Name: הקמת קלינית רלוונטי Ex Vivo דגם ניתוח קטרקט מוק לחקירת תיקון פצע אפיתל במייקרו-סביבה של ילידים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: חקור מודל ניתוח קטרקט מוק בחוליית עוברי תרנגולת לחקירת תיקון פצע אפיתל במיקרו-סביבה טבעית. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר תהליכי החלמה ומנגנוני תיקון רקמה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק המכונים הלאומיים לבריאות ל-A.S.M. (EY021784).

הפרוטוקול הבא עומד בהנחיות הטיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש אוניברסיטת תומס ג&#39;פרסון ועם הצהרת ארוו לשימוש בבעלי חיים במחקר חזון. 1. התקנה והכנת עדשות לתרבות Ex Vivo פצע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח שלוש 100 מ&quot;מ צלחות פטרי ב, זרימה למינרית סטרילי. מלא שתי צלחות פטרי באמצע הדרך עם חיץ טריס / דקסטרוז (חיץ TD, 140 מ&quot;מ NaCl, 5 מ&quot;מ KCl, 0.7 מ&quot;מ Na 2 PO 4, 5 מ&quot;מ D-גלוקוז, 8.25 מ&quot;מ טריס בסיס, pH 7.4 עם HCl) ב RT , עוזב את ריק שלישי. תקשורת ותרבות טרום חמה (199 מדיה בתוספת, 1% L- גלוטמין ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין) עד 37 מעלות צלסיוס הערה: הפצע הסטנדרטי ריפוי תקשורת והתרבות הוא סרום ללא, כפי שקורה בvivo; עם זאת, ניתן לגדל תרבויות פצע-תיקון בהצלחה בתנאים שהוגדרו בתקשורת הכוללים סרום או גורמים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ד העוברי הפורהאיי 15 ביצת אפרוח ליבורנו לבנה מחממה (מוחזק ב37.7 מעלות צלזיוס עם נדנדה עדינה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום שנבחרה ביצה בזרימה למינרית ומחוץ נקי של פגז עם אתנול 70% מבקבוק לשטוף. לנהל את כל ההליכים המפורטים להלן בתנאים אספטיים בזרימה למינרית, תוך שימוש בפתרונות וכלים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפצח תוכן ביצה ומקום לצלחת פטרי 100 מ&quot;מ הריקים. לערוף עובר באמצעות מלקחיים סטנדרטיים ומספריים עדינים. מניחים את ראש עובר אפרוח בצלחת פטרי המכילה מאגר TD ולהשליך כיאות את השארית של העובר. לחלופין לשמור על הראשים עוברים אפרוח במאגר TD לתקופה קצרה של זמן, לא יותר מ -15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את ראש עובר אפרוח על מכסה צלחת פטרי. בעזרת מלקחיים דיוק גבוהים, להסיר את העדשה יחד עם ההומור שלה מצורף זגוגית מהעין ברצף הבא. לצבוט את החלק האחורי של העין עם המלקחיים כדי ליצור פתח קטן בחלק האחורי של העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, לתפוס את הומור זגוגי wמלקחיים ה- i ובעדינות למשוך על הזגוגית בתנועת גלגול, הזגוגית עם העדשה מצורפת, וחילצה מן העין. עדשת מקום / זגוגית בצלחת פטרי שנותרה המכילה מאגר TD. לאפשר העדשות להישאר במאגר TD לא יותר מ -30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את העדשה למכסה צלחת פטרי חדש תחת מיקרוסקופ לנתח. בשלב זה לבצע את כל הפעולות תחת מיקרוסקופ לנתח. עם מלקחיים דיוק גבוהים לצחצח בזהירות כל גוף הריסים (תאי פיגמנט) שחלצו עם העדשה באמצעות קצה המלקחיים, לוקח זהירות שלא לפגוע ברקמת העדשה. הערה: הסרת גוף הריסים מבטיחה כי סוגי תאים שאינם אנדוגני לעדשה אינם כלולים בתרבות תיקון פצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את העדשה מהזגוגית עם מלקחיים דיוק גבוהים על ידי צובט את הגוף הזגוגי מהקשר שלה עם הקפסולה העדשה האחורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות דיוק גבוה מלקחיים להעביר את העדשה לירידה קטנהשל חיץ TD (כ -200 μl) בצלחת תרבית רקמת 35mm. </li></ol> 2. ניתוח קטרקט מוק הבמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכוון את העדשה בירידה של חיץ TD בצלחת 35 מ&quot;מ עם ההיבט הקדמי של העדשה פונה כלפי מעלה. הערה: הקדמי של העדשה מזוהה בקלות על ידי הנוכחות של טבעת צפופה ברקמה שמציינת את הגבול בין קדמי ואזור קו המשווה של האפיתל העדשה. לעומת זאת, יש העדר סימונים על האחורי של הקפסולה העדשה שתאי עדשת הסיבים מחוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בשני מלקחיים דיוק גבוהים לעשות חתך קטן (כ 850μm) במרכז הקפסולה הקדמית העדשה, הקרום במרתף העבה המקיף את רקמת העדשה, ואפיתל העדשה קדמית הקשורים אליו, תוך כדי אחיזה ברקמה עם מלקחיים בכל יד ו בעדינות מושך בכיוונים מנוגדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מסת תאי סיבים, מה שהופך את חלק הארי של רקמת עדשה, dislodגינג מנספחיו לאפיתל העדשה ומקיפה כמוסת עדשה על ידי הידרו-elution (גישה המשמשת בניתוחי קטרקט קלאסיים, דגם באיור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאי מזרק 1 מיליליטר עם קצה מחט 27.5 G עם 300 μl של חיץ TD. הכנס את קצה המחט לתוך החתך שנעשה בכמוסת העדשה הקדמית, ובערך באמצע הדרך לעדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לדכא את מזרק הזרקת חיץ TD למסת תאי סיבי עדשה. להזריק בין 50 ל 200 TD μl, ולא יותר מ -300 μl. שים לב למסת תאי סיבי התרופפות עצמו מכמוסת האפיתל ועדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים דיוק גבוהים, להסיר את מסת תאי סיבים משוחררת מהעדשה דרך אתר החתך הקדמי. הערה: הליך זה יוצא הקפסולה העדשה האחורית קרום במרתף כדי שתאי הסיבים היו קשורים ערום של תאים, ואפיתל עדשה נפצע רק בסמוך לאתר זה. </li></ol> 3. ומתכונניםז העדשות הפצועים לאקס תרבות Vivo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטח את שקית קופסית העדשה, הנובעת מניתוח הקטרקט שתואר לעיל על צלחת התרבות, צד עד תא, על ידי ביצוע חמישה חתכים בהיבט הקדמי של תיק קופסית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך בניצב לאתר החתך המקורי ועד לקו המשווה של הכדור. שטחו את חמישה &quot;הדשים&quot; התוצאה של כמוסת עדשה עם אפיתל המצורף בצד כמוסת צלחת התרבות למטה, בצד עד תא. שים לב לעדשה נפצעה vivo לשעבר עכשיו צריך לקחת על כוכב או צורה דמוית פרחים (ראה איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח את הקפסולה לצלחת, עיתונות ברכות למטה עם המלקחיים בכל נקודה של הכוכב. זה יהפוך את כניסה קטנה בחמשת הטיפים מחוץ ביותר של explant ולגרום לקובץ מצורף מתמשך לצלחת. הערה: ניתן לפגוע בכמוסה במהלך הליך זה ולכן חשוב להבטיח את הקפסולה לצלחת הקרובה לטיפים של פלורידהנ.ב. ככל האפשר, כמו גם להפוך את הכמות המינימאלית של נקודות הבטחת ככל האפשר (בדרך כלל שתיים, מקסימום שלושה לדש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חיץ TD מצלחת 35mm ולהחליף אותו עם 1.5 מיליליטר של תקשורת מחוממת מראש. מכסה את צלחת 35mm עם המכסה שלה ומקום בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2). </li></ol> 4. הפרדה של מרכז הגירת האזור (CMZ), שבו מחדש epithelialization של האזור הפצוע בקפסולה אחורית מתרחש, מהקובץ המצורף המקורי האזור (OAZ) של תאי אפיתל העדשה, לניתוח כמותי. הערה: התאים מתחילים לנוע לאזור CMZ מייד בתגובה לפציעה. ביום אחד בתרבות מספיק תאים נודדים ברחבי CMZ לניתוח מולקולרי וביוכימיים, הבאים הפרדת CMZ וOAZ על ידי מיקרו לנתיחה 23. פרוטוקול זה כרוך ההסרה של כנף אחת (OAZ) בכל פעם מהאזור הפצוע של הקפסולה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב Demarקטיון, נראה בבירור מתחת למיקרוסקופ לנתח, בין OAZ וCMZ (ראה איור 2 א). שימוש בשני מלקחיים דיוק גבוהים, לתפוס בשני המלקחיים בקצה קו OAZ / CMZ, אחד רק בסמוך לאחר, משני צדי הקו (ראה איור 2 א, ב, חץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש ביד אחת / אחד מלקחיים בצד CMZ להמשיך להחזיק בתרבות הפצועה, בעוד עם היד / מלקחיים אחרים, משוך בעדינות את OAZ לאורך קו OAZ / CMZ. CMZ קלות מפריד מOAZ לאורך הקו הזה. תמשיך לאורך הקו הזה מסביב לכל התרבות עד שני האזורים מופרדים לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללמוד את השברים המופרדים OAZ וCMZ לניתוח מולקולרי כמו 24 או ביוכימיים ניתוח RNA-Seq כגון כתם מערבי או שיתוף immunoprecipitation 23,25. </li></ol>

<ol><li>Walker, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+precursors+for+the+mesenchymal+cells+involved+in+injury+response+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Unique precursors for the mesenchymal cells involved in injury response and fibrosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 13730-13735 (2010).</li>
<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+in+morphogenesis%2C+regeneration+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 10, 445-457 (2009).</li>
<li>Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+wound-healing+assays+for+probing+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+laboratory+automation%22%5BJournal%5D)">Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration.</a> Journal of laboratory automation. 17, 59-65 (2012).</li>
<li>Khalil, A. A., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+leader+cells+in+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+%3A+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">Determinants of leader cells in collective cell migration.</a> Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 2, 568-574 (2010).</li>
<li>Walker, J. L., Wolff, I. M., Zhang, L., Menko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+SRC+kinases+signals+induction+of+posterior+capsule+opacification%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Activation of SRC kinases signals induction of posterior capsule opacification.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 48, 2214-2223 (2007).</li>
<li>Sta Iglesia, D. D., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+basement+membrane+after+corneal+debridement%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Disruption of the basement membrane after corneal debridement.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 41, 1045-1053 (2000).</li>
<li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Brown, M., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+the+study+of+recurrent+corneal+epithelial+erosions%3A+alpha9beta1+integrin+implicated+in+progression+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">A mouse model for the study of recurrent corneal epithelial erosions: alpha9beta1 integrin implicated in progression of the disease.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 45, 1775-1788 (2004).</li>
<li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+the+basement+membrane+enhances+corneal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+eye+research%22%5BJournal%5D)">Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing.</a> Experimental eye research. 93, 927-936 (2011).</li>
<li>Stepp, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wounding+the+cornea+to+learn+how+it+heals%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+eye+research%22%5BJournal%5D)">Wounding the cornea to learn how it heals.</a> Experimental eye research. 121, 178-193 (2014).</li>
<li>Kuwabara, T., Perkins, D. G., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sliding+of+the+epithelium+in+experimental+corneal+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Sliding of the epithelium in experimental corneal wounds.</a> Investigative ophthalmology. 15, 4-14 (1976).</li>
<li>Sherrard, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corneal+endothelium+in+vivo%3A+its+response+to+mild+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+eye+research%22%5BJournal%5D)">The corneal endothelium in vivo: its response to mild trauma.</a> Experimental eye research. 22, 347-357 (1976).</li>
<li>Stramer, B. M., Zieske, J. D., Jung, J. C., Austin, J. S., Fini, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+controlling+the+fibrotic+repair+phenotype+in+cornea%3A+implications+for+surgical+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms controlling the fibrotic repair phenotype in cornea: implications for surgical outcomes.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 44, 4237-4246 (2003).</li>
<li>Escamez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+model+of+wound+healing+in+genetically+modified+skin-humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+investigative+dermatology%22%5BJournal%5D)">An in vivo model of wound healing in genetically modified skin-humanized mice.</a> The Journal of investigative dermatology. 123, 1182-1191 (2004).</li>
<li>Werner, S., Breeden, M., Hubner, G., Greenhalgh, D. G., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+keratinocyte+growth+factor+expression+is+reduced+and+delayed+during+wound+healing+in+the+genetically+diabetic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+investigative+dermatology%22%5BJournal%5D)">Induction of keratinocyte growth factor expression is reduced and delayed during wound healing in the genetically diabetic mouse.</a> The Journal of investigative dermatology. 103, 469-473 (1994).</li>
<li>Tarin, D., Croft, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+studies+of+wound+healing+in+mouse+skin.+II.+Dermo-epidermal+interrelationships%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+anatomy%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural studies of wound healing in mouse skin. II. Dermo-epidermal interrelationships.</a> Journal of anatomy. 106, 79-91 (1970).</li>
<li>Croft, C. B., Tarin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+studies+of+wound+healing+in+mouse+skin+I.+Epithelial+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+anatomy%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural studies of wound healing in mouse skin I. Epithelial behaviour.</a> Journal of anatomy. 106, 63-77 (1970).</li>
<li>Winstanley, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial+reaction+in+the+healing+of+excised+cutaneous+wounds+in+the+dog%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+comparative+pathology%22%5BJournal%5D)">The epithelial reaction in the healing of excised cutaneous wounds in the dog.</a> Journal of comparative pathology. 85, 61-75 (1975).</li>
<li>Wormstone, I. M., Wride, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ocular+lens%3A+a+classic+model+for+development%2C+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological%22%5BJournal%5D)">The ocular lens: a classic model for development, physiology and disease.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 366, 1190-1192 (2011).</li>
<li>Danysh, B. P., Duncan, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lens+capsule%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+eye+research%22%5BJournal%5D)">The lens capsule.</a> Experimental eye research. 88, 151-164 (2009).</li>
<li>Awasthi, N., Guo, S., Wagner, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posterior+capsular+opacification%3A+a+problem+reduced+but+not+yet+eradicated%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Posterior capsular opacification: a problem reduced but not yet eradicated.</a> Archives of ophthalmology. 127, 555-562 (2009).</li>
<li>Walker, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+attempts+to+reduce+posterior+capsule+opacification+after+cataract+surgery--a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+experimental+ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Pharmacological attempts to reduce posterior capsule opacification after cataract surgery--a review.</a> Clinical & experimental ophthalmology. 36, 883-890 (2008).</li>
<li>Schmidbauer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posterior+capsule+opacification%5BTitle%5D)+AND+%22International+ophthalmology+clinics%22%5BJournal%5D)">Posterior capsule opacification.</a> International ophthalmology clinics. 41, 109-131 (2001).</li>
<li>Menko, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+central+role+for+vimentin+in+regulating+repair+function+during+healing+of+the+lens+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">A central role for vimentin in regulating repair function during healing of the lens epithelium.</a> Molecular biology of the cell. 25, 776-790 (2014).</li>
<li>Chauss, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+state-specific+mitochondrial+dynamic+regulatory+networks+are+revealed+by+global+transcriptional+analysis+of+the+developing+chicken+lens%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Differentiation state-specific mitochondrial dynamic regulatory networks are revealed by global transcriptional analysis of the developing chicken lens.</a> G3 (Bethesda). 4, 1515-1527 (2014).</li>
<li>Leonard, M., Zhang, L., Bleaken, B. M., Menko, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+N-Cadherin+linked+c-Src+and+fyn+kinases+in+lens+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for N-Cadherin linked c-Src and fyn kinases in lens development.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 242, 469-484 (2013).</li>
<li>Sieg, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAK+integrates+growth-factor+and+integrin+signals+to+promote+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">FAK integrates growth-factor and integrin signals to promote cell migration.</a> Nature cell biology. 2, 249-256 (2000).</li>
<li>Sieg, D. J., Hauck, C. R., Schlaepfer, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Required+role+of+focal+adhesion+kinase+%28FAK%29+for+integrin-stimulated+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Required role of focal adhesion kinase (FAK) for integrin-stimulated cell migration.</a> Journal of cell science. 112 (Pt 16), 2677-2691 (1999).</li>
<li>Hauck, C. R., Hsia, D. A., Schlaepfer, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+focal+adhesion+kinase--a+regulator+of+cell+migration+and+invasion%29%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+life%22%5BJournal%5D)">The focal adhesion kinase--a regulator of cell migration and invasion).</a> IUBMB life. 53, 115-119 (2002).</li>
<li>Zhao, X., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+kinase+and+its+signaling+pathways+in+cell+migration+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+drug+delivery+reviews%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion kinase and its signaling pathways in cell migration and angiogenesis.</a> Advanced drug delivery reviews. 63, 610-615 (2011).</li>
<li>Menko, A. S., Bleaken, B. M., Walker, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional-specific+alterations+in+cell-cell+junctions%2C+cytoskeletal+networks+and+myosin-mediated+mechanical+cues+coordinate+collectivity+of+movement+of+epithelial+cells+in+response+to+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Regional-specific alterations in cell-cell junctions, cytoskeletal networks and myosin-mediated mechanical cues coordinate collectivity of movement of epithelial cells in response to injury.</a> Experimental cell research. 322, 133-148 (2014).</li>
<li>Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing--aiming+for+perfect+skin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Wound healing--aiming for perfect skin regeneration.</a> Science. 276, 75-81 (1997).</li>
<li>Ferguson, M. W., O'Kane, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scar-free+healing%3A+from+embryonic+mechanisms+to+adult+therapeutic+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological%22%5BJournal%5D)">Scar-free healing: from embryonic mechanisms to adult therapeutic intervention.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359, 839-850 (2004).</li>
<li>Redd, M. J., Cooper, L., Wood, W., Stramer, B., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+and+inflammation%3A+embryos+reveal+the+way+to+perfect+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological%22%5BJournal%5D)">Wound healing and inflammation: embryos reveal the way to perfect repair.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 359, 777-784 (2004).</li>
<li>Nodder, S., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+in+embryos%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+embryology%22%5BJournal%5D)">Wound healing in embryos: a review.</a> Anatomy and embryology. 195, 215-228 (1997).</li>
<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

כאן מתוארת טכניקה להכנת מודל תרבית לתיקון פצעים הכוללת ביצוע ניתוח קטרקט ex vivo בעדשות עוברי אפרוחים לאחר הסרתן מהעין. אפיתל העדשה מגיב לפציעה רלוונטית קלינית זו בתהליך תיקון המחקה מקרוב את זה המתרחש in vivo, וחולק תכונות עם תיקון פצעים ברקמות אפיתל אחרות2,4. בעוד שהפרוטוקול פשוט ופשוט לביצוע, ביצוע ניתוח קטרקט מדומה עם עדשות עובריות דורש פיתוח מיומנויות בטיפול ברקמות קטנות שניתן לרכוש בתרגול, שכן קוטר העדשות העובריות הוא כ-2 מ"מ בלבד. הליך ניתוח הקטרקט מבוצע תחת מיקרוסקופ הניתוח, והשלבים הט...

ניתוח הקטרקט הרלוונטי מבחינה קלינית, מדומה, לשעבר vivo מודל ריפוי פצעי אפיתל המתואר כאן פותח כדי לספק כלי לחקר המנגנונים המווסתים את התיקון של רקמות האפיתל בתגובה לפציעה. תכונות עיקריות שנועדו ביצירת מודל זה כלול 1 תנאים) ובלבד שמשוכפלים מקרוב את התגובה בvivo לנפצע בהגדרת תרבות, 2) להקל בויסות אלמנטי הרגולציה של תיקון, ו- 3) יכולת תמונת תהליך התיקון, בשלמותו, בזמן אמת. האתגר, לכן, היה ליצור מודל תרבות שבה ניתן היה ללמוד, ולטפל, לתקן פצע אפיתל במייקרו-הסביבה האם של התאים. הזמינות של מודל פצע-תיקון זה פותחת אפשרויות חדשות לזיהוי רמזי איתות אנדוגני ממטריצת חלבונים, ציטוקינים וכמוקינים המסדירים את תהליך התיקון. בנוסף, המודל אידיאלי לבחינה איךn האפיתל הוא מסוגל לנוע כגיליון קולקטיבי מחדש epithelialize אזור פצע 2,3, ולקביעת השושלת של תאי מנהיג mesenchymal בשולי הפצע שפועלים בהכוונת ההגירה הקולקטיבית של האפיתל נפצע 4. מודל זה גם מספק פלטפורמה שעם לזהות תרופות שיכולים לקדם את ריפוי פצע יעיל ולמנוע תיקון פצע חריג 5. יש כבר מספר דגמי פצע-תיקון זמינים, הן בתרבות וin vivo, שספק את רוב מה שידוע על תהליך תיקון הפצע היום. במודלים של בעלי חיים פציעה, כגון קרנית 6-12 ועור 13-17, יש את ההזדמנות ללמוד את התגובה של הרקמה לפציעתם בהקשר של כל מתווכי התיקון שיכול להיות מעורב בתהליך, כוללים תרומות מ מערכת עצבים כלי דם ו. עם זאת, יש מגבלות למניפולציה של ההתנסותתנאים נפשיים in vivo, וזה עדיין לא ניתן לבצע מחקרי הדמיה של תגובת תיקון in vivo, רציף ולאורך זמן. לעומת זאת, רוב דגמי תרבות במבחנה פצע-תיקון, כגון פצע השריטה, ניתן להשפיע בקלות ואחריו לאורך זמן, אבל חסרים את ההקשר הסביבתי של לימוד ריפוי פצעים ברקמות in vivo. בעוד מודלים vivo לשעבר מציעים את היתרון של לימוד תהליך תיקון פגיעה ברציפות לאורך זמן בהקשר של מייקרו-הסביבה של התאים בשילוב עם היכולת לווסת את הרגולטורים המולקולריים של תיקון בכל נקודה בתהליך זמן, יש כמה דגמים שמתאימים אלה פרמטרים. כאן מתואר הליך כדי ליצור vivo לשעבר פצע אפיתל מאוד לשחזור ריפוי תרבויות שלשכפל התגובה של רקמת האפיתל לפציעה פיזיולוגית. שימוש בעדשה עובר אפרוח כמקור רקמות, vivo לשעבר MOCניתוח קטרקט k מתבצע. העדשה היא רקמה אידיאלית לשימוש עבור מחקרים אלה שכן הוא בתוך כמוסת קרום במרתף עבה עצמאי, avascular, לא innervated, וללא כל סטרומה קשורה 18,19. במחלות של בני אדם, ניתוח קטרקט מתייחס לאובדן ראייה עקב עננות של העדשה, וכרוך בהסרת מסת תאי עדשת סיבים, הכוללת את חלק הארי של העדשה. חזון ניתוח קטרקט בעקבות משוחזר באמצעות ההחדרה של עדשה תוך-עינית מלאכותית. ניתוח הקטרקט, באמצעות הסרת תאי סיבים, גורם תגובת פציעה באפיתל העדשה הסמוכה, שמגיב בepithelialization מחדש של האזור האחורי של הקפסולה העדשה שנכבש על ידי תאי הסיבים. בניתוח קטרקט, כמו ברוב תגובות תיקון הפצע, יש לפעמים מתרחש תוצאה חריגה fibrotic לתגובת ריפוי הפצע, הקשורים בהופעתה של myofibroblasts, אשר בעדשה ידועה כאחורי Capsule העננות 20-22. על מנת ליצור את מודל ריפוי פצע ניתוח קטרקט, ניתוח קטרקט הוא חיקה בעדשות הוסרו מן העין עובר אפרוח לייצר פגיעה פיזיולוגית. הסרת מייקר תוצאות תאי עדשת סיבים באזור פצע עגול מאוד עקבי מוקף תאי אפיתל העדשה. אוכלוסיית תא זה נשארה מחובר היטב לכמוסת הקרום במרתף עדשה והוא נפגע על ידי ההליך כירורגי. תאי האפיתל להעביר על האזור הערום של הקרום במרתף אנדוגני לרפא את הפצע, בראשות אוכלוסייה של תאי mesenchymal vimentin העשיר הידועים בתהליך תיקון תאי מנהיג 1. בעזרת מודל זה התגובה של האפיתל לפציעה ניתן דמיין בקלות ואחריו עם זמן בהקשר של מייקרו-הסביבה של התאים. התאים נגישים לשינויים בביטוי או ההפעלה של המולקולות צפויות לשחק תפקיד בתיקון פצע. תכונה חזקה של ההוא מודל הוא היכולת לבודד ולחקור שינויי הגירה ספציפית במסגרת ריפוי פצעים. היכולת להכין מספר גדול של תרבויות בגילים תואמות vivo לשעבר ריפוי פצע ללימודים היא יתרון נוסף של מודל זה. לפיכך, מערכת מודל זה מספקת הזדמנות ייחודית ללהפריד מנגנוני תיקון פצע ותרופות מבחן להשפעתם על תהליך ריפוי פצע. מודל ניתוח קטרקט המדומה vivo לשעבר צפוי להיות תחולה רחבה, מתן משאבים קריטיים לחקר מנגנונים של תיקון פציעה.

<table><tbody><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>שימוש ב-140 מ"מ ב-TD Buffer</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>שימוש ב-5 מ"מ ב-TD Buffer</td></tr><tr><td>נתרן פוספט (Na2HPO4)</td><td>Sigma</td><td>S0876</td><td>שימוש ב-0.7 מ"מ במאגר TD</td></tr><tr><td>D-גלוקוז (דקסטרוז)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-500</td><td>שימוש ב-0.5 מ"מ במאגר TD</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Base Fisher</td><td>Scientific BP152-1</td><td>שימוש ב-8.25 מ"מ במאגר TD</td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A144-500</td><td>שימוש במאגר pH TD ל-7.4</td></tr><tr><td>מדיה 199</td><td>GIBCO</td><td>11150-059</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>קורנינג/CellGro</td><td>25-005-CI</td><td>שימוש ב-1% במדיה199</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>קורנינג/ CellGro</td><td>30-002-CI</td><td>שימוש ב 1% ב Media199</td></tr><tr><td>100 מ"מ צלחות פטרי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FB0875711Z</td><td></td></tr><tr><td>Stericup יחידת מסנן</td><td>Millipore</td><td>SCGPU01RE</td><td>השתמש לסינון עיקור</td></tr><tr><td>מלקחיים Media Dumont #5 (צורך 2)</td> <td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>35 מ"מ צלחת תרבית תאים</td><td>קורנינג</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>27 גרם 1 מ"ל SlipTip עם מחט החלקה מדויקת</td><td>BD</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>מספריים עדינות</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים סטנדרטיים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>91100-12</td><td></td></tr><tr><td>פריטים אחרים דרושים: מכשירי דיסקציה כלליים, &nbsp; ביצי עוף לבנים פוריים, בדוק חממת ביצים (לחות, 37.7&deg; C), מכסה זרימה למינרית, מיקרוסקופ</td><td></td><td></td><td></td> מנתח סטריאוויז'ן דו-עיני</tr></tbody></table>

הקמת קלינית רלוונטי<em&gt; ex vivo</em&gt; דגם ניתוח קטרקט מוק לחקירת תיקון פצע אפיתל במייקרו-סביבה של ילידים

Establishment of a Clinically Relevant Ex Vivo Mock Cataract Surgery Model for Investigating Epithelial Wound Repair in a Native Microenvironment

המכשול העיקרי להבנת האופן שבו רקמת אפיתל מבצעת תיקון פצע הוא הזמינות המוגבלת של מודלים שבהם ניתן לעקוב ולתפעל את תגובת הפצע ex vivo בסביבה המחקה מקרוב את זו של פגיעה ברקמת אפיתל in vivo. בעיה זו טופלה על ידי יצירת מודל אפיתל רלוונטי קלינית לתיקון פציעות ex vivo המבוסס על ניתוח קטרקט. במודל תרבית זה, ניתן לעקוב אחר תגובת אפיתל העדשה לפציעה בשידור חי במיקרו-סביבה הטבעית של התאים, והמתווכים המולקולריים של תיקון הפצע ניתנים למניפולציה בקלות במהלך תהליך התיקון. להכנת התרביות מסירים עדשות מהעין ומבצעים חתך קטן בחלק הקדמי של העדשה ממנו מסירים את המסה הפנימית של תאי סיבי העדשה. הליך זה יוצר פצע מעגלי על קפסולת העדשה האחורית, קרום הבסיס העבה המקיף את העדשה. אזור פצע זה שבו חוברו תאי הסיבים ממוקם ממש בסמוך לשכבה חד-שכבתית רציפה של תאי אפיתל עדשה שנשארת מחוברת לקפסולת העדשה במהלך ההליך הכירורגי. האפיתל הפצוע, סוג התא שממנו נגזרים תאי סיבים במהלך ההתפתחות, מגיב לפגיעה של הסרת תאי סיבים על ידי תנועה קולקטיבית על פני אזור הפצע, בהובלת אוכלוסייה של תאי תיקון עשירים בווימנטין שאבותיהם המזנכימליים הם אנדוגניים לעדשה1. תכונות אלו אופייניות לתגובת ריפוי פצעי אפיתל רגילה. במודל זה, כמו in vivo, תיקון פצע תלוי באותות המסופקים על ידי הסביבה האנדוגנית הנשמרת באופן ייחודי במערכת תרבית ex vivo זו, ומספקת הזדמנות אידיאלית לגילוי המנגנונים המווסתים את תיקון האפיתל לאחר פציעה.

Ex Vivo דגם נוצר כדי ללמוד את תהליך ריפוי הפצע במייקרו-הסביבה האם של התאים לחקור מנגנונים מעורבים בויסות ריפוי פצע של האפיתל במייקרו-הסביבה המקומית של התאים, מודל ניתוח קטרקט רלוונטי קליני vivo לשעבר מדומה נוצר. מודל זה נוצר מרקמת עדשה המציעה יתרונות רבים בשל המאפיינים הפנימיים שלה: 1) העדשה היא איבר עצמאי מוקף קרום במרתף עבה נקרא הקפסולה העדשה; 2) זה avascular, 3) לא innervated ו -4) ללא סטרומה...

מתואר כאן הקמת מודל ניתוח קטרקט מדומה ex vivo רלוונטי מבחינה קלינית שניתן להשתמש בו כדי לחקור מנגנונים של תגובת הפגיעה של רקמות אפיתל בתוך המיקרו-סביבה הטבעית שלהן.

הקמת קלינית רלוונטי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; דגם ניתוח קטרקט מוק לחקירת תיקון פצע אפיתל במייקרו-סביבה של ילידים

The major impediment to understanding how an epithelial tissue executes wound repair is the limited availability of models in which it is possible to ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ליצור מודל רלוונטי מבחינה קלינית שבו ניתן לעקוב אחר תיקון פצע בסביבתו המיקרוסקופית הטבעית. הדבר מושג תחילה על ידי הסרת העדשה מעינו של עובר תרנגולת. השלב השני הוא ביצוע חתך קטן בחלקה הקדמי של העדשה.לאחר מכן, בצעו שטיפה הידראולית (hydro elute) למסה של תאי סיבי העדשה. בשלב הבא, יש להשטיח את קפסולת העדשה יחד עם האפיתל הנלווה על ידי ביצוע חתכים נוספים בקפסולה הקדמית. השלב הסופי הוא קיבוע התרבית הפגועה לכלי התרבית, כדי לעקוב אחר תהליך ריפוי הפצע בעודו מתרחש.בסופו של דבר, נעשה שימוש במיקרוסקופיית time-lapse, מיקרוסקופיית קונפוקלית ואנליזה ביוכימית כדי להדגים מנגנונים של תיקון פצע במודל המשחזר באופן הדוק את הסביבה in vivo. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום ריפוי הפצעים, כגון האופן שבו תאים נעים יחד באופן מתואם כדי לסגור את הפצע. שיטה זו עשויה לספק תובנות לגבי תהליך תיקון הפצע.ניתן ליישם זאת גם במחקרים של ריפוי פצעים ב-ABER, ובמיוחד בפיברוזיס ובצלקות. התחילו בהנחת שלוש צלחות פטרי בנפח 100 מילימטר בתוך מנדף זרימה למינרית סטרילי. מלאו שתי צלחות פטרי עד מחציתן בבופר tris dextrose בטמפרטורת החדר, והשאירו את השלישית ריקה.לאחר מכן, הוצא ביצת תרנגולת לבנה (white leghorn) פורייה ביום עובר 15 מהדגירה בטמפרטורה של 37.7 °C ונקה את החלק החיצוני של הקליפה באמצעות 70% ethanol לצורך סטריליזציה. לאחר מכן, שבור את הביצה בזהירות והעבר את תוכנה אל Petri dish ריקה בקוטר 100 mm. באמצעות פינצטה סטנדרטית ומספריים עדינים, בצע כריתת ראש לעובר והנח את הראש באחת מהצלחות המכילות את TST dextrose buffer.בתוך 15 דקות, העבירו את ראשו של עובר האפרוח אל מכסה של צלחת פטרי. השתמשו בפינצטה בעלת דיוק גבוה כדי ללחוץ על החלק האחורי של העין, ובכך צרו פתח קטן בחלק האחורי של העין. לאחר מכן, אחזו בנוזל הזגוגית (vitreous humor) באמצעות פינצטה ומשכו אותו בעדינות בתנועה גולגלית.הזגוגית עם העדשה המחוברת אליה תיפרד מהעין. העבר את העדשה ואת הזגוגית לצלוחית הפטרי הנותרת המכילה Tex extras Buffer. השאר את העדשות בבופר למשך לא יותר מ-30 דקות לפני המשך הנתיחה.בשלב הבא, העבירו את העדשה למכסה של צלחת פטרי חדשה תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי באמצעות פינצטה בעלת דיוק גבוה, והסירו בזהירות בעזרת קצה הפינצטה את כל תאי הגוף השרישי שנתלשו יחד עם העדשה. לאחר מכן, הפרידו את העדשה מההומור ויטראוס על ידי צביטה וניתוק של הגוף הזגוגי מהקשר שלו עם הקפסולה האחורית של העדשה. לאחר ההפרדה, העבירו את העדשה לטיפה של 200 microliter של בופר tris dextrose בצלחת תרבית רקמות של 35 millimeter, והניחו אותה כך שההיבט הקדמי של העדשה פונה כלפי מעלה.ניתן לזהות בקלות את החלק הקדמי של העדשה לפי נוכחותו של טבעת צפופה ברקמה, המסמנת את הגבול בין האזור הפנימי לאזור המשוות של אפיתל העדשה. באמצעות שתי פינצטות בעלות דיוק גבוה, בצעו חתך קטן באורך של כ-850 microns במרכז הקפסולה הקדמית של העדשה, על ידי תפיסת הרקמה עם פינצטה אחת בכל יד ומתיחה עדינה לכיוונים מנוגדים. לאחר מכן, קחו מזרק של 1 milliliter עם מחט במידה 27.5 gauge ומלאו אותו ב-300 microliters של TST dextrose buffer.החדירו את קצה המחט לתוך החתך שבוצע בקפסולת העדשה הקדמית, עד למחציתה בערך של העדשה. לאחר מכן, לחצו בעדינות על המזרק והזרימו את בופר הדקסטרוז של ה-TST לתוך העדשה. מסת תאי סיב.הזריקו בין 50 ל-200 µL של בופר כדי לשחרר את מסת תאי הסיבים מהאפיתלום ומקפסולת העדשה שסביבם. לעולם אל תזריקו יותר מ-300 µL. בעזרת פינצטה ברמת דיוק גבוהה, הוציאו את מסת תאי הסיבים המשוחררת מהעדשה דרך אתר החתך הקדמי.הסרת מסת תאי הסיב מההיצמדות שלה לקפסולה האחורית יוצרת אזור פצע הניתן לשחזור רב על קרומי הבסיס, המוקף באפיתל פגוע. החל מהשקיק הקפסולרי, בצעו חמישה חתכים בחלק הקדמי של העדשה ועד לקו המשווה. השטיחו את חמש השסועים שנוצרו של קפסולת העדשה עם האפיתל הצמוד אליה על צלחת התרבית, כאשר צד הקפסולה פונה מטה וצד התאים פונה למעלה.לחץ בעדינות באמצעות הפנצטה בכל אחת מהנקודות של הכוכב כדי לקבע את הקפסולה לצלוחית. פעולה זו תיצור שקע קטן בחמש הקצוות החיצוניות ביותר של ה-x explan ותביא להיצמדות יציבה לצלוחית. לאחר מכן, הסר את בופר ה-tris dextrose מהצלוחית בנפח 35 מילימטר והחלף אותו ב-1.5 מיליליטר של M1 99 מחומם מראש.מצע מועשר ב-1% של L-glutamine ו-penicillin. Streptomycin. כסו את הצלחת במכסה שלה והניחו אותה באינקובטור. הניחו את צלחת התרבית תחת מיקרוסקופ סטריאו ותצפיתו על הגבול שבין אזור הנדידה המרכזי לבין אזור ההיצמדות המקורי של תאי האפיתל.לאחר מכן, השתמשו בשתי פינצטות בעלות דיוק גבוה כדי לתפוס את הקצוות של שני צדי קו ההפרדה בין שני האזורים. משכו בעדינות את אזור ההצמדה המקורי לאורך הקו כדי להפריד בקלות בין שני האזורים. המשיכו להפריד בין שני האזורים מסביב לתרבית כולה עד ששני האזורים יופרדו לחלוטין.יש לבחון את שני השברים באמצעות טכניקות אנליטיות מולקולריות או ביוכימיות סטנדרטיות. מיד לאחר הסרת מסת תאי הסיבים, תת-אוכלוסייה של תאי תיקון מזנכימליים עשירים ב-ment מופעלים ונדרכים אל קצה הפצע של האפיתל. תאים אלו נעים במהירות אל האזור נטול התאים של קפסולת קרומי הבסיס האנדוגנית, אזור הנדידה המרכזי, כדי להתחיל בתהליך הריפוי.הפצע, הטכניקה המתוארת כאן מכינה באופן מושלם את מערכת מודל זו לצפייה בתהליך זה באמצעות מיקרוסקופ או מצלמה; ריפוי הפצע מתקדם במהירות ומכסה שטח משמעותי של הפצע עד היום הראשון בתרבית. עד היום השלישי, תהליך ריפוי הפצע בדרך כלל מסתיים לאחר הפרדה בין אזור הנדידה המרכזי לבין אזורי ההיצמדות המקוריים. הבדלים מולקולריים בין אזורים נבדלים אלו נותחו כאן.רמות ה-focal adhesion kinase נמדדו בשני האזורים, ונמצא כי כמות ה-focal adhesion kinase המפוספורה הייתה מוגברת באזור ההגירה המרכזי הספציפי להגירה. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים את טכניקת ניתוח הקטרקט המדמה בתוך שלוש דקות אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו יוצרים מודל של ניתוח קטרקט מדמה המדמה באופן הדוק תיקון פצע בסביבה מיקרוסקופית טבעית.

establishment-clinically-relevant-ex-vivo-mock-cataract-surgery-model

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

תרבות עיקרית של תאי אנדותל קרניים שור שמשה לחקור את המנגנון של מעבר אנדותל-mesenchymal הקרני. יתר על כן, מודל cryoinjury האנדותל עכברוש הקרני שמש להפגין מעבר אנדותל-mesenchymal קרני in vivo.

במבחנה מודלים Vivo ללמוד קרנית האנדותל-mesenchymal מעבר

כתב יד זה מתאר איך חתך דמוי נגעים על monolayers בתרבית תאים אפיתל בנוחות דגם פצע ריפוי במבחנה, ומאפשר הדמיה על ידי קונאפוקלית או סריקה מיקרוסקופ לייזר, אשר יכול לספק באיכות גבוהה נתונים כמותיים ואיכותיים ללמוד בהתנהגות התא והן את המנגנונים המעורבים בהעברה.

מיקרוסקופ המבוסס על שיטות להערכה של נדידת תאים אפיתל במהלך במבחנה ריפוי הפצע

פרוטוקול עבור אקסית vivo איברים הקרנית תרבות מודל שימושי עבור לימודי ריפוי הפצע מתואר. מערכת מודל זה יכול לשמש כדי להעריך את ההשפעות של סוכני כדי לקדם ריפוי משובי או רעילות התרופה סביבה מאורגנת multicellular תלת-ממד.

Ex-Vivo איברים הקרנית מודל תרבות עבור ריפוי פצעים מחקרים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתק את תאי הקרניות של הקרנית (CEC) מהקרום של האישה (DM) באמצעות "YAG" (בלייזר) של ממברנה הvivo לשעבר של המחלה של keratopathy בולולס (BK).

פיתוח של מודל פולשני, בסיוע לייזר של הקרנית הפסד של תא אנדותל

כאן אנו מדגימים טכניקה ממוטבת להערכת תיקון פצעים באמצעות עור אנושי ex vivo בשילוב עם גישה מוכתמת שלם. מתודולוגיה זו מספקת פלטפורמה פרה-קלינית להערכת טיפולים פוטנציאליים לפצעים.

מודל פצע Ex vivo אנושי וגישה מוכתמת בהר שלם להערכה מדויקת של תיקון העור

כאן מתואר פרוטוקול ליצירת פצע שחיקה מרכזי באפיתל הקרנית בעכבר באמצעות טרפין וספוד של מועדון גולף קהה. מודל זה של ריפוי פצעי הקרנית ניתן לשחזור רב ומשמש כיום להערכת ריפוי פצעי בקרנית שנפגעו בהקשר של מחלות.

מודל שחיקה אפיתליאלית לחקר ריפוי פצעי הקרנית

כאן, מודלים של בעלי חיים המבוססים על עכבר וארנב מפותחים עבור פגיעה מכנית וכימית של אפיתל הקרנית כדי לסנן טיפולים חדשים ואת המנגנון הבסיסי.

מודלים של בעלי חיים של Ex Vivo ו-In Vivo לפציעות מכניות וכימיות של אפיתל הקרנית

הפרוטוקול הנוכחי מדגים את השלבים השונים הכרוכים בפציעת הקרנית של אפרוח עוברי באובו. ניתן לנתח את הקרנית המתחדשת או המשוחזרת במלואה עבור פוטנציאל התחדשות באמצעות טכניקות תאיות ומולקולריות שונות לאחר הליך הפציעה.

חקר התחדשות רקמות ללא צלקות בקרנית אפרוח פצועה עוברית

מאמר זה מתאר פרוטוקול כדי לפשט את התהליך ולהפוך את הכנת סרום מותנה אוטולוגי (ACS) לפחות יקר. אין צורך במזרקים מיוחדים או בחרוזי זכוכית מצופים פני שטח. יתר על כן, ACS שונה (mACS) יש יתרונות תחרותיים על פני סרום אוטולוגי קונבנציונאלי ריפוי פצע הקרנית של העיניים murine ex vivo.

ייצור סרום מותנה אוטולוגי מותאם והערכת Ex Vivo של פוטנציאל הריפוי שלו באפיתל הקרנית

מאמר זה מתאר שיטה ליצירת פצעים באפיתל של מדוזה חיה של Clytia hemisphaerica וריפוי פצעים ברזולוציה גבוהה in vivo. בנוסף, מוצגת טכניקה להחדרת צבעים ותרופות להפרעות לתהליכי איתות בתאי האפיתל ובמטריצה החוץ תאית במהלך ריפוי פצעים.

אפיון ריפוי פצעי אפיתל in vivo באמצעות אורגניזם המודל הקנידרי Clytia hemisphaerica

שיטה זו מדגימה ניתוח קטרקט in vivo על ידי הסרת תאי סיבי עדשה מעכברים בוגרים והשארת שקית הקופסית עם תאי אפיתל מחוברים לעדשה (LECs). תגובת הפציעה מוערכת בזמנים שונים לאחר הניתוח באמצעות קריטריונים מולקולריים ומורפולוגיים.

דוגמנות ניתוח קטרקט בעכברים

חקור מודל ניתוח קטרקט מוק בחוליית עוברי תרנגולת לחקירת תיקון פצע אפיתל במיקרו-סביבה טבעית. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר תהליכי החלמה ומנגנוני תיקון רקמה.

הקמת קלינית רלוונטי

גלה סרטונים נוספים