הקמת קלינית רלוונטי

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ליצור מודל רלוונטי מבחינה קלינית שבו ניתן לעקוב אחר תיקון פצע בסביבתו המיקרוסקופית הטבעית. הדבר מושג תחילה על ידי הסרת העדשה מעינו של עובר תרנגולת. השלב השני הוא ביצוע חתך קטן בחלקה הקדמי של העדשה.

לאחר מכן, בצעו שטיפה הידראולית (hydro elute) למסה של תאי סיבי העדשה. בשלב הבא, יש להשטיח את קפסולת העדשה יחד עם האפיתל הנלווה על ידי ביצוע חתכים נוספים בקפסולה הקדמית. השלב הסופי הוא קיבוע התרבית הפגועה לכלי התרבית, כדי לעקוב אחר תהליך ריפוי הפצע בעודו מתרחש.

בסופו של דבר, נעשה שימוש במיקרוסקופיית time-lapse, מיקרוסקופיית קונפוקלית ואנליזה ביוכימית כדי להדגים מנגנונים של תיקון פצע במודל המשחזר באופן הדוק את הסביבה in vivo. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום ריפוי הפצעים, כגון האופן שבו תאים נעים יחד באופן מתואם כדי לסגור את הפצע. שיטה זו עשויה לספק תובנות לגבי תהליך תיקון הפצע.

ניתן ליישם זאת גם במחקרים של ריפוי פצעים ב-ABER, ובמיוחד בפיברוזיס ובצלקות. התחילו בהנחת שלוש צלחות פטרי בנפח 100 מילימטר בתוך מנדף זרימה למינרית סטרילי. מלאו שתי צלחות פטרי עד מחציתן בבופר tris dextrose בטמפרטורת החדר, והשאירו את השלישית ריקה.

לאחר מכן, הוצא ביצת תרנגולת לבנה (white leghorn) פורייה ביום עובר 15 מהדגירה בטמפרטורה של 37.7 °C ונקה את החלק החיצוני של הקליפה באמצעות 70% ethanol לצורך סטריליזציה. לאחר מכן, שבור את הביצה בזהירות והעבר את תוכנה אל Petri dish ריקה בקוטר 100 mm. באמצעות פינצטה סטנדרטית ומספריים עדינים, בצע כריתת ראש לעובר והנח את הראש באחת מהצלחות המכילות את TST dextrose buffer.

בתוך 15 דקות, העבירו את ראשו של עובר האפרוח אל מכסה של צלחת פטרי. השתמשו בפינצטה בעלת דיוק גבוה כדי ללחוץ על החלק האחורי של העין, ובכך צרו פתח קטן בחלק האחורי של העין. לאחר מכן, אחזו בנוזל הזגוגית (vitreous humor) באמצעות פינצטה ומשכו אותו בעדינות בתנועה גולגלית.

הזגוגית עם העדשה המחוברת אליה תיפרד מהעין. העבר את העדשה ואת הזגוגית לצלוחית הפטרי הנותרת המכילה Tex extras Buffer. השאר את העדשות בבופר למשך לא יותר מ-30 דקות לפני המשך הנתיחה.

בשלב הבא, העבירו את העדשה למכסה של צלחת פטרי חדשה תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי באמצעות פינצטה בעלת דיוק גבוה, והסירו בזהירות בעזרת קצה הפינצטה את כל תאי הגוף השרישי שנתלשו יחד עם העדשה. לאחר מכן, הפרידו את העדשה מההומור ויטראוס על ידי צביטה וניתוק של הגוף הזגוגי מהקשר שלו עם הקפסולה האחורית של העדשה. לאחר ההפרדה, העבירו את העדשה לטיפה של 200 microliter של בופר tris dextrose בצלחת תרבית רקמות של 35 millimeter, והניחו אותה כך שההיבט הקדמי של העדשה פונה כלפי מעלה.

ניתן לזהות בקלות את החלק הקדמי של העדשה לפי נוכחותו של טבעת צפופה ברקמה, המסמנת את הגבול בין האזור הפנימי לאזור המשוות של אפיתל העדשה. באמצעות שתי פינצטות בעלות דיוק גבוה, בצעו חתך קטן באורך של כ-850 microns במרכז הקפסולה הקדמית של העדשה, על ידי תפיסת הרקמה עם פינצטה אחת בכל יד ומתיחה עדינה לכיוונים מנוגדים. לאחר מכן, קחו מזרק של 1 milliliter עם מחט במידה 27.5 gauge ומלאו אותו ב-300 microliters של TST dextrose buffer.

החדירו את קצה המחט לתוך החתך שבוצע בקפסולת העדשה הקדמית, עד למחציתה בערך של העדשה. לאחר מכן, לחצו בעדינות על המזרק והזרימו את בופר הדקסטרוז של ה-TST לתוך העדשה. מסת תאי סיב.

הזריקו בין 50 ל-200 µL של בופר כדי לשחרר את מסת תאי הסיבים מהאפיתלום ומקפסולת העדשה שסביבם. לעולם אל תזריקו יותר מ-300 µL. בעזרת פינצטה ברמת דיוק גבוהה, הוציאו את מסת תאי הסיבים המשוחררת מהעדשה דרך אתר החתך הקדמי.

הסרת מסת תאי הסיב מההיצמדות שלה לקפסולה האחורית יוצרת אזור פצע הניתן לשחזור רב על קרומי הבסיס, המוקף באפיתל פגוע. החל מהשקיק הקפסולרי, בצעו חמישה חתכים בחלק הקדמי של העדשה ועד לקו המשווה. השטיחו את חמש השסועים שנוצרו של קפסולת העדשה עם האפיתל הצמוד אליה על צלחת התרבית, כאשר צד הקפסולה פונה מטה וצד התאים פונה למעלה.

לחץ בעדינות באמצעות הפנצטה בכל אחת מהנקודות של הכוכב כדי לקבע את הקפסולה לצלוחית. פעולה זו תיצור שקע קטן בחמש הקצוות החיצוניות ביותר של ה-x explan ותביא להיצמדות יציבה לצלוחית. לאחר מכן, הסר את בופר ה-tris dextrose מהצלוחית בנפח 35 מילימטר והחלף אותו ב-1.5 מיליליטר של M1 99 מחומם מראש.

מצע מועשר ב-1% של L-glutamine ו-penicillin. Streptomycin. כסו את הצלחת במכסה שלה והניחו אותה באינקובטור. הניחו את צלחת התרבית תחת מיקרוסקופ סטריאו ותצפיתו על הגבול שבין אזור הנדידה המרכזי לבין אזור ההיצמדות המקורי של תאי האפיתל.

לאחר מכן, השתמשו בשתי פינצטות בעלות דיוק גבוה כדי לתפוס את הקצוות של שני צדי קו ההפרדה בין שני האזורים. משכו בעדינות את אזור ההצמדה המקורי לאורך הקו כדי להפריד בקלות בין שני האזורים. המשיכו להפריד בין שני האזורים מסביב לתרבית כולה עד ששני האזורים יופרדו לחלוטין.

יש לבחון את שני השברים באמצעות טכניקות אנליטיות מולקולריות או ביוכימיות סטנדרטיות. מיד לאחר הסרת מסת תאי הסיבים, תת-אוכלוסייה של תאי תיקון מזנכימליים עשירים ב-ment מופעלים ונדרכים אל קצה הפצע של האפיתל. תאים אלו נעים במהירות אל האזור נטול התאים של קפסולת קרומי הבסיס האנדוגנית, אזור הנדידה המרכזי, כדי להתחיל בתהליך הריפוי.

הפצע, הטכניקה המתוארת כאן מכינה באופן מושלם את מערכת מודל זו לצפייה בתהליך זה באמצעות מיקרוסקופ או מצלמה; ריפוי הפצע מתקדם במהירות ומכסה שטח משמעותי של הפצע עד היום הראשון בתרבית. עד היום השלישי, תהליך ריפוי הפצע בדרך כלל מסתיים לאחר הפרדה בין אזור הנדידה המרכזי לבין אזורי ההיצמדות המקוריים. הבדלים מולקולריים בין אזורים נבדלים אלו נותחו כאן.

רמות ה-focal adhesion kinase נמדדו בשני האזורים, ונמצא כי כמות ה-focal adhesion kinase המפוספורה הייתה מוגברת באזור ההגירה המרכזי הספציפי להגירה. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים את טכניקת ניתוח הקטרקט המדמה בתוך שלוש דקות אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו יוצרים מודל של ניתוח קטרקט מדמה המדמה באופן הדוק תיקון פצע בסביבה מיקרוסקופית טבעית.