Name: כוח האטומי מיקרוסקופית הדמיה וחיל ספקטרוסקופיה של bilayers שומנים הנתמכים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: למדו הכנת שכבות שומן נתמכות ואפיון תכונות מכניות של ממברנות ביולוגיות באמצעות מיקרוסקופיית כוח אטומי. שיטה זו מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה ומדידת עובי וכוח פריצה של ממברנות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי אגודת מקס פלנק, המרכז הגרמני לחקר הסרטן, אוניברסיטת טובינגן, וBundesministerium für Bildung und Forschung (מענק לא. 0,312,040). אנו מודים אדוארד הרמן שעזרו לנו להפוך את ניתוח נתוני כוח עקומת וד&quot;ר יעקב Suckale לקריאה זהירה של כתב היד הזה.

<ol><li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscope.</a> Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).</li>
<li>Hansma, P. K., Elings, V. B., Marti, O., Bracker, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+Tunneling+Microscopy+and+Atomic+Force+Microscopy%3A+Application+to+Biology+and+Technology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Scanning Tunneling Microscopy and Atomic Force Microscopy: Application to Biology and Technology.</a> Science. 242, 209-216 (1988).</li>
<li>Gaczynska, M., Osmulski, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM+of+biological+complexes%3A+What+can+we+learn%5BTitle%5D)+AND+%22Curr%2C+Opin.+Colloid+In%22%5BJournal%5D)">AFM of biological complexes: What can we learn.</a> Curr, Opin. Colloid In. 13, 351-367 (2008).</li>
<li>Goksu, E. I., Vanegas, J. M., Blanchette, C. D., Lin, W. -C., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM+for+structure+and+dynamics+of+biomembranes%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">AFM for structure and dynamics of biomembranes.</a> BBA-Biomembranes. 1788, 254-266 (2009).</li>
<li>Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM%3A+A+Nanotool+in+Membrane+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry-US%22%5BJournal%5D)">AFM: A Nanotool in Membrane Biology.</a> Biochemistry-US. 47, 7986-7998 (2008).</li>
<li>Redondo-Morata, L., Giannotti, M. I., Sanz, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRedondo-Morata%2C+L+%22Atomic+Force+Microscopy+in+Liquid%3A+Biological+Applications%22">Atomic Force Microscopy in Liquid: Biological Applications</a>. Baró, A. M., Reifenberger, R. G., Sanz, F. , Wiley-VCH Verlag GmbH. (2012).</li>
<li>Castellana, E. T., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+supported+lipid+bilayers%3A+From+biophysical+studies+to+sensor+design%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design.</a> Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).</li>
<li>Frederix, P. L. T. M., Bosshart, P. D., Engel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+of+Biological+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy of Biological Membranes.</a> Biophys. J. 96, 329-338 (2009).</li>
<li>Mennicke, U., Salditt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Solid-Supported+Lipid+Bilayers+by+Spin-Coating%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Preparation of Solid-Supported Lipid Bilayers by Spin-Coating.</a> Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).</li>
<li>Raviakine, I., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+Supported+Phospholipid+Bilayers+from+Unilamellar+Vesicles+Investigated+by+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formation of Supported Phospholipid Bilayers from Unilamellar Vesicles Investigated by Atomic Force Microscopy.</a> Langmuir. 16, 1806-1815 (2000).</li>
<li>Chiantia, S., Ries, J., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+AFM+and+Two-Focus+SFCS+Study+of+Raft-Exhibiting+Model+Membranes.+%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPhysChem%22%5BJournal%5D)">Combined AFM and Two-Focus SFCS Study of Raft-Exhibiting Model Membranes. </a> ChemPhysChem. 7, 2409-2418 (2006).</li>
<li>Unsay, J., Cosentino, K., Subburaj, Y., Garcia-Saez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+effects+on+membrane+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin effects on membrane structure and dynamics.</a> Langmuir. 29, 15878-15887 (2013).</li>
<li>Domènech, Ò, Sanz, F., Montero, M. T., Hernández-Borrell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+and+structural+study+of+the+main+phospholipid+components+comprising+the+mitochondrial+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic and structural study of the main phospholipid components comprising the mitochondrial inner membrane.</a> BBA-Biomembranes. 1758, 213-221 (2006).</li>
<li>Domènech, Ò, Morros, A., Cabañas, M. E., Teresa Montero, M., Hernández-Borrell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+planar+bilayers+from+hexagonal+phases%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Supported planar bilayers from hexagonal phases.</a> BBA-Biomembranes. 1768, 100-106 (2007).</li>
<li>Garcia-Saez, A. J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+line+tension+on+the+lateral+organization+of+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Effect of line tension on the lateral organization of lipid membranes.</a> J Biol Chem. 282, 33537-33544 (2007).</li>
<li>Alessandrini, A., Seeger, H. M., Caramaschi, T., Facci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Force+Spectroscopy+on+Supported+Lipid+Bilayers%3A+Effect+of+Temperature+and+Sample+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic Force Spectroscopy on Supported Lipid Bilayers: Effect of Temperature and Sample Preparation.</a> Biophys. J. 103, 38-47 (2012).</li>
<li>Butt, H. -J., Franz, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rupture+of+molecular+thin+films+observed+in+atomic+force+microscopy+I.+Theory%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Rupture of molecular thin films observed in atomic force microscopy I. Theory.</a> Physical Review E. 66, 031601(2002).</li>
<li>Garcia-Manyes, S., Oncins, G., Sanz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Temperature+on+the+Nanomechanics+of+Lipid+Bilayers+Studied+by+Force+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Effect of Temperature on the Nanomechanics of Lipid Bilayers Studied by Force Spectroscopy.</a> Biophys. J. 89, 4261-4274 (2005).</li>
<li>Chiantia, S., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raft+domain+reorganization+driven+by+short-+and+long-chain+ceramide%3A+a+combined+AFM+and+FCS+study%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Raft domain reorganization driven by short- and long-chain ceramide: a combined AFM and FCS study.</a> Langmuir. 23, 7659-7665 (2007).</li>
<li>Canale, C., Jacono, M., Diaspro, A., Dante, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+spectroscopy+as+a+tool+to+investigate+the+properties+of+supported+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Techniq%22%5BJournal%5D)">Force spectroscopy as a tool to investigate the properties of supported lipid membranes.</a> Microsc. Res. Techniq. 73, 965-972 (2010).</li>
<li>García-Sáez, A. J., Chiantia, S., Salgado, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pore+Formation+by+a+Bax-Derived+Peptide%3A+Effect+on+the+Line+Tension+of+the+Membrane+Probed+by+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Pore Formation by a Bax-Derived Peptide: Effect on the Line Tension of the Membrane Probed by AFM.</a> Biophys. J. 93, 103-112 (2007).</li>
<li>Moreno Flores, S., Toca-Herrera, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+future+of+scanning+probe+microscopy%3A+Combining+atomic+force+microscopy+with+other+surface-sensitive+techniques%2C+optical+microscopy+and+fluorescence+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">The new future of scanning probe microscopy: Combining atomic force microscopy with other surface-sensitive techniques, optical microscopy and fluorescence techniques.</a> Nanoscale. 1, 40-49 (2009).</li>
<li>Simons, K., Vaz, W. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+Systems%2C+Lipid+Rafts%2C+and+Cell+Membranes1%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Bioph.+Biom%22%5BJournal%5D)">Model Systems, Lipid Rafts, and Cell Membranes1.</a> Annu. Rev. Bioph. Biom. 33, 269-295 (2004).</li>
<li>Pike, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rafts+defined%3A+a+report+on+the+Keystone+symposium+on+lipid+rafts+and+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Rafts defined: a report on the Keystone symposium on lipid rafts and cell function.</a> The Journal of Lipid Research. 47, 1597-1598 (2006).</li>
<li>Kahya, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Lipid+Mobility+of+Raft-exhibiting+Model+Membranes+by+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Probing Lipid Mobility of Raft-exhibiting Model Membranes by Fluorescence Correlation Spectroscopy.</a> J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).</li>
<li>Akbarzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome%3A+classification%2C+preparation+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">Liposome: classification, preparation and applications.</a> Nanoscale Research Letters. 8, 102(2013).</li>
<li>Butt, H. -J., Jaschke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+thermal+noise+in+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Calculation of thermal noise in atomic force microscopy.</a> Nanotechnology. 6, 1-7 (1995).</li>
<li>Chon, J. W. M., Mulvaney, P., Sader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+validation+of+theoretical+models+for+the+frequency+response+of+atomic+force+microscope+cantilever+beams+immersed+in+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Experimental validation of theoretical models for the frequency response of atomic force microscope cantilever beams immersed in fluids.</a> Journal of Applied Physics. 87, 3973(2000).</li>
<li>Sader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+response+of+cantilever+beams+immersed+in+viscous+fluids+with+applications+to+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids with applications to the atomic force microscope.</a> Journal of Applied Physics. 84, 64(1998).</li>
<li>Sader, J. E., Pacifico, J., Green, C. P., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+scaling+law+for+stiffness+measurement+of+small+bodies+with+applications+to+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">General scaling law for stiffness measurement of small bodies with applications to the atomic force microscope.</a> Journal of Applied Physics. 97, 12490310(2005).</li>
<li>Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognizing+and+avoiding+artifacts+in+atomic+force+microscopy+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging.</a> Methods Mol Biol. 736, 31-43 (2011).</li>
<li>Lee, M. -T., Chen, F. -Y., Huang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetics+of+Pore+Formation+Induced+by+Membrane+Active+Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry-US%22%5BJournal%5D)">Energetics of Pore Formation Induced by Membrane Active Peptides.</a> Biochemistry-US. 43, 3590-3599 (2004).</li>
<li>Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+membrane+elasticity+by+micro-pipette+aspiration%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+physical+journal.+E%2C+Soft+matter%22%5BJournal%5D)">Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration.</a> The European physical journal. E, Soft matter. 14, 149-167 (2004).</li>
<li>Nichols-Smith, S., Teh, S. -Y., Kuhl, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+and+mechanical+properties+of+model+mitochondrial+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic and mechanical properties of model mitochondrial membranes.</a> BBA-Biomembranes. 1663, 82-88 (2004).</li>
<li>Tian, A., Johnson, C., Wang, W., Baumgart, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Line+Tension+at+Fluid+Membrane+Domain+Boundaries+Measured+by+Micropipette+Aspiration%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Line Tension at Fluid Membrane Domain Boundaries Measured by Micropipette Aspiration.</a> Phys. Rev. Lett. 98, (2007).</li>
<li>Rigaud, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%3A+functional+and+structural+studies+using+reconstituted+proteoliposomes+and+2-D+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Medical+and+Biological+Research%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals.</a> Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 35, 753-766 (2002).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

SLBs המורכב מdOPC: SM: חול (2: 2: 1) נוצרו על נציץ לאחר ספיחת שלפוחית ​​וקרע שנגרם על ידי סידן כלורי. הרכב שומנים בדם זה מופרד לשלבי ד L וo L. שלב o L מועשר בsphingomyelin וכולסטרול, והוא / (איור 1 א) נוזל צמיג פחות יותר מאשר שלב ד L 11. הפרדת o L משלב ד L באה לידי מבנים עגולים כמוגבהים מעל סביבתו (איור 1, ג). הפלטפורמות הן שלבי o L מוקפים שלבי ד L. ...

מיקרוסקופית כוח אטומי (AFM) מייצר תמונה של פני השטח על ידי סריקה על פני שטח של המדגם באמצעות שלוחה עם קצה חד מאוד 1. התנועה של שלוחה חוקרת את הטופולוגיה של מדגם המשטח. AFM כבר מיושם באופן נרחב למולקולות ביולוגיות - כוללים חלבונים, DNA, וקרומים, בשל צדדיות שלה בניתוח דגימות קבועות באוויר או מצב כמעט טבעי בנוזל 2-5. מלבד יכולת ההדמיה ברזולוציה הגבוהה שלה בטווח ננומטר, שלוחה AFM פועלת כקפיץ לחקור כוחות אינטראקציה (הידבקות ודחייה) ותכונות מכאניות של המדגם 5,6. התופעה זו ידועה בכח ספקטרוסקופיה. במצב זה, החללית מתקרבת ראשונה המדגם ומפעילה כוח על זה, ואז הוא חזר עד שהוא מאבד קשר עם המדגם (איור 1 א). עקומות שנוצרו להראות כוח כפונקציה של מרחק של שלוחה לשתי האפליקציהמקק והכחשה. מספר נכסים כוללים מודולוס האלסטיות למדוד את הנוקשות של חומר, וניתן לגזור כוחות ההידבקות. bilayers שומנים הנתמכים הם קרומים ביולוגיים מודל שוכבים על גבי תמיכה מוצקה - בדרך כלל נציץ,, סיליקה הזכוכית בורוסיליקט התמזגה, או חמצון סיליקון 7. הם מוכנים תוך שימוש בטכניקות שונות כמו בתצהיר שלפוחית, שיטת אנגמיור-באגט וספין-ציפוי 8,9. ההדמיה AFM נעשתה שימוש כדי לעקוב אחר היווצרות bilayers הנתמכות הבאות 10, ולחקור מבנים שונים שהוקמו על ידי קרומים של קומפוזיציות שונות 11-15. ביצוע כוח ספקטרוסקופיה על תוצאות bilayers נתמכות בשיא בעקומת הגישה. שיא זה מצביע על הכוח הדרוש כדי לחדור את bilayer, והוא נקרא כוח פריצת דרך. עובי bilayer גם ניתן למדוד באמצעות כוח העקומה 6. כוח הפריצה האופייני של bilayersטווח שבין 1-50 ננ 6. מאפיינים אלה תלויים באריזת שומנים (שלב נוזלי או ג&#39;ל) ומבנה (אורך שרשרת acyl ומידת unsaturation) ושונה על ידי סוכני קרום פעיל 16. התאוריה מאחורי הקרע הוסברה 17 ופרמטרים ניסיוניים אחרים כגון רכות שלוחה, רדיוס קצה ומהירות גישה משפיעים גם על כוח פריצת הדרך 15,16,18. ספקטרוסקופיה הכוח נעשתה שימוש כדי לנתח את התכונות של שלבים שונים שומנים 11,19, שינויי הרכב תלוי 12,20, כמו גם השפעות של מולקולות ביולוגיות אחרות, כמו פפטידים, ביציבות של הקרום 21. הנטייה השטוחה של bilayers נתמכת היא יתרון עבור שילוב AFM עם שיטות אחרות כגון מיקרוסקופיה תהודת 22 וקרינת המשטח plasmon 11,19 לאפיין מבנה ותכונות של ממברנות טובות יותר. פרוטו וידאו מפורט זהcol נועד להכין bilayers שומנים נתמכים באמצעות תצהיר שלפוחית ​​ולנתח אותם עם AFM והכח ספקטרוסקופיה. בעוד שלפוחית ​​בגדלים שונים ניתן להשתמש כדי להכין bilayers, פרוטוקול זה מתמקד בשלפוחית ​​unilamellar קטנה וגדולה. bilayers נתמכת ששלב להפריד לנוזל הורה (o L) ושלבים נוזליים סדר (ד L) התאפיינה 11,15. הקרום מורכב מdi-oleoyl-phosphatidylcholine (dOPC), sphingomyelin (SM), וכולסטרול (חול) בשעה 2: יחס 1: 2. דגמי הרכב זה רפסודות השומנים בדם, אשר הציעו להתנהג כפלטפורמות חשובות לסחר בחלבון ומיון, איתות תא ותהליכים תאיים אחרים 23,24.

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850375P</td><td>מגיע כאבקה ליופילית בבקבוקונים אטומים. יש להמיס את כל האבקה בכלורופורם עם הפתיחה. אחסן עודף כסרטי ליפידים מיובשים, באטמוספירה אינרטית, ב-20&nbsp; &deg;C. בקר <a href="http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp; view=מאמר& ID=1679& Itemid=398">כאן</a> למידע נוסף על אחסון וטיפול.</td></tr><tr><td>ספינגומיאלין (מוח, חזיר)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>860062P</td><td>מגיע כאבקה ליופילית במיכלי פלסטיק אטומים גדולים. יש להמיס נקודת מרית של אבקת אבקה בכלורופורם עם הפתיחה. אחסן עודף כסרטי ליפידים מיובשים, באטמוספירה אינרטית, ב-20&nbsp; &deg;C. בקר <a href="http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp; view=מאמר& ID=1679& Itemid=398">כאן</a> למידע נוסף על אחסון וטיפול.</td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>700000P</td><td>מגיע כאבקה ליופילית במיכלי פלסטיק אטומים גדולים. יש להמיס נקודת מרית של אבקת אבקה בכלורופורם עם הפתיחה. אחסן עודף כסרטי ליפידים מיובשים, באטמוספירה אינרטית, ב-20&nbsp; &deg;C. בקר <a href="http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp; view=מאמר& ID=1679& Itemid=398">כאן</a> למידע נוסף על אחסון וטיפול.</td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl), 99.8%</td> <td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl), 88%</td> <td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>נתרן מימן פוספט (Na2HPO4), >99%</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1046</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן דיהידרוגנפוספט (KH2PO4), 99%</td><td>Carl Roth GmbH + Co.</td><td>KG 3904.1</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידרט (CaCl2), בדרגת ביולוגיה מולקולרית</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A4689</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, כיסוי זכוכית בדרגת ביולוגיה מולקולרית</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>, 24&nbsp; x&nbsp; 60&nbsp; מ"מ, 1&nbsp; עובי מ"מ</td><td>Duran Group</td><td>2355036</td><td></td></tr><tr><td>Punch and Die Set</td><td>Precision Brand Products, Inc</td><td>40105</td><td></td></tr><tr><td>דבק אופטי</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>NOA 88</td><td>דבק נוזלי המתקשה בעת ריפוי באור UV באורך גל ארוך.&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>מיקה חוסם את</td><td>NSC Mica Exports Ltd.</td><td></td><td>מדובר בחתיכות נציץ בשטח ובעובי של לפחות 1 אינץ' רבוע הנעים בין 0.006 אינץ' ל-0.016 אינץ'. הם נחתכים לגודל ספציפי על ידי החברה למשלוח. ניתן לנקב דיסקיות נציץ קטנות מגושי הנציץ באמצעות ערכת האגרוף והקוביות.&nbsp; טפל תמיד בנציץ עם כפפות או פינצטה.</td></tr><tr><td>ציוד מעבדה גריז</td><td>בורר Chemie AG</td><td>Glisseal N</td><td></td></tr><tr><td>מכבש ליפוזום</td><td>Avestin</td><td>LiposoFast-Basic</td><td>כחלופה אפשר גם להסתכל על הצעות של Northern Lipids, Inc.</td></tr><tr><td>סרט דבק</td><td>3M</td><td>סקוטש (R) קסם (TM) קלטת 810 (1 אינץ')</td><td></td></tr> <tr><td>סוניקטור אמבטיה</td><td>Bandelin Sonorex Digitec</td><td>DT-31</td><td>ללא חימום, תדר: 35 קילו-הרץ, תפוקת שיא אולטרסאונד: 160 W, הספק HF: 40 W. (<a href="http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf">גיליון נתונים</a>)</td></tr> <tr><td>סיליקון ניטריד AFM Cantilever&nbsp;</td><td>Bruker AFM Probes</td><td>DNP-10</td><td>לכל שלוחה יש ארבעה קצוות ורדיוס הקצה הנומינלי שלהם הוא 20 ננומטר (עם מקסימום אפשרי ב-60&nbsp; ננומטר). בהתבסס על המפרט, אנו משתמשים בקצה D עם תדר תהודה של 18 kHz, וקבוע קפיץ נומינלי של 0.06 N/m.</td></tr><tr><td>AFM</td><td>JPK</td><td>JPK Nanowizard II מותקן על Zeiss Axiovert 200</td><td></td></tr></tbody></table>

כוח האטומי מיקרוסקופית הדמיה וחיל ספקטרוסקופיה של bilayers שומנים הנתמכים

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) היא טכניקת הדמיה רב-תכליתית ברזולוציה גבוהה המאפשרת הדמיה של ממברנות ביולוגיות. יש לו הגדלה מספקת כדי לבחון תשתיות ממברנה ואפילו מולקולות בודדות. AFM יכול לשמש כבדיקת כוח למדידת אינטראקציות ותכונות מכניות של ממברנות. שכבות דו-שכבתיות נתמכות של שומנים משמשות בדרך כלל כמודלים של ממברנות במחקרי AFM. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים כיצד להכין שכבות דו-שכבתיות נתמכות ולאפיין את המבנה והתכונות המכניות שלהן באמצעות AFM. אלה כוללים עובי דו-שכבתי וכוח פריצת דרך. 
המידע המסופק על ידי הדמיית AFM וספקטרוסקופיית כוח מסייע בהגדרת תכונות מכניות וכימיות של ממברנות. תכונות אלו ממלאות תפקיד חשוב בתהליכים תאיים כגון שמירה על המוסטזיס של התאים מפני לחץ סביבתי, חיבור חלבוני ממברנה וייצוב קומפלקסים של חלבונים.

bilayers נתמכת שומנים מורכבים מdOPC: SM: חול (2: 2: 1) היו צילם בAFM (איור 2 AC). בגלל הרכב השומנים בדם, o L SM / חול עשירה ושלבי ד L dOPC העשירים נצפו. פרופיל הגובה מהדמית AFM יכול לספק מידע חשוב על מבנה הקרום. על ידי הסתכלות על פרופיל הגובה, עובי bilayer ניתן למדוד בנוכחות של פגמים בקרום (איור 2), או ההבדל בגובה בין שלבי ד L / o L ניתן לספק. בנוסף, AFM מאפשר לאזורים ספציפיים בחרו מייצגים שלבים אלה ולנת...

אנו מתארים פרוטוקול להכנת שכבות דו-שכבתיות ליפידים נתמכות ואפיונו באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי וספקטרוסקופיית כוח.

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לדמות ולבחון את התכונות הפיזיקליות של ממברנות בעלות הפרדה פאזית באמצעות מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM). דבר זה מושג תחילה על ידי ערבוב של dilio, phosphatidylcholine, fgo, myelin, וכולסטרול ביחס של שתיים לשתיים לאחת, כדי ליצור תערובת ליפידים בעלת הפרדה פאזית. לאחר מכן, מוכנות שכבות ליפידיות כפולות נתמכות באמצעות השקעת תרחיף ליפוזומים על פני שטח של MICA באמצעות מיקרוסקופיית כוח אטומי.לאחר מכן סורקים את פני השטח של השכבה הכפולה, ובכך מייצרים תמונה טופוגרפית שבה ניתן למדוד מאפיינים מבניים כגון גובה. לאחר מכן, מבצעים ספקטרוסקופיה של כוח באזורים ספציפיים של השכבה הכפולה כדי לבחון את התכונות הפיזיקליות שלה, ובעיקר את כוח הפריצה (breakthrough force) ואת עובי הממברנה. בסופו של דבר, התוצאות מראות הבדלים בתכונות בין פאזות שומן שונות בהסתמך על תמונות FM ועקומות כוח.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מיקרוסקופיה פלואורסצנטית הוא העלייה ברזולוציה ותכונות נוספות ש-FM יכול לבחון בדגימה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הביופיזיקה, כגון מבנה של ממברנות ביולוגיות וחלבונים המוטמעים בממברנות אלו. יתרה מכך, אנו יכולים לבחון גם את התכונות הפיזיקליות של הממברנה ולנטר כיצד שינויים בהרכב או הוספה של חומרים פעילים בממברנה עשויים לשנות תכונות אלו.באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקלו בקשיים בשל טבעו השביר של הדגימה. לדבר זה יש השלכות על הכנת הדגימה, הטיפול בה, בחירת הקנטילברים ותנאי הדימוי והספקטרוסקופיה ב-FM. התחילו בהמסת DOPC, spino, myelin וכולסטרול בתוך כלורופורם בריכוזים הרצויים. לאחר מכן, ערבבו 18.38 µL של DOPC, 17.1 µL של sing myelin ו-11.3 µL של כולסטרול כדי להכין תמיסה עם 1 mg של ליפידים סה"כ וביחס מולרי של שתיים לשתיים לאחת, בהתאמה.ערבב את התמיסה באמצעות וורטקס, ייבש את התערובת באמצעות גז אינרטי כגון חנקן, ולאחר מכן ייבש אותה עוד יותר תחת ואקום למשך שעה אחת לפחות. לאחר מכן, המס את הליפידים המיובשים ב-100 µL של PBS לריכוז של 10 mg/mL. ערבב את התערובת בעוצמה בעזרת וורטקס למשך כדקה אחת.כדי לקבל תרחיף עכור המכיל וסיקולות רב-שכבתיות. ודאו שלא נותרו שכבות שומן דבוקות לדפנות המבחנה. קחו 10 µL של תרחיף השומנים הרב-שכבתי והוסיפו 150 µL של באפר לשכבה שומנית נתמכת.לאחר מכן, ערבבו את התמיסה, העבירו אותה למבחנה זכוכית קטנה עם מכסה בנפח 2 mL ואטמו אותה עם parafilm. חשפו את התערובת לסוניקציה בטמפרטורת החדר בתוך אמבט סוניקציה למשך 10 דקות. במהלך זמן זה, התמיסה צריכה להפוך לצלולה ותניב וסיקולות או uni-vesicles קטנות בעלות קוטר של כ-50 nm.שטפו את לוחות הכיסוי מזכוכית במים ולאחר מכן באתנול, והניחו להם להתייבש באוויר. לאחר מכן, קחו דיסקי מיקה וקלפו את השכבה החיצונית באמצעות סרט דביק. הצמידו את דיסק המיקה ללוח הכיסוי באמצעות טיפה של דבק שקוף וצלול אופטית.לאחר מכן, הצמדו גלילי פלסטיק ל-MICA באמצעות גריז ואקום וודאו שאין דליפות. העבירו באמצעות פיפט את כל תמיסת הליפוזומים ישירות על המיקה והוסיפו 140 µL נוספים של באפר לשכבת ליפידים נתמכת כדי להגיע לנפח של 300 µL. לאחר מכן, הוסיפו 0.9 µL של תמיסת calcium chloride בריכוז 1 M כדי להגיע לריכוז סופי של 3 mM של סידן, דגרו את הדגימות במשך שתי דקות ב-37 °C, ולאחר מכן למשך 10 דקות לפחות ב-65 °C; במהלך שלב זה, חממו מראש את הבאפר לשכבת ליפידים נתמכת ל-65 °C.הוסיפו בופר במידת הצורך כדי להבטיח שהדגימה לא תתייבש. כיסוי של תא הדגימה באמצעות מכסה זכוכית (cover slip) ישמר גם הוא את לחות הדגימה. לאחר מכן, שטפו בעדינות את הדגימה עם בופר 1 לשכבות ליפידיות נתמכות (supported lipid bilayer buffer) שחומם מראש, 10 עד 15 פעמים, כדי להסיר את הסידן ואת הוזיקולות שלא התמזגו.יש להקפיד במיוחד במהלך שלבי השטיפה על כך שהשכבה הכפולה לא תתייבש מעולם לאחר שלבי השטיפה. קררו את השכבות הכפולות הנתמכות לטמפרטורת החדר. לפני המדידות במיקרוסקופ הכוח האטומי, הגדירו את מיקרוסקופ הכוח האטומי או FM לביצוע דימוי של השכבות הכפולות של הליפידים בתמיסה.בשימוש במצב מגע (contact mode) בהתאם למפרט היצרן, הוסף בופר לדגימה כדי לשמור עליה טבולה בבופר לאורך כל הניסוי. התקן את הדגימה על במת ה-AFM וודא שכל מודולי בידוד הרעידות פועלים. המתן לפחות 15 דקות כדי שהמערכת תגיע לשיווי משקל ויפחת הסחף התרמי.בשלב הבא, התקרבו אל הדגימה במצב מגע (contact mode) באמצעות קצה קנטילבר של AFM רך עד ליצירת מגע. כיוון ששכבות ביליפייד הן שבירות מאוד, מזערו את נקודת הset point של קצה ה-AFM במהלך הדמיה במצב מגע כדי לשמור על כוח מינימלי ולתקן עבור סחף תרמי תוך שמירה על המגע עם הדגימה. עם השלמת ההדמיה, עבדו את התמונות על ידי התאמת כל שורת סריקה לפונקציות פילוס פולינומיות.בצע הסרה של קווים (line removal) עבור סריקות שבהן אבדה המגע עם הממברנה. באמצעות התוכנה הקניינית של החברה היצרנית של ה-AFM, כייל את הקנטילבר על פי פרוטוקול היצרן כדי לקבוע את ההמרה הנכונה של האות החשמלי למדידת כוח. לאחר הדמיית אזור בשכבה הכפולה (bilayer), בחר אזור של 5 micron על 5 micron בשכבה הכפולה לביצוע ספקטרוסקופיית כוח.הגדירו את ה-AFMs כך שיבצעו עקומות כוח בסריג של 16 על 16 באותו אזור, מה שיניב 256 עקומות כוח לכל אזור. לאחר מכן, הגדירו את ה-Z piezo displacement ל-400 nanometers. הגדרה זו קובעת את טווח התנועה המקסימלי של ה-z piezo ומבטיחה שהקנטילבר ייסוג במלואו מהדגימה בין המדידות.בשלב הבא, הגדירו את מהירות ההתקרבות ל-800 nanometers per second ואת מהירות הנסיגה ל-200 nanometers per second. כמו כן, הגדירו את הכוח המקסימלי עבור כל עקומת כוח, שבמקרה זה הוא 12 nano Newton. לאחר הגדרת כל הפרמטרים, רכשו את עקומות הכוח על ידי לחיצה על כפתור ההפעלה (run) בתוכנת ה-AFM.רכשו לפחות 500 עקומות כוח עבור כל תנאי כדי להבטיח סטטיסטיקה טובה, הפיקו היסטוגרמה של הערכים ולאחר מכן התאימו את ההיסטוגרמות להתפלגות גאוסיאנית כדי לקבל את שיא ההתפלגות ואת רוחבה. בשל הרכב הליפידים שנעשה בו שימוש במחקר זה, נוצרים שני אזורי ממברנה עיקריים. קיים אזור נוזלי מסודר (liquid ordered) המורכב מ-fing, myelin וכולסטרול, ואזור נוזלי לא מסודר (liquid disordered) המורכב בעיקר מ-DOPC.פרופיל הגובה מצילומי ה-AFM יכול לספק מידע חשוב על מבנה הממברנה באמצעות בחינת פרופיל הגובה. ניתן למדוד את עובי השכבה הכפולה (bilayer) על ידי ניצול הימצאותן של פגמים בממברנה. ניתן להשתמש במפת הגובה גם כדי למדוד את הפרש הגבהים בין הפאזות המסודרת והבלתי מסודרת.עקומות הכוח המופקות ממצב ספקטרוסקופיית הכוח משמשות למדידת כוח הפריצה על ידי קביעת ערך הכוח בשיא של עקומת הכוח, כפי שמוצג כאן. בנוסף, ניתן להסיק את עובי הממברנה על ידי חיסור ערך המרחק בשיא עקומת הכוח מערך המרחק שבו עקומת הכוח מתחילה לעלות שוב. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לשמור על תמיסת השכבה B ולנטר את הרכבת ה-FM ללא הרף כדי לתקן השפעות של סחף תרמי וצבירה של D על הקצה בעקבות הליך זה.ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מיקרוסקופיית פלואורסצנציה קונפוקלית, כדי לענות על שאלות נוספות כמו דינמיקה של ממברנות. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מכינים שכבות נתמכות (supported bilayers) ומשתמשים ב-FM כדי לדגום ולחקור את התכונות הפיזיקליות של שכבות דו-שכתיות אלו.

atomic-force-microscopy-imaging-force-spectroscopy-supported-lipid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

בסרטון זה, אנו מדגימים אינטראקציות חלבון-פוספואינסיטיד בתבנית מיקרופלואידית באמצעות בדיקת אפנון pH, באמצעות צבע פלואורסצנטי רגיש ל-pH המתויג לשומנים פוספטידיל-אתנולמין של דו-שכבה ליפידית נתמכת, הנקראת פלטפורמה מיקרופלואידית. המודולציות ב- pH לאחר קשירת חלבון לפוספוליפידים גורמות למרווה פלואורסצנטית.

בדיקת אפנון pH על שכבות שומנים נתמכות לזיהוי אינטראקציות חלבון-פוספואינסיטיד

אנו מציגים שיטה של ​​הכנת bilayers שומנים נציץ נתמך למיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. מיכה הוא שקוף ושטוח בקנה מידה אטומי, אבל כמעט ולא משתמש בהדמיה בגלל טיפול בקשיים; ההכנה שלנו תוצאות בתצהיר גם של הגיליון נציץ, ומפחיתה את החומר המשמש בהכנת bilayer.

הכנת מיכה נתמכת יפידים bilayers לרזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה אופטית הדמיה

מוצג פרוטוקול לחיבור מגוון גדול של מולקולות בודדות באופן קוולנטי לקצה AFM. ניתנים נהלים ודוגמאות לקביעת כוח ההדבקה והאנרגיה החופשית של מולקולות אלה על תומכים מוצקים וממשקים ביולוגיים.

חוקר מולקולה בודדת הדבקה על ידי הכוח האטומי ספקטרוסקופיה

אנו מציגים פרוטוקול ניסוי ליצירת bilayer שומנים נתמך על מצעים מוצקים ללא שימוש בשלפוחית ​​שומנים. אנו מדגימים שיטת צעד אחד כדי ליצור bilayer שומנים על סיליקון דו חמצני וזהב, כמו גם קרומים נתמכים עם תחום מועשר כולסטרול עבור יישומים ביולוגיים שונים.

ייצור Biomembrane ידי השומנים bilayer (SALB) השיטה בסיוע מרכך

הכנת שכבות דו-שכבתיות של שומנים מישוריים הנתמכים בזכוכית מתפקדת בחלבון, קביעת ניידות החלבון בפנים ומדידת צפיפות החלבון מוצגת כאן. מתוארת מפת דרכים לבניית מיקרוסקופ השתקפות פנימית כוללת מופחת רעש, המאפשרת הדמיה של פלואורוכרומים דו-שכבתיים בודדים ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה.

המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי במישורים נתמך bilayers

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזהות אירועי היתוך אחד, בתיווך מלכודת בין ליפוזומים bilayers נתמך ערוצי microfluidic באמצעות TIRFM המקוטב, עם רגישות מולקולה בודדת ~ 15 ברזולוצית זמן msec. ליפידים ושחרור מטען מסיס ניתן לאתר בו זמנית. Liposome גודל, diffusivity שומנים, ואת הנקבוביות היתוך מאפיינים נמדדים.

מלכודת בתיווך Fusion של יחיד Proteoliposomes עם Bilayers Tethered הנתמך בתוך תא זרימת Microfluidic מנוטר על ידי Polarized TIRF מיקרוסקופי

אנו מציגים שיטה להשגת תמונות ברזולוציה מהשנה ננומטר עם אפנון משרעת (קשה במצב) במיקרוסקופ כוח אטומי בנוזל. השיטה מודגמת על מיקרוסקופי כוח אטומיים מסחריים. אנחנו מסבירים את הרציונל מאחורי הבחירות שלנו פרמטרים ולהציע אסטרטגיות אופטימיזציה רזולוציה.

הדמיה ברזולוציה משנה ננומטר עם מיקרוסקופית כוח אטומי משרעת אפנון בנוזל

מאמר זה מתאר את הפרוטוקולים להכנת מדגם, הפחתת נתונים וניתוח נתונים במחקרי הד ספין נויטרונים (NSE) של ממברנות השומנים. תיוג דיטריום נבון של שומנים מאפשר גישה לדינמיקה שונה של ממברנה על קשקשי אורך וזמן מזוסקופיים, שעליהם מתרחשים תהליכים ביולוגיים חיוניים.

ספקטרוסקופיית הד ספין נויטרונים כגשוש ייחודי לדינמיקה של קרום השומנים ואינטראקציות בין חלבון ממברנה

פרוטוקול זה מתאר היווצרות של תאים מחקים שלפוחיות חד-שומנים ורב-שומנים, דו-שכבתי שומנים נתמכים, ושכבות שומנים מושעות. מודלים במבחנה אלה ניתן להתאים לשלב מגוון רחב של סוגי שומנים וניתן להשתמש בהם כדי לחקור מולקולות שונות ואינטראקציות macromolecule.

הרכבה של חיקוי תאים מודלים נתמכים ומושעים של בולי עץ לחקר אינטראקציות מולקולריות

כימות שטח המגע והכוח המופעל על ידי קצה גשושית כוח אטומי (AFM) על משטח הדגימה מאפשר קביעת תכונות מכניות ננומטריות. נדונות שיטות עבודה מומלצות ליישום ננו-הזחה מבוססת AFM באוויר או בנוזל על דגימות רכות וקשות למדידת מודולוס אלסטי או תכונות ננו-מכניות אחרות.

מיקרוסקופ כוח אטומי ננו-הזחה מבוססת Cantilever: מדידות תכונות מכניות בקנה מידה ננומטרי באוויר ובנוזל

מוצג פרוטוקול ניסיוני להרכבה, גירוי חשמלי וניתוח דו-שכבתיות מממשק טיפות עם גרמיצידין A. יחסי מבנה-תפקוד בין ליפידים לחלבון נמדדים על ידי מדידת שינויים בשטח הממברנה, בזרם יוני ובהולכה חד-ערוצית, וקישור תגובות אלו לשינויים דמויי פלסטיות בהולכה יונית במודל ממברנה בהשראת סינפסות חשמליות.

אפיון מבנה תפקוד ממברנת ליפידים-חלבון באמצעות דו-שכבות ממשק טיפות

למדו הכנת שכבות שומן נתמכות ואפיון תכונות מכניות של ממברנות ביולוגיות באמצעות מיקרוסקופיית כוח אטומי. שיטה זו מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה ומדידת עובי וכוח פריצה של ממברנות.

כוח האטומי מיקרוסקופית הדמיה וחיל ספקטרוסקופיה של bilayers שומנים הנתמכים

גלה סרטונים נוספים