כוח האטומי מיקרוסקופית הדמיה וחיל ספקטרוסקופיה של bilayers שומנים הנתמכים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לדמות ולחקור את התכונות הפיזיקליות של ממברנות מפרידות פאזה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. זה מושג על ידי ערבוב ראשון של דיליו, פוספטידילכולין, FGO, מיאלין וכולסטרול ביחס של שניים לשניים לאחד ליצירת תערובת שומנים המפרידה פאזה. לאחר מכן, מכינים את שכבות השומנים הנתמכות על ידי הפקדת תרחיף הליפוזום למשטח MICA באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי.

לאחר מכן נסרקים פני השטח של הדו-שכבה, ומייצרים תמונה טופוגרפית שבה ניתן למדוד תכונות מבניות כמו גובה. ספקטרוסקופיית הכוח הבאה מבוצעת על אזורים ספציפיים של הדו-שכבתי כדי לחקור את התכונות הפיזיקליות של הדו-שכבה, בעיקר כוח הפריצה ועובי הממברנה. בסופו של דבר, התוצאות מראות הבדלים בתכונות בין שלבי שומנים שונים בהתבסס על תמונות FM ועקומות כוח.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, הוא העלייה ברזולוציה ובתכונות נוספות ש-FM יכול לחקור על הדגימה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביופיזיקה, כגון המבנה של ממברנות ביולוגיות וחלבונים המוטבעים על ממברנות כאלה. יתר על כן, אנו יכולים גם להסתכל על התכונות הפיזיקליות של הממברנה ולעקוב אחר האופן שבו שינויים בהרכב או בתוספת של חומרים פעילים בממברנה עשויים לשנות את התכונות הללו.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל האופי השברירי של המדגם. יש לכך השלכות על הכנת הדגימה, טיפול בבחירת שלוחים ותנאי הדמיה וספקטרוסקופיה FM התחל בהמסת DOPC, ספינו, מיאלין וכולסטרול לכלורופורם בריכוזים הרצויים. לאחר מכן שלבו 18.38 מיקרוליטר של DOPC, 17.1 מיקרוליטר של מיאלין סינג ו-11.3 מיקרוליטר כולסטרול כדי ליצור תמיסה עם מיליגרם אחד של סך השומנים ויחס מולארי של שניים לשניים לאחד בהתאמה.

מערבבים תמיסה על ידי מערבולת, מייבשים את התערובת באמצעות גז אינרטי כמו חנקן, ולאחר מכן מייבשים אותה עוד יותר בוואקום למשך שעה לפחות. לאחר מכן, ממיסים את השומנים המיובשים ב -100 מיקרוליטר PBS לריכוז של 10 מיליגרם למיליליטר. מערבולת לערבב במרץ במשך כדקה.

כדי לקבל תרחיף מעונן המכיל שלפוחיות רב למינריות. ודא שלא יישארו סרטי שומנים מחוברים לדפנות הבקבוקון. קח 10 מיקרוליטר מתרחיף השומנים הרב-למינרי והוסף 150 מיקרוליטר של מאגר דו-שכבתי נתמך.

לאחר מכן מערבבים תמיסה ומעבירים אותה לבקבוקון זכוכית קטן של שני מיליליטר ואוטמים אותו עם סוניקט סרט פרה. התערובת בטמפרטורת החדר באמבטיה סוניקט למשך 10 דקות. במהלך תקופה זו, התמיסה אמורה להתבהר ותניב שלפוחיות קטנות בקוטר של כ-50 ננומטר.

שטפו את החלקות כיסוי הזכוכית במים ואחריהם אתנול, ולאחר מכן הניחו להם להתייבש באוויר. לאחר מכן, קח דיסקיות מיכה וקילף את השכבה החיצונית בעזרת סרט דבק. חבר את דיסק ה-MICA להחלקת כיסוי באמצעות טיפה של דבק שקוף שקוף אופטית.

לאחר מכן חבר גלילי פלסטיק ל-MICA באמצעות שומן ואקום וודא שאין נזילות. צנרת את כל תמיסת הליפוזום ישירות על הנציץ והוסף עוד 140 מיקרוליטר של מאגר דו-שכבתי ליפידי נתמך כדי להגיע לנפח של 300 מיקרוליטר. לאחר מכן, הוסף 0.9 מיקרוליטר של תמיסת סידן כלוריד מולרית אחת כדי להגיע לריכוז סופי של שלושה מילי-מולרי של סידן, דגר את הדגימות למשך שתי דקות ב-37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן למשך 10 דקות לפחות ב-65 מעלות צלזיוס במהלך שלב זה, חמם גם את מאגר השומנים הדו-שכבתי הנתמך ל-65 מעלות צלזיוס.

הוסף חיץ במידת הצורך כדי להבטיח שהדגימה לא תתייבש. כיסוי תא הדגימה בתלוש כיסוי ישמור גם על לחות הדגימה. לאחר מכן שטפו את הדגימה בעדינות עם השומן הנתמך מראש על ידי מאגר שכבה 10 עד 15 פעמים כדי להסיר את הסידן והשלפוחיות הלא מאוחות.

היזהר במיוחד במהלך שלבי הכביסה כדי למנוע מהשכבה הדו-שכבתית להתייבש אי פעם בעקבות שלבי הכביסה. מצננים את השכבות הנתמכות לטמפרטורת החדר. לפני מדידות במיקרוסקופ הכוח האטומי, הגדר את מיקרוסקופ הכוח האטומי או FM לביצוע הדמיה של שכבות השומנים בתמיסה.

באמצעות מצב המגע בהתאם למפרט היצרן, הוסף מאגר לדגימה כדי להשאיר אותה שקועה במאגר במהלך כל הניסוי. התקן את הדגימה על A FM tagה וודא שכל מודולי בידוד הרטט מופעלים. המתן לפחות 15 דקות עד שהמערכת תתאזן ותפחית את הסחיפה התרמית.

לאחר מכן, התקרב לדגימה במצב מגע עם קצה שלוחה FM רך עד ליצירת מגע. מכיוון ששכבות דו-שכבתיות הן שבירות מאוד, צמצם את נקודת ההגדרה של קצה A FM במהלך הדמיית מצב מגע כדי לשמור על הכוח במינימום ולתקן סחיפה תרמית תוך שמירה על מגע עם הדגימה. לאחר השלמת ההדמיה, עבד את התמונות על ידי התאמת כל קו סריקה לפונקציות פילוס פולינומי.

בצע הסרת קו עבור סריקות שמאבדות מגע עם הממברנה. באמצעות התוכנה הקניינית של חברת ייצור A FM, כייל את השלוחה על ידי ביצוע פרוטוקול היצרן על מנת לקבוע את ההמרה הנכונה של האות החשמלי למדידת כוח. לאחר הדמיית אזור של הדו-שכבה, בחר אזור של חמישה מיקרון על חמישה מיקרון בשכבה הדו-שכבתית כדי לבצע ספקטרוסקופיית כוח.

הגדר את ה-AFMs שהוא לוקח עקומות כוח ברשת של 16 על 16 של אותו אזור, וכתוצאה מכך 256 עקומות כוח לכל אזור. לאחר מכן הגדר את תזוזה Z piso ל-400 ננומטר. זה קובע את טווח התנועה המרבי של ה-z piezo ומבטיח שהשלוחה נסוגה לחלוטין מהדגימה בין המדידות.

לאחר מכן הגדירו את מהירות הגישה ל-800 ננומטר לשנייה ואת מהירות הנסיגה ל-200 ננומטר לשנייה. הגדר גם את כוח היעד המרבי עבור כל עקומת כוח במקרה זה, 12 ננו ניוטון. לאחר הגדרת כל הפרמטרים, רכוש עקומות כוח על ידי לחיצה על כפתור ההפעלה של תוכנת A FM.

רכוש לפחות 500 עקומות כוח עבור כל תנאי כדי להבטיח סטטיסטיקה טובה, התווה היסטוגרמה של הערכים ולאחר מכן התאם את ההיסטוגרמות להתפלגות גאוס על מנת לקבל את השיא והרוחב של ההתפלגות. בגלל הרכב השומנים במחקר זה, נוצרים שני אזורי ממברנה עיקריים. ישנו אזור מסודר נוזלי המורכב מפינג, מיאלין וכולסטרול, ואזור לא מסודר נוזלי המורכב בעיקר מ-DOPC.

פרופיל הגובה מהדמיית A FM יכול לספק מידע חשוב על מבנה הממברנה על ידי התבוננות בפרופיל הגובה. ניתן למדוד את עובי הדו-שכבתי על ידי ניצול נוכחות של פגמים בקרום. מפת הגובה יכולה לשמש גם למדידת הפרש הגובה בין השלבים המסודרים והלא מסודרים.

עקומות הכוח הנגזרות ממצב ספקטרוסקופיית הכוח משמשות למדידת כוח פריצת הדרך על ידי שינוי ערך הכוח בשיא עקומת הכוח כפי שמוצג כאן. בנוסף, ניתן לגזור את עובי הממברנה על ידי הפחתת ערך המרחק משיא עקומת הכוח לערך המרחק. כאשר עקומת הכוח מתחילה לעלות שוב, תוך כדי ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על תמיסת שכבת B ולפקח על מכלול ה-FM כל הזמן כדי לתקן את ההשפעות של סחיפה תרמית והצטברות D על הקצה בעקבות הליך זה.

ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית על מנת לענות על שאלות נוספות כמו דינמיקת ממברנה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין נתמך על ידי שכבות ולהשתמש ב-FM כדי לצלם ולחקור את התכונות הפיזיקליות של השכבות הדו-שכבתיות הללו.