermo Scientific</td><td>MAXQ 4450</td><td></td></tr><tr><td>ציטומטר זרימה</td><td>BD Biosciences</td> צנטריפוגה <td>LSR-Fortessa</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>בקמן קולטר</td><td>SpinChron DLX</td><td></td></tr><tr><td>מערכת ואקום</td><td>כל ספק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מפרק רקמות אוטומטי&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>gentleMACS Dissociator</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד של לויקוציטים מממשק האדם-האימהי העוברי

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

הריון מאופיין בחדירה של כדוריות דם לבנות ברקמות הרבייה ובממשק האימהי-עוברי (basalis decidua וparietalis decidua). ממשק זה הוא האתר האנטומי של קשר בין האם ורקמות עוברים; לכן, זה אתר חיסוני של פעולה במהלך הריון. לויקוציטים מסתנן בממשק אימהי-העוברי לשחק תפקיד מרכזי בהשתלה, תחזוקת הריון, ועיתוי של מסירה. לכן, אפיונים פנוטיפי ופונקציונליים של לויקוציטים אלה יספק תובנה המנגנונים המביאים להפרעות הריון. כמה פרוטוקולים תוארו כדי לבודד חדירה לויקוציטים מbasalis decidua וparietalis decidua; עם זאת, חוסר העקביות בחומרים הכימיים, אנזימים, ופעמים של דגירה עושה את זה קשה להשוות תוצאות אלו. מתואר כאן היא גישה חדשנית המשלבת את השימוש בDiss המכני והאנזימטית העדיןטכניקות ociation לשמר את הכדאיות ויושרה של סמנים תאיים ו תאיים בלויקוציטים מבודד מהרקמות האנושיות בממשק אימהי-העוברי. מלבד immunophenotyping, תרבית תאים, ומיון תא, היישומים העתידיים של פרוטוקול זה הם רבים ומגוונים. בעקבות פרוטוקול זה, יכולים לשמש לויקוציטים המבודדים כדי לקבוע מתילציה DNA, ביטוי של גני המטרה, במבחנה פונקציונלי יקוציט (כלומר, phagocytosis, רעיל, התפשטות תאי T, וגמישות, וכו &#39;), והייצור של מיני חמצן מגיבים בממשק אימהי-העוברי. בנוסף, באמצעות הפרוטוקול המתואר, מעבדה זו הייתה מסוגלת לתאר לויקוציטים החדשים והנדירים בממשק אימהי-העוברי.

. הנתיחה של רקמות אנושיות בממשק האימהי-עוברי (basalis decidua וparietalis decidua) מוצגת באיור 1 הליך זה כולל את הנתיחה של הצלחת הבסיסית, הכוללת את basalis decidua (איור 1 א - ד). Basalis decidua מתקבל על ידי הסרת villi השליה (הצד עוברי) מצלחת הבסיס (איור 1 ג). Parietalis decidua נאסף על ידי בעדינות מגרד את קרום כוריוני (איור 1E - F). איור 2 מציג את המורפולוגיה של מקרופאגים המבודד...

מתואר כאן פרוטוקול לבידוד ומחקר נוסף של הלויקוציטים החודרים של ה-decidua basalis ו-decidua parietalis - הממשק האם-עובר האנושי. פרוטוקול זה שומר על שלמות סמני פני התא ומניב מספיק תאים ברי קיימא ליישומים במורד הזרם, כפי שהוכח על ידי ניתוח זרימה ציטומטרית.

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד לוקוציטים מהדצידואה האנושית, מה-baus ומה-decidua paral. דבר זה מושג תחילה על ידי דיסקציה של רקמות ה-dee האנושיות מהשלייה. לאחר מכן, רקמת הדצידואה מופרדת באמצעות דגרגציה מכנית ועיכול אנזימטי.לאחר מכן, מסננים את תרחיף התאים באמצעות מסננת תאים של 100 micrometer שנשטפה ב-XPBS, ומבצעים צנטריפוגה ב-300 G למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius כדי לקבל משקע תאים. לבסוף, טוענים את תרחיף התאים מעל תמיסת מדרג הצפיפות ומבצעים צנטריפוגה, ולאחר מכן אוספים את הממשק המכיל לוקוציטים. לבסוף, ניתן להשתמש בלוקוציטים המבודדים עבור תרביות תאים לאימונופנוטיפינג ומחקרים פונקציונליים.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון דיסוציאציה מכנית או עיכול אנזימטי, הוא שהיא משלבת הפרדה מכנית של רקמה עם אסוציאטור רקמות אוטומטי ועיכול תמטי עם Accutane ובידוד לוקוציטים באמצעות גרדיאנט צואי. פרוטוקול זה הוכח כמשמר אנטיגנים על פני השטח של התאים ובחיוניות התאים, והשלכותיו נשתרות להבנת התכונות הפונקציונליות והפנוטיפיות של לוקוציטים חודרים בממשק העובר-אם הקשורים לפתוגנזה של סיבוכים טרום-לידתיים. איסוףם ושימושם של דגימות אנושיות למטרות מחקר אושרו על ידי ועדת האתיקה המוסדית של ה-Eunice Kennedy Shriver, המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם, המכונים הלאומיים לבריאות, מחלקת הבריאות ושירותי האנוש, ואוניברסיטת Wayne State.הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל הנשים ההרות לפני איסוף דגימות הרקמה. ראשית, חתכו פיסה מהלוח הבזאלי (basal plate) מאחד מלוחות השליה. הניחו אותה על קרש חיתוך סטרילי כאשר הסימנים השליתיים (placental vli), הנראים באדום דמי ובעלי מראה שיעורי, פונים כלפי מעלה.הלוח הבסיסי הוא חלק ובעל גוון אדום בהיר; בעוד הרקמה נשארת מושרית ב-XPBS אחד, השתמש במספריים דקים בעלי קצה חד ובפינצטה כדי להסיר את רקמת הסיסים וכלי הדם. אסוף שתיים עד שלוש חתיכות והשתמש ב-PBS כדי לשטוף אותן ביסודיות להסרת הדם. כדי לבודד את ה-deci paral, בצע דיסקציה של חתיכה ריבועית בגודל 10 סנטימטר על 10 סנטימטר.הנח אותה על הלוח כאשר הקוריון, המכיל קרישי דם ובדרך כלל בעל צבע צהוב בהיר, פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, השתמש בפינצטה בעלת חוד דק כדי להסיר כמה שיותר מקרישי הדם. לאחר מכן, שטוף את הממברנה ב-1X PBS סטרילי עד שה-PBS יזרום צלול.באמצעות גורד תאים סטרילי חד-פעמי ובזמן הוספת PBS לממברנה, גרדו בעדינות את שכבת הדסידואה (decidual layer). אספו את רקמות הדסידואה והניחו אותן במבחנה פלסטית של 50 מיליליטר עם PBS סטרילי כדי לפרק מכנית את ה-decidua Bali או ה-deci paral. התחילו בשטיפת הרקמה במבחנה של 50 מיליליטר באמצעות 1X PBS סטרילי.לאחר מכן, סבבו את הרקמה בצנטריפוגה במהירות של 300 G ובטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. שאבו בזהירות את הנוזל ללא הפרעה למשקע. לאחר מכן, לאחר השהיה מחדש של הרקמה ותמיסת הניתוק בהתאם לפרוטוקול הכתוב, העבירו את הרקמות ההומוגניזיות למבחנה מסוג C.הנח את המבחנה במפריד התאים האוטומטי והפעל את התוכנית המתאימה. לאחר הפירוק באמצעות תמיסה לניתוק תאים הזמינה מסחרית, כגון Accutane, דגרו את הרקמות בטמפרטורה של 37 °C עם ערבוב עדין למשך 45 דקות לצורך עיכול. לאחר הדגירה, הוסף 10 mL של PBS לתערובת העיכול וסנן אותה דרך מסננת תאים של 100 µm לתוך מבחנה של 50 mL. בהתאם לרמת הדביקות, ייתכן שיהיה צורך במסננות מספר כדי לסנן עיכול אחד.מלאו את המבחנה ב-PBS וסובבו בצנטריפוגה ב-300 G ובטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. הסירו בזהירות את supernatant S והשתמשו בחמישה מיליליטר של fax buffer קר מאוד (בקרח) כדי לתלות מחדש את משקע התאים (cell pellet). כדי לחקור לוקוציטים חד-גרעיניים, הוסיפו חמישה מיליליטר של מדיום למדרג צפיפות (density gradient medium) בריכוז 20% למבחנה פלסטית של 15 מיליליטר.לאחר מכן, העבירו באיטיות את תרחיף התאים מעל השכבה, תוך הקפדה על מניעת ערבוב השכבות. סבבו בצנטריפוגה עם רוטור מסוג swing out ב-500 G בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, ללא בלימה (break) למשך 30 דקות; הלוקוציטים יימצאו בממשק שבין תווך מדרג הצפיפות לבין באפר ה-fax. לאחר מכן, שאבו בזהירות בעזרת פיפטה את השכבה העליונה המכילה את באפר ה-fax ושאריות תאים. הממשק מכיל את התאים המונונוקליאריים שנותרו וחלק מהלוקוציטים פולימורפונוקליאריים.העבירו שכבה זו למבחנה חדשה של 15 milliliter. הוסיפו למבחנה לפחות שלושה נפחים של fax buffer, ולאחר מכן סבבו בצנטריפוגה ב-300 G למשך חמש דקות. כדי לשקוע את התאים, שאבו את ה-S supernatant ושטפו את התאים עם fax buffer פעם שנייה לפני ביצוע תרביות תאים.מיון ואימונופנוטיפיקה בהתאם לפרוטוקול הטקסט; איור זה מציג מורפולוגיה של מקרופאגים מבודדים שנאספו מהדסידואה פריאל (decidua basalis) בהריון במועד באמצעות מיון תאים מגנטי. מקרופאגים מבודדים שומרים על היכולת לשחרר ציטוקינים לאחר שלושה ימי תרבית. תנובת התאים החיוניים שבודדו מהדסידואה, מהבסליס ומהדסידואה פריאל נקבעה לאחר הפרדה במעבר דחיסות (density gradient separation).בשימוש בבדיקת חיוניות עם קיבוע כפי שמוצג כאן, החיוניות הייתה גבוהה מ-90% עבור כל אוכלוסיית תאי ה-deci. מוצגת כאן אסטרטגיית ה-gating לניתוח לוקוציטים פולימורפנוקליאריים ומונונוקליאריים בתוך ה-gating הנראה, כולל תאי T, נויטרופילים, מקרופאגים, תאי NK, תאי NK T ותאי B. בהריון במועד, איור זה מציג נויטרופילים, מקרופאגים, תאי T ותאי B מתאי שארית שבודדו מהריון במועד.לבסוף, תאי NK, NKT ותאי T מתוך תאים שיוריים שבודדו מהריון במועד מוצגים בסדרה זו של גרפים. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בשלוש שעות אם היא מבוצעת כהלכה. במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לנקות היטב את הרקמה, כדי למנוע זיהום בדם, ולהשאיר את הרקמה ואת תערובת האנזימים תחת השגחה במהלך הפרוצדורה.

isolation-of-leukocytes-from-the-human-maternal-fetal-interface

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שיטה מהירה להשיג leukocytes חדירה מהמוח Murine מתואר. שיטה זו מנצלת שיפוע Percoll רציפה שיפוע Ficoll רציפה כדי לבחור ולטהר את שכבת ליקוציט מועשר. Leukocytes מבודד ואז עלול להיות מאופיין על ידי מדידות זרימת cytometric.

בידוד של המוח, שחדר Leukocytes

כאן אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תת קבוצות של מבשר B-תאים מדם הטבורי. כמות ואיכות מספקת של חומצות גרעין עשויה להיות מופקים מהתאים והשתמשו במבחנים הבאים ניצול DNA או RNA.

בידוד של קבוצות משנה מבשר B-cell מדם טבורים

המתואר כאן הוא פרוטוקול לבידוד וניתוח הלויקוציטים החודרים של רקמות בממשק האם-עובר (רחם, דצידואה ושליה) של עכברים. פרוטוקול זה שומר על שלמותם של רוב סמני פני התא ומניב מספיק תאים ברי קיימא ליישומים במורד הזרם, כולל ניתוח זרימה ציטומטרית.

בידוד של לויקוציטים מרקמות Murine בממשק האם והעובר

בזאת אנו מתארים שיטות לנתיחה של רקמות יולדות ועובר מן שלית מונח אנושית, ואחריו בידוד והרחבת גזע mesenchymal / בתאי סטרומה (MSC) מרקמות אלה.

בידוד הרחבת גזע mesenchymal / תאי סטרומה נגזרו רקמה אנושית שליה

שיטה פשוטה להקים השליה אדם מן המעלה הראשונה (villous) ותרבויות איבר decidual מתואר. תרבויות איבר Villous ו decidual הם כלי שלא יסולא בפז ללימוד בפתוגנזה בממשק האם והעובר האדם. זיהום עם חיידקים ליסטריה חיידק תאי פקולטטיבי מודגם.

שלית Decidual אדם תרבויות איברים ללמוד זיהומים בבית הממשק האם והעובר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתיחה של חבל טבור האנושי (UC) ו מדגם שליה העובר לתוך חוט קרונית (CL), ג'ל וורטון (WJ), צומת חבל-שליה (CPJ), ואת השליה עוברת (FP) עבור הבידוד ואפיון של תאי סטרומה mesenchymal (MSCs) באמצעות טכניקת תרבות explant.

בידוד ואפיון של תאי סטרומה mesenchymal מן טבורי אדם העובר שליה

פרוטוקול זה מדגים שיטת הבידוד של תאים אנושיים decidual הראשית שנאסף בקרום עוברי של המונח placentae אשר יכול לשמש למגוון רחב של יישומים (קרי immunocytochemistry, cytometry זרימה, וכו ') מכוון ללמוד את התפקיד של אוכלוסיות תאים שונים בסיבוכים בהריון.

בידוד של ראשי תאים Decidual האנושי בקרום עוברי של המונח Placentae

חלב אם מעביר וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV), אם כי רק ~ 15% של תינוקות היונקים על ידי אמהות מזוהמת HIV להידבק. תינוקות החושן לבלוע ~ 105על 10שמונה לוקיציטים אימהי מדי יום, למרות תאים אלה אינם לומדים. כאן אנו מתארים את הבידוד של חלב לוקיולוציטים וניתוח של קיבולת phagocytic שלהם.

בידוד של לוקיולוציטים מחלב השד האנושי לשימוש בנוגדן-מותנה תאית הסלולר שיטת מטרות HIV

זוהי שיטה לבודד תאי לימפה הרחם מעכברים בהריון ולא בהריון. שיטה זו יכולה לשמש עבור יישומים במורד הזרם מרובים כגון פנוטיפינג FACS, מיון תאים, בדיקות פונקציונליות, RNA-seq, ופרוטומיקה. הפרוטוקול כאן מדגים כיצד פנוטיפ קבוצה 1 תאי לימפה מולדים הרחם על ידי ציטומטריית זרימה.

בידוד של תאי לימפה מולדים ברחם לניתוח על ידי ציטומטריית זרימה

פרוטוקול זה מפרט את הבידוד של אוכלוסיות חיסוניות ולא מחוסנות מריאות העכבר במצב יציב ובעקבות זיהום בשפעת. הוא גם מספק אסטרטגיות שער לזיהוי תת-קבוצות של תאים אפיתל ומיאלואידים.

בידוד אוכלוסיות תאים מיאלואידיים ואפיתל חיים מריאת העכבר

פרוטוקול זה מאפשר טיהור, אפיון ותרבות של טרופובלסטים ראשוניים מסוג HLA-G+ אקסטרווילוס (EVT) מהדצידואה בזליס ומהקרום הכוריוני של שליות המונחים האנושיים. תרביות EVT ראשוניות שומרות על חיוניות למשך 96 שעות, ומאפשרות קו-קלטור עם תאי חיסון אימהיים תואמים לדגימה וניתוח זרימה ציטומטרי ומולקולרי של האינטראקציות ביניהן.

טיהור של טרופובלסטים HLA-G+ אקסטרווילוס מרקמות שליה במונחים אנושיים לצורך פנוטיפינג וניתוח תפקודי

למדו לבודד לויקוציטים מהדצידואה האנושית באמצעות פירוק מכני ועיכול אנזימטי. שיטה זו שומרת על סמני שטח תאיים לניתוח ציטומטרי ומאפשרת יישומים במחקר אימונולוגי של ממשק האם-עובר.

בידוד של לויקוציטים מממשק האדם-האימהי העוברי

גלה סרטונים נוספים