הטמעה של במבחנה תרופות מבחני התנגדות: למקסם את הפוטנציאל לחשיפת מנגנוני התנגדות קלינית רלוונטיים

המטרה הכוללת של הליך זה היא להקל על גילוי פרה-קליני מהיר של גרסאות נוקלאוטידים בודדות רלוונטיות מבחינה קלינית שעשויות להניע עמידות תפקודית לסוגים שונים של טיפולים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האונקולוגיה, כגון אילו מוטציות גנטיות עשויות לתרום לעמידות תפקודית לטיפולים במרפאה שעשויים בסופו של דבר להנחות שיפור בטיפולים ואסטרטגיות ניהול קליניות חלופיות לחולים עמידים לתרופות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמכיוון שאנו מאפשרים את הופעתן של מוטציות ספונטניות ומיישמים טכנולוגיית סינון בלתי משוחדת בשיבוטים עמידים, יש סבירות גבוהה יותר שהווריאנטים הללו מניעים טיפולים ממוקדי הישנות במרפאה.

מדגים את ההליך יהיה חוקר מוכשר מאוד מהמעבדה שלי להעריך את ה-GI 50 עבור קווי תאים. הכן צלחת בדיקה על ידי זריעת תאים בשקוף לא שקוף. 96 צלחות באר תחתונות ב -100 מיקרוליטר של מדיום תא על פי המפה המוצגת כאן.

הכן לוחית בקרה בצורה דומה, הוסף תאים לבארות הכחולות ורק בינוני לבארות הלבנות. לאחר דגירה של הלוחות ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה, יש לאזן את מגיב כדאיות התא הזוהר לטמפרטורת החדר ולערבב בעדינות על ידי היפוך. כדי להשיג תמיסה הומוגנית, הוסיפו 80 מיקרוליטר מגיב לבארות צלחת הבקרה ונערו את התכולה למשך 30 דקות.

כדי לגרום לליזה של תאים. השתמש בלומינומטר עם חשיפה של 0.1 עד 1.0 שניות ואורך גל זיהוי של 560 ננומטר כדי לתעד את הזוהר. לאחר מכן, כדי להוסיף את תרכובות הבדיקה ללוחות הבדיקה, בצע סדרה של דילול אחד מכל ארבעה של תרכובות ב-DMSO החל מריכוז של 2000 מיקרו-מולרי בסך הכל 10 דילול

לאחר מכן מוסיפים את התרכובות המדוללות באופן סדרתי למדיום כדי ליצור תערובת בינונית מורכבת בריכוז סופי של פי 10. אחסן את צלחת התרכובת במינוס 20 מעלות צלזיוס לשימוש ביום השלישי של הבדיקה. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר מהתרכובות המדוללות לתאים במשולש כך שהמינון הגבוה ביותר הוא 10 מיקרומולר.

דגרו על הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים. ביום השלישי, הכינו תערובת בינונית של 400 מיקרוליטר עם תרכובת X אחת באמצעות צלחות התרכובת שהוכנו שלושה ימים קודם לכן. הפוך את לוחות הבדיקה כדי להסיר את המדיום וייבש בטפיחות על מגבות נייר חיטוי פעמיים-שלוש.

הוסף תרכובת x אחת למוצלת היטב בכחול והוסף 100 מיקרוליטר של בארות בינוניות עד היקפיות כדי למנוע אידוי. ביום השישי, העריכו את המספר היחסי של תאים ברי קיימא על ידי קריאת זוהר כפי שהודגם קודם לכן בסרטון. לאחר מכן חשב את ערכי ה-GI 50 באמצעות תוכנה כגון PRISM באמצעות ערכי GI 50 המחושבים שהוגדרו תאים לבדיקות עמידות לתרופות.

אם עובדים עם חומר ציטוסטטי, תאי זרעים במפגש של 30 עד 40% בכלי תרבית מרובעים של 150 מילימטר. אם עובדים עם חומר רעיל, ראה את התאים במפגש של 70 עד 80%. לאחר קביעת ריכוזי התרכובות הראשוניים על פי פרוטוקול הטקסט, יש לטפל בתאים בתרכובות הבדיקה לתרכובות רעילות ביותר, הגורמות למוות תאים בבדיקת כדאיות של שישה ימים.

התחל עם GI 50 והגדל את הריכוז בהדרגה כל שבועיים-שלושה עד שנצפתה עמידות חזקה. כדי לבודד שיבוטים של תא בודד, השתמש במיקרוסקופ ניגודיות פאזה בהגדלה של פי 40 כדי לבחון את צלחת התרבית ולזהות אשכולות תאים ברי קיימא בתחתית הצלחת. השתמש בעט כדי לסמן שיבוטים בגודל ממוצע ומבודדים היטב ממושבות אחרות כדי לבחור שיבוטים באמצעות פיפטר P 200.

הסר את מצע הגידול מהצלחת והשתמש ב-XPBS אחד כדי לשטוף את כל התאים הצפים. בעזרת קצה הפיפטה, הרם שיבוטים והעביר לבארות של צלחת 48 בארות המכילה 50 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין דוגר ב-37 מעלות צלזיוס למשך דקה עד שתיים. לאחר מכן הוסיפו 200 מיקרוליטר של מדיום טרי עם מחצית מריכוז התרכובת כדי לאפשר התאוששות אופטימלית של התאים.

כדי לבודד את השיבוטים באמצעות דיסקי שיבוט של שלושה מילימטרים, הנח את הדיסקים בצלחת תרבית רקמה של 10 סנטימטר המכילה חמישה מיליליטר של 0.25% טריפסין EDTA למשך שתי דקות. לאחר מכן, שאפו את המדיום מהצלחת המכילה את השיבוטים העמידים וכסו את השיבוטים עם הטיולים ודיסקי השיבוט הספוגים. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה עד שתיים, תלוי באיזו קלות השיבוטים מתרוממים מהצלחות.

לאחר מכן בעזרת מלקחיים סטריליים, הרם את דיסקיות השיבוט והעביר ל -48 צלחות באר עם 200 מיקרוליטר של מדיום טרי, ויש לריכוז התרכובת בעדינות למעלה ולמטה כדי לעקור את התאים מדיסקי השיבוט ולדגור ב -37 מעלות למשך הלילה למחרת, להסיר את דיסקי השיבוט, לדגור על התאים, ואז להעריך את העמידות לתרופות. על פי פרוטוקול הטקסט, כפי שמוצג כאן, HCT 16 תאים שטופלו במשך תקופה ממושכת בציטוטוקסיות. תרכובת מספר אחת הובילה להופעתם הספונטנית של שיבוטים עמידים שהמשיכו לגדול במהלך הטיפול.

השיבוטים נבחרו באמצעות איש פיפטה. באיור זה שיבוטים עמידים אחד עד שלושה הראו עמידות משמעותית לתרכובת מספר אחת, ולתרכובת האנלוגית הקרובה שלה מספר שתיים, בעוד שכל השיבוטים הראו רגישות לתרכובת ציטוטוקסית שאינה קשורה. ולקייד. לאחר אישור העמידות הפנוטיפית, GDNA בודד והוגש לניתוח ריצוף אקסום שלם.

וריאנטים מבניים שהיו חוזרים על עצמם ובעלי פוטנציאל להשפעה תפקודית אושרו על ידי כלי ריצוף עצמאי כגון ריצוף סנגר. דוגמה המוצגת כאן נשאה מוטציה הטרוזיגוטית, וקו תאי ההורים הונדס לאחר מכן כדי לבטא את ה-CDNA המוטנטי. בעוד שביטוי יתר של CDNA מהסוג הפראי לא הצליח להעניק עמידות לתרופות.

המוטציה CD NA העניקה באופן משמעותי עמידות פנוטיפית לתרכובת מספר אחת, ואישרה את התפקיד הפונקציונלי של השונות המבנית כמניע ההתנגדות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לפתח צמיחה עמידה ספונטנית כדי לסנן גנים האחראים לעמידות לתרופות בתאי סרטן לאחר התפתחותה. טכניקה זו מסייעת לחוקרים בתחום האונקולוגיה לחקור את מנגנוני העמידות לתרופות בצורה בלתי משוחדת הן בשורות תאים סרטניים והן במודלים של בעלי חיים.