Name: הקרנת מזון לכיתה Integrons 1 וגין קלטות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: למדו לזהות אינטגרונים מסוג 1 וקסטות גנים של עמידות לאנטיביוטיקה במזון באמצעות PCR וריצוף DNA. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר התפשטות הגנים במזון גולמי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תודה למיכאלה אולם, לריסה Bispo וגוסטבו Tavares לקבלת סיוע טכני.

מוצרי מזון שנאכלים טרי או מבושל קל הם של רוב הדאגה לבריאות אדם. דוגמאות כוללות ירקות סלט, פירות, צדפות וסרטנים. אוסף 1. לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דגימות בתנאים שלמזער זיהום, ומאוחסן בשקיות נפרדות, נקיות במהלך הובלה. לאחר שנאסף, יש לאחסן דגימות ב 4 מעלות צלזיוס ומעובדות בתוך 24 שעות. </li></ol> 2. מועשרת תרבות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פירות וירקות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כ -10 גרם של חומר בשקית ניילון עמידה. אם עיבוד חומר גדול יותר, להתרכז בעור של הפרי או ירק. להוסיף 90 מיליליטר 0.1 M חיץ נתרן פוספט, pH 7.0 ותהליך בבלנדר ההנעה למשך 30 שניות. לחלופין, החומר יכול להיות נסער באופן ידני אם בלנדר ההנעה אינו זמין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את הנוזל לתוך שני צינורות 50 מיליליטר פלקון. צנטריפוגה צינורות ב 4000 XG במשך 7 דקות לחיידקים גלולה. </l<html> i&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את supernatant ולהשעות את חיידקי pelleted ב 30 מיליליטר של מרק סטרילי וריא Bertani (LB). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על O ייקר / N, מחזיק צינור אחד של 25 מעלות צלזיוס ואחרת על 37 מעלות צלזיוס. צריכה להיות מזועזעות תרבויות ב 200 תנודות לדקה (OPM). תרבויות חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד נדרשות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פירות ים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הבטן (צדפות) או מערכת עיכול (סרטנים) באמצעות מלקחיים ופינצטה סטרילי ומקום לתוך צינור 1.5 מיליליטר סטרילי המכיל 200 μl של 0.1 חיץ פוספט M נתרן, pH 7.0. מרוך המדגם ליצור homogenate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 5 מיליליטר של מרק LB לשני 5 מיליליטר צינורות סטרילי, ולחסן כל עם homogenate פירות הים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על O ייקר / N, מחזיקה צינור אחד של 25 מעלות צלזיוס ומעלות צלזיוס 37 אחרים. צריכה להיות מזועזעות תרבויות ב 200 OPM. תרבויות חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד נדרשות. </li></ol></li></ol> 3. תרבויות הקרנה לIntegrons = &quot;Jove_content&quot;&gt; הערה: פרוטוקולי PCR רגילים נמצאים בשימוש במתודולוגיה זו, באמצעות מאגרים מסופקים עם האנזים, וMgCl 2 ריכוז סופי של 2.5 מ&quot;מ. במידת הצורך, לורנץ (2011) 24 התוו שיטות אופטימיזציה ופתרון בעיות PCR בנושא קודם של כתב עת זה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת DNA מבושל: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר תרבות המועשרת 100 μl לתוך צינור PCR 0.5 מיליליטר סטרילי. מחממים את המדגם 99 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, שימוש באמבט מים או גוש חום. הצמד מקרר על קרח למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microcentrifuge 14,000 XG במשך 5 דקות עד גלולה פסולת תא. חזור לקרח. אפשר להקפיא דגימות DNA ב -20 ° C עד נדרשות, אבל חייב להיות מופשרים על קרח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקרנה לintegrons הכיתה 1 באמצעות PCR: הערה: תרבויות מעורבות מO הדגירה / N מוקרנות על integrons הכיתה 1 באמצעות פרוטוקול HS463a / HS464 PCR (טבלת 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את כל חומרים כימיים PCR על קרח, הרחק מכל סו פוטנציאל<html> rces של זיהום DNA. איפור mastermix PCR 48 μl לדגימה, לרבות בקרות שליליות (טבלה 2). לוותר 48 μl של תמהיל אב PCR לכל צינור, באמצעות טיפים מחסום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl של DNA המופשר לצינורות PCR בודדים באמצעות טיפים מחסום. הפעל תכנית מתאימה בthermocycler PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך את התוצאות של ההגברה, electrophorese 7 μl של מוצר ה- PCR על ג&#39;ל agarose 2% שפך ולהפעיל במאגר TBE (90 מ&quot;מ טריס-borate, 2 מ&quot;מ EDTA). כולל סמן משקל מולקולרי, כגון סולם 100 נ&quot;ב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההודעה כתם ג&#39;ל עם כתם DNA, ולדמיין באמצעות transilluminator UV. בדוק שלא חלה הגברה בבקרה השלילית. להקה חזקה בסביבות 470 נ&quot;ב לכל מדגם מסוים מצביעה על כך שהתרבות המעורבת מכילה חיידקים הנושאים integron כיתת 1. מושבות טהורות עכשיו תהיינה מבודדות מכל תרבות מעורבת שחזרה PCR חיובי. </li></ol></li></ol>&gt; 4. הקרנת יחידה המושבות לIntegrons Class 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דילולים סידוריים וצלחות התפשטות: הערה: כדי לבודד מושבות אחת מהתרבויות המעורבות PCR החיובי, התרבות המעורבת היא בדילול סדרתי של פי 10 בחיץ פוספט נתרן, ולאחר מכן מצופה להתאושש מושבות אחת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של תרבות המעורבת עד 9 מיליליטר של חיץ פוספט 0.1 M נתרן, pH 7.0 ומערבבים על ידי היפוך. הוסף 1 מיליליטר של הדילול ל9 מיליליטר נוסף של חיץ פוספט, וחזור עד דילול סדרתי של 10 -8 הוא הגיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התפשטות 10 -4 עד 10 -8 דילולים על אגר LB 100 μl, בשני עותקים. דגירה הצלחות O / N באותה הטמפרטורה המשמשת לתרבות המעורבת הראשונית. אז יכולות להיות מאוחסנות צלחות על 4 מעלות צלזיוס עד נדרשים, אולם עדיף לעבד את המושבות אחת למדי מייד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירה יחידה מושבה והכנת DNA מבושלת: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק מושבות אחת מהצלחות דילול סדרתי, selecting סוגי מושבה שונים רבים ככל האפשר, תוך שימוש בקריטריונים כגון גודל מושבה, צורה וצבע. השתמש קיסמי סטרילי כדי לבחור מושבות אחת מצלחת ההתפשטות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגעת בקיסם למושבה, ולאחר מכן להעביר לתוך צינור PCR המכיל מים סטריליים 100 μl. אם מספר גדול של מושבות הם שיוקרנו, אז יכולות להיות מוכנות מושבות במגש microtiter. ספין הקיסם בין האצבעות כדי לסלק חלק מהתאים אל תוך המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש באותו הקיסם, לחסן צלחת LB עם פס של המושבה. מספר גדול של מושבות ניתן לאחסן על צלחות שכותרתו אם כל פס ארוך על 1 סנטימטר. חזור על שלבי 1 עד 3 עד שבחרת מספר מתאים של מבודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה O צלחות LB / N, באותה הטמפרטורה כמו שמשמש לתרבות המועשרת הראשונית. אז יכולות להיות מאוחסנות תרבויות על 4 מעלות צלזיוס עד נדרשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכנת דנ&quot;א מהשעיות חיידקים, בצע את השלבים כמו outlined בסעיף 3.1. להקרנה של lysates התרבות הטהור, לבצע HS463a / HS464 PCR כפי שתואר בסעיף 3.2. מבודד שתחזור PCR חיובי ישמש להכנת דנ&quot;א גנומי (סעיף 5), ולניתוחים נוספים. </li></ol></li></ol> 5. מושבות האחת הגנום הפקת DNA של Integron חיובי שימוש ביד הכאת 25 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 5 מיליליטר של מרק LB עם מדגם של התרבות הטהורה מבודדת בסעיף 4.2. דגירה O / N, רועדת באותה הטמפרטורה ששימשה לתרבות המועשרת הראשונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולה ב 4000 XG במשך 7 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant. Resuspend תאי pelleted ב 1 מיליליטר פתרון CLS-TC בצינור הכנה מהירה lysing מטריקס E. שימוש במכונת מכות חרוז, לעבד את המדגם על 5.5 מ &#39;/ שנייה למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינור צנטריפוגה ב 14,000 XG במשך 5 דקות ולהתאושש 700 μl של supernatant לתוך צינור 1.5 מיליליטר סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 700 μl של מטריצה ​​מחייבת דילול 1: 5 עם 6 גואן Midinium thiocyanate ומערבבים על RT במשך 5 דקות. צנטריפוגה ב 14,000 XG דקות 1, supernatant פסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 800 לשטוף μl אתנול מלח (70% אתנול, 0.1 נתרן אצטט M) ומערבולת עד גלולה היא resuspended באופן מלא. שטוף במשך 5 דקות ב RT, צנטריפוגות ב 14,000 XG דקות 1 ולהשליך supernatant. להבטיח את כל supernatant הוסר, באמצעות micropipette במידת צורך, ולאחר מכן לאפשר לאוויר יבש במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend מטריצת גלולה ב200 μl TE (10 מ&quot;מ טריס HCl, 1 המ&quot;מ EDTA, pH 7.6) על ידי pipetting למעלה ולמטה. לדגור על RT במשך 3 דקות. צנטריפוגה ב 14,000 XG במשך 3 דקות והעברה 160 μl של ה- DNA eluted לתוך צינור סטרילי. הפעל aliquot של מיצוי DNA הגנומי על 2% w / ג&#39;ל agarose נ &#39;כדי לבדוק את התשואה ויושרה של מיצוי DNA. הדנ&quot;א הגנומי המטוהר מאוחסן ב -20 ° C והפשרה על קרח בעת צורך לבדיקת PCR. </li></ol> 6. PCRs אבחון ורצפי DNA הערה:הדנ&quot;א הגנומי מוכן בסעיף 5 ישמש לכל PCRs האבחון, וכדי לאשר את הבדיקה החיובית לintegrons 1 הכיתה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר הדנ&quot;א הגנומי על קרח, בקצרה מערבולת דגימת DNA וספין דופק ב14,000 XG במשך 20 שניות. חזור על PCR לגן integron-אינטגראז כיתת 1 באמצעות HS463a / HS464 (טבלה 1), המאשר כי לבודד הוא חיובי עבור amplicon 471 נ&quot;ב (סעיף 3.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי של תרבויות חיוביות לרמת מין מושגת על ידי ניתוח של גן rRNA המקטע הקטן (16S rDNA). להגביר את גן 16S באמצעות f27 פריימרים / r1492 (טבלת 1). בדקו את מוצרי ה- PCR באמצעות אלקטרופורזה. כל היעדים בקטריאלי צריכים ליצור amplicon 16S של כ 1,450 נקודות בסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף amplicon גן 16S rRNA כדי לקבוע את זהות מינים, אבל כן יש סיכוי להיות PCRs החיובי מרובה מצעד 6.2, ורבים מאלה תוצאות חיוביות יהיו זהים מיני חיידקים, אנו להבחין מינים שונים ראשון usinעיכול הגבלת גרם של מוצר 16S PCR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכל aliquot של 16S PCR עם אנזים ההגבלה 1 Hinf. כל אנזים שמכיר אתרי מחשוף 4 נ&quot;ב יעשו, אבל 1 Hinf מייצר מגוון טוב ממטרות 16S, והוא אנזים אמין, זול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת הגבלת 30 μl לעכל mastermix (טבלה 2) בצינור סטרילי ולהוסיף 20 μl של מוצר 16S PCR-purfied האו&quot;ם. דגירה בO אמבט המים 37 מעלות צלזיוס / N. בדוק את התקציר על 2% agarose ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציון דפוסי העיכול מיוצרים על ידי 1 Hinf. מבודד עם אותו פרופיל הגבלת 16S עשויים להיות אותו המין. במקום רצף כל מוצר 16S PCR, רצף לכל היותר שלושה נציגים של כל דפוס הגבלה Hinf 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את מוצרי 16S PCR באמצעות ערכה מסחרית. ניתן להשתמש בערכת exonuclease חד גדילים, אך מבוססת עמודה או שיטות ממטרים גם לעבוד היטב כדי להסיר unincפריימרים orporated וDNAs חד גדילים. רצף amplicons 16S באמצעות R910 פריימר (טבלת 1), הגדרת התגובות כמו שצוינה על ידי מתקן הרצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ברצף ה- DNA וכתוצאה מכך לחקור את בסיס הנתונים DNA צמח השדה עם פונקצית blastn <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi" target="_blank">(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).</a> זהות נוקלאוטיד יותר מ 97% נלקחת בדרך כלל כזהות מינים. </li></ol> 7. מיפוי ואפיון של מערכי Integrons והקלטת הערה: Class integrons 1 נובע ממערכות אקולוגיות הנשלט אדם צפוי להיות integrons הנפוץ ביותר בכל דוגמאות שלך. יש כל integrons אלה מקור יחיד אחרונים, ויש לי רצף ה- DNA השמור ביותר 5 לכן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבחין בין מעמד integrons 1 נובע ממקורות אנושיים ואלה המתרחשים באופן טבעי בדגימות סביבתיות על ידי ביצועPCR עם פריימר להגדיר intI1F165 / intI1R476 10 (טבלה 1). הערה: Class integrons 1 מחיידקים קליניים או commensal יפיק מוצר נ&quot;ב ~ 300, ואילו ברמה סביבתית 1 integrons לא יניב כל מוצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפיין את integrons הקליני על ידי הגברת מערך הקלטת עם סט פריימר HS458 / HS459. זה PCR יהיה להגביר את האזור בין intI1 וקטע המשומר &#39;3 בתחנה הסופית של רוב מערכי קלטת. מכיוון שהמספר והזהות של קלטות הוא משתנה, בגודל של מוצר ה- PCR גם להשתנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר amplicons ורצף ה- DNA באמצעות כל אחד מצבעי יסוד ההגברה. השתמש רצפים לחקור מאגרי DNA באמצעות פונקצית blastn <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi" target="_blank">(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שיום של קלטות מעקב מינוח תקני 9, מאז תצהירי נתונים רבים לקלטת גן integronים להשתמש בשמות עולים בקנה אחד או דו-משמעיים. תן תשומת לב מיוחדת לקלטות גן רומן, שכן אלה עלולים לקודד פנוטיפים חדשים, כוללים גנים המעניקים יכולת העברה מוגברת, פתוגניות או אלימות 8,21. הערה: פרה-קלינית צורות של integron כיתת 1 עדיין להסתובב בסביבה טבעית. בפרט, אלה שצמודים לTn 402 transposons הפעיל הם המעניין ביותר 26. מערכי הקלטת של integrons אלה לא להגביר עם סט פריימר HS458 / HS459, אבל יכולים להיות מוגבר עם סט פריימר MRG284 / MRG285 (טבלת 1), שהניבו amplicons של גודל המשתנה תלוי על תוכן קלטת. צריכים להיות מטוהרים מוצרי ה- PCR ו- DNA רצף כפי שמתואר ב7.2. </li></ol>

<ol><li>Bush, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tackling antibiotic resistance.</a> Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).</li>
<li>Davies, J., Davies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+evolution+of+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Origins and evolution of antibiotic resistance.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).</li>
<li>Costa, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+is+ancient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance is ancient.</a> Nature. 477 (7365), 457-461 (2011).</li>
<li>Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+consequences+of+antibiotic+use+for+the+resistome%2C+mobilome+and+microbial+pangenome%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary consequences of antibiotic use for the resistome, mobilome and microbial pangenome.</a> Front. Microbiol. 4, 4(2013).</li>
<li>Gillings, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+class+1+integrons+and+the+rise+of+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The evolution of class 1 integrons and the rise of antibiotic resistance.</a> J. Bacteriol. 190 (14), 5095-5100 (2008).</li>
<li>Brassard, S., Lapointe, J., Roy, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+relative+strength+of+tandem+promoters+for+the+antibiotic-resistance+genes+of+several+integrons%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Diversity and relative strength of tandem promoters for the antibiotic-resistance genes of several integrons.</a> Gene. 142 (1), 49-54 (1994).</li>
<li>Partridge, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+the+attI1+site+of+class+1+integrons%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol%22%5BJournal%5D)">Definition of the attI1 site of class 1 integrons.</a> Microbiol. 146 (11), 2855-2864 (2000).</li>
<li>Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrons%3A+Past%2C+Present%2C+and+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Integrons: Past, Present, and Future.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 78 (2), 257-277 (2014).</li>
<li>Partridge, S. R., Tsafnat, G., Coiera, E., Iredell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+cassettes+and+cassette+arrays+in+mobile+resistance+integrons%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons.</a> FEMS Microbiol. Rev. 33 (4), 757-784 (2009).</li>
<li>Gillings, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+class+1+integron-integrase+gene+as+a+proxy+for+anthropogenic+pollution%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Using the class 1 integron-integrase gene as a proxy for anthropogenic pollution.</a> ISME J. In press, (2014).</li>
<li>Gaze, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impacts+of+anthropogenic+activity+on+the+ecology+of+class+1+integrons+and+integron-associated+genes+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Impacts of anthropogenic activity on the ecology of class 1 integrons and integron-associated genes in the environment.</a> ISME J. 5, 1253-1261 (2011).</li>
<li>Gerzova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+microbiota+composition+and+presence+of+selected+antibiotic+resistance+genes+in+carriage+water+of+ornamental+fish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Characterization of microbiota composition and presence of selected antibiotic resistance genes in carriage water of ornamental fish.</a> PLoS ONE. 9, e103865(2014).</li>
<li>Power, M., Emery, S., Gillings, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Into+the+wild%3A+dissemination+of+antibiotic+resistance+determinants+via+a+species+recovery+program%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Into the wild: dissemination of antibiotic resistance determinants via a species recovery program.</a> PLoS ONE. 8, e63017(2013).</li>
<li>Stokes, H. W., Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+flow%2C+mobile+genetic+elements+and+the+recruitment+of+antibiotic+resistance+genes+into+Gram-negative+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Gene flow, mobile genetic elements and the recruitment of antibiotic resistance genes into Gram-negative pathogens.</a> FEMS Microbiol. Rev. 35 (5), 790-819 (2011).</li>
<li>Moura, A., Oliveira, C., Henriques, I., Smalla, K., Correia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+diversity+of+conjugative+plasmids+in+integron-carrying+bacteria+from+wastewater+environments%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Broad diversity of conjugative plasmids in integron-carrying bacteria from wastewater environments.</a> FEMS Microbiol. Lett. 330 (2), 157-164 (2012).</li>
<li>Schlüter, A., Krause, L., Szczepanowski, R., Goesmann, A., Pühler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+diversity+and+composition+of+a+plasmid+metagenome+from+a+wastewater+treatment+plant%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Genetic diversity and composition of a plasmid metagenome from a wastewater treatment plant.</a> J. Biotech. 136 (1-2), 65-76 (2008).</li>
<li>Taylor, N. G. H., Verner-Jeffreys, D. W., Baker-Austin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquatic+systems%3A+maintaining%2C+mixing+and+mobilising+antimicrobial+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22TREE%22%5BJournal%5D)">Aquatic systems: maintaining, mixing and mobilising antimicrobial resistance.</a> TREE. 26 (6), 278-284 (2011).</li>
<li>Stalder, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+impact+of+hospital+effluent+on+dissemination+of+the+integron+pool%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative impact of hospital effluent on dissemination of the integron pool.</a> ISME J. 8, 768-777 (2014).</li>
<li>Allen, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Call+of+the+wild%3A+antibiotic+resistance+genes+in+natural+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Call of the wild: antibiotic resistance genes in natural environments.</a> Nature Rev. Microbiol. 8, 251-259 (2010).</li>
<li>Wellington, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+natural+environment+in+the+emergence+of+antibiotic+resistance+in+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of the natural environment in the emergence of antibiotic resistance in Gram-negative bacteria.</a> Lancet Infect. Dis. 13 (2), 155-165 (2013).</li>
<li>Gillings, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobilization+of+a+Tn402-like+class+1+integron+with+a+novel+cassette+array+via+flanking+miniature+inverted-repeat+transposable+element-like+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Env.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mobilization of a Tn402-like class 1 integron with a novel cassette array via flanking miniature inverted-repeat transposable element-like structures.</a> Appl. Env. Microbiol. 75 (18), 6002-6004 (2009).</li>
<li>Graham, D. W., Collignon, P., Davies, J., Larsson, D. J., Snape, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Underappreciated+role+of+regionally+poor+water+quality+on+globally+increasing+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Env.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Underappreciated role of regionally poor water quality on globally increasing antibiotic resistance.</a> Env. Sci. Technol. 48 (20), 11746-11747 (2014).</li>
<li>Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibiotic+resistome%3A+what%27s+new%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opinion+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The antibiotic resistome: what's new.</a> Curr. Opinion Microbiol. 21, 45-50 (2014).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J. Vis. Exp. 63, e3998-e3998 (2011).</li>
<li>Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Extraction+of+PCR-Competent+DNA+from+Recalcitrant+Environmental+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Env.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Extraction of PCR-Competent DNA from Recalcitrant Environmental Samples.</a> Env. Microbiol. 1096, 17-23 (2014).</li>
<li>Sajjad, A., Holley, M. P., Labbate, M., Stokes, H., Gillings, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+class+1+integron+with+a+complete+Tn402-like+transposition+module%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Env.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Preclinical class 1 integron with a complete Tn402-like transposition module.</a> Appl. Env. Microbiol. 77 (1), 335-337 (2011).</li>
<li>Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+in+the+environment%3A+A+link+to+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opinion+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance in the environment: A link to the clinic.</a> Curr. Opinion Microbiol. 13 (5), 589-594 (2010).</li>
<li>Stokes, H., Nesbo, C., Holley, M., Bahl, M., Gillings, M., Boucher, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+1+integrons+predating+the+association+with+Tn402.-like+transposition+genes+are+present+in+a+sediment+microbial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Class 1 integrons predating the association with Tn402.-like transposition genes are present in a sediment microbial community.</a> Journal of Bacteriology. 188, 5722-5730 (2006).</li>
<li>Lane, D. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLane%2C+DJ+%22Nucleic+Acid+Techniques+in+Bacterial+Systematics%22">Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics</a>. , John Wiley &Sons, Inc. 115-175 (1991).</li>
<li>Holmes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+activity+of+a+distinctive+integron-gene+cassette+system+associated+with+stutzeri.+populations+in+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Recombination activity of a distinctive integron-gene cassette system associated with stutzeri. populations in soil.</a> Journal of Bacteriology. 185, 918-928 (2003).</li>
</ol>

המחברים אין רלוונטי לגילוי.

זיהוי של integrons וקלטות הגן הקשור הוא פוטנציאל צעד מפתח בניבוי הופעתה של פתוגנים אופורטוניסטיים חדשים, מעקב מסלולים לפתוגנים לשרשרת מזון האנושי, וזיהוי התנגדות חדשה וארסי גורמים מכתיבים 8,21,26. מטרת מאמר זה הייתה לתאר גישה יעילה לסינון דגימות לintegrons 1 הכיתה, אפיון מערכי הקלטת שלהם וזיהוי מיני חיידקים שבו הם מתגוררים. צעדים קריטיים בפרוטוקול כרוך בפועל מיקרוביולוגית טובה, ומניעת זיהום PCR שתעוררנה חיוביות שגוי. <p class="jove_content" style=";text-align:right;...

גילוי האנטיביוטיקה היה אחד ההישגים המדעיים הגדולים ביותר של המאה ה -20. עם זאת, השימוש וניצול לרעה של אנטיביוטיקה הוביל להתפתחות המהירה של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה, ואלה עכשיו מהווים איום רציני לבריאות ציבור במאה ה -21. העלייה של זני חיידקים עמידים למרבית אפשרויות הטיפול מעלה את האפשרות שאנו נכנסים לעידן שבו תרופות נגד חיידקים כבר לא יעילות 1,2. המכונות הגנטיות שמקנות עמידות לאנטיביוטיקה היא מערכת עתיקה, מקדימים בני אדם ולחצי בחירה אנטיביוטיים על ידי מיליוני שנות 3. אלמנטים גנטיים ניידים, כגון פלסמידים, transposons, איים הגנומי, אלמנטי conjugative אינטגרטיבית וintegrons יכולים להפיץ את הגנים אנטיביוטיקה התנגדות (ARG) הן בתוך ובין מיני חיידקים 4. מבין אלה, integrons שיחק תפקיד מרכזי בהתפשטות ARG, למרותעובדה שהם מסתמכים על פלסמידים וtransposons לגיוס והכנסה לתוך הגנום של חיידקי 5. Integrons ללכוד קלטות גן באמצעות integron-אינטגראז, ולאחר מכן להביע קלטות באמצעות integron מקודד אמרגן 6,7 (איור 1). Integron גן קלטות אלמנטים ניידים קטנים בהיקף של מסגרות יחידה פתוחה קריאה (ORF) שמוצרים יכולים להעניק עמידות לאנטיביוטיקה או חומרי חיטוי 8. integrons Class 1 הוא integrons התאושש הנפוץ ביותר מבידודים קליניים 5, שבו הם רכשו ביחד יותר מ -130 קלטות גן עמידות לאנטיביוטיקה שונות 9. התפשטות integrons 1 הכיתה לחיידקים פתוגניים commensal וקשורים אנושיים מייצרת זרמי פסולת אנושיים המכילים מספר גדול של אלמנטים הגנטיים אלה 10. 10 19 חיידקים מוערכים המכילים כיתת 1 integrons משתחררים דרך ביוב בוצה כל i שנהn בריטניה 11. לכן זה לא מפתיע שintegrons כיתת 1 המקנות התנגדויות אנטיביוטיקה עכשיו שיראו בחיידקים של ציפור בר, דגים, וחיות ברות האחר 12-14 ילידים. שחרור integrons בחזרה לסביבה מהווה איום משמעותי על בריאות הציבור, מאז רכישת קלטות גן חדשות וארגון מחדש מורכב עם אלמנטים ניידים אחרים ממשיכה להתרחש, במיוחד בצמחים לטיפול בשפכים ובגופי מים אחרים 15-18. הסביבה הטבעית ואז הופכת קרקע פורה לגיוס גורמי התנגדות חדשים ופתוגנים אופורטוניסטיים 19,20. חיידקים המכיל integron רומן וargs החדש יכולים מעגל בחזרה לקהילה האנושית דרך מים ומזון מזוהמים 21,22. מעקב של args הסביבתי הוא אסטרטגיה מפתח להבנה ולניהול עמידות לאנטיביוטיקה בעתיד 23. בפרט, יש לשים לב למזון שאכלו גלם אוקל מבושל, שכן אלה להציג את האיום הגדול ביותר להעברה של אלמנטים ניידים חדשים ופתוגנים. בפרוטוקול זה, גישה יעילה לאיתור, זיהוי ואפיון כיתת 1 integrons וקלטות הגן הקשור במוצרי מזון מתוארים (איור 2). באמצעות שילוב של תגובת שרשרת culturing ופולימראז (PCR), integrons ניתן לאתר במהירות בקהילות חיידקים מורכבות ומבודדות בודדים. שיטות לזיהוי המינים של חיידקים וקונפורמציה והזהות של קלטות הגן-קשור integron מקבלות. השיטה מתאימה למגוון רחב של מזונות צמחיים ובעלי חיים, ודוגמאות של תהליכי עבודה טיפוסיים ניתנות לכל אחד מסוגי המזון.

<table><tbody><tr><td>GoTaq Colourless Mastermix</td><td>Promega</td><td>M7132</td><td>משמש בכל ה-PCRs</td></tr><tr><td>RNAse (Ribonuclease A מלבלב בקר)</td> <td>Sigma</td><td>R6513-10MG</td><td>משמש בכל ה-PCRs</td></tr><tr><td>אנזים הגבלת HinFI</td><td>Promega</td><td>R6201</td><td>משמש לעיכול 16S rDNA PCR poducts. אנזים מגיע עם חיץ אופטימלי וסולם BSA</td></tr><tr><td>100 bp</td><td>GE Healthcare</td><td>27400701</td><td>משמש כתקן גודל על כל ג'לי האגרוז</td></tr><tr><td>GelRed DNA</td><td>כתם ביוטיום</td><td>41003</td><td>זהירות: יש ללבוש הגנה אישית בעת טיפול בחומר זה</td></tr><tr><td>Guanidinium thiocyanate</td><td>Life Technologies</td><td>AM9422</td><td>זהירות: יש ללבוש הגנה אישית בעת טיפול בחומר זה</td></tr><tr><td>CLS-TC פתרון</td><td>MP Biomedicals</td><td>6540409</td><td>תמיסת השעיה המשמשת בתחילת מיצוי ה-DNA הגנומי</td></tr><tr><td>Lysing Matrix E FastPrep Tubes</td><td>MP Biomedicals</td><td>116914500</td><td>Tube הנדרש לשיבוש מכני של דפנות תא חיידקים. קוד זה משמש לחבילות של 500 צינורות, כמויות קטנות יותר זמינות.</td></tr><tr><td>מטריצת קשירה</td><td>MP Biomedicals</td><td>116540408</td><td>מדולל 1:5 עם 6 M guanidinium thiocyanate ומשמש בשיטת מיצוי ה-DNA הגנומי.</td></tr><tr><td>מכונת הכנה מהירה</td><td>MP Biomedicals</td><td>מספר האפשרויות הזמינות</td><td>ל-MP Biomedicals יש מספר מכונות FastPrep זמינות לרכישה. בקר בכתובת <a href="http://www.mpbio.com" target="_blank">http://www.mpbio.com</a> למידע נוסף</td></tr></tbody></table>

הקרנת מזון לכיתה integrons 1 וג&#39;ין קלטות

Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes

עמידות לאנטיביוטיקה היא אחד האיומים הגדולים ביותר על הבריאות במאהה-21. רכישת גנים עמידים באמצעות העברת גנים רוחבית היא גורם מרכזי בהתפשטות מנגנוני עמידות מגוונים. בין מרכיבי ה-DNA המאפשרים העברה רוחבית, האינטגרונים מסוג 1 היו אחראים במידה רבה להפצת גורמי עמידות לאנטיביוטיקה בקרב פתוגנים שליליים גראם. בסך הכל, אינטגרונים אלה רכשו והפיצו למעלה מ-130 גנים שונים של עמידות לאנטיביוטיקה. עם המשך השימוש באנטיביוטיקה, אינטגרונים מסוג 1 הפכו נפוצים בכל מקום בקומנסל ובפתוגנים של בני אדם ובעלי החיים המבויתים שלהם. כתוצאה מכך, ניתן למצוא אותם כעת בכל זרמי הפסולת האנושית, שם הם ממשיכים לרכוש גנים חדשים, ויש להם פוטנציאל לחזור לבני אדם דרך שרשרת המזון. פרוטוקול זה מפרט גישה יעילה לאיתור אינטגרונים מסוג 1 וקלטות הגנים העמידות הקשורות אליהם במזון, באמצעות תרבית ו-PCR. באמצעות פרוטוקול זה, החוקרים אמורים להיות מסוגלים: לאסוף ולהכין דגימות ליצירת תרביות מועשרות ולסנן אינטגרונים מסוג 1; לבודד מושבות חיידקים בודדות כדי לזהות מבודדים חיוביים לאינטגרון; לזהות מיני חיידקים המכילים אינטגרונים מסוג 1; ולאפיין את האינטגרונים הללו ואת קלטות הגנים הקשורות אליהם.

<html> הקרנה של תרבויות מעורבות ומבודדים חיידקים לintI1 סט פריימר HS463a / HS464 PCR יכול לשמש כדי לזהות את נוכחותו של הגן ברמת 1 integron-אינטגראז, intI1 (איור 1). סט פריימר זה עובד היטב עבור איתור intI1 בתרבויות מעורבות, וגם משמש כדי מושבות חיידקים שנקטפו מצלחות התפשטות (איור 2). מבודדים חיובי צריכים ליצור להקה חזקה יחידה ב471 נ&quot;ב באמצעות קבוצה זו פריימר <str...

פרוטוקול זה מתאר את הזיהוי של אינטגרונים מסוג 1 וקלטות הגנים הקשורות אליהם במזון.

הקרנת מזון לכיתה Integrons 1 וג&#39;ין קלטות

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לספק גישה יעילה לזיהוי אינטגרונים (integrons) מסוג class one וקסטות הגנים הקשורות אליהם מתוך מוצרי מזון. דבר זה מושג תחילה על ידי יצירת תרבית חיידקים מועשרת מפריט המזון הנבחר. השלב השני הוא סריקת התרבית לנוכחות של אינטגרונים מסוג class one באמצעות PCR ובידוד מושבות בודדות מהתרבית המעורבת החיובית לאינטגרונים.לאחר סריקת המושבות הבודדות לנוכחות של אינטגרונים, הכין DNA גנומי מהמושבות הבודדות עבור בדיקות PCR אבחנתיות להבחנה בין מיני חיידקים ולזיהוי נוכחות של קסטות גנים. השלב הסופי הוא טיהור תוצרי ה-PCR ושליחתם לניתוח רצף DNA. בסופו של דבר, ניתוח רצף ה-DNA משמש לאפיון קסטות גנים בתוך אינטגרון מסוג class one ולזיהוי המין שבו הן נמצאות.עמידות לאנטיביוטיקה היא אחת הבעיות המרכזיות העומדות בפני הטיפול הרפואי במאה ה-21. אחת הדרכים שבהן ניתן לנהל את העמידות לאנטיביוטיקה היא על ידי זיהוי ומעקב אחר גנים של עמידות לאנטיביוטיקה בסביבה, מבני אדם לסביבה ובחזרה. פרוטוקול זה ידגים לכם כיצד לזהות עמידות לאנטיביוטיקה.גנים במזונות שייתכן שנאכל גולמיים או עם עיבוד מינימלי. הפרוצדורה תודגם על ידי Leet Waldron, פוסט-דוקטורנט העובד במעבדה שלי. מזונות הנאכלים גולמיים או מבושלים קלות, כגון פירות, ירקות וסרטנים ומולוסקים, מהווים את החשש הגדול ביותר לבריאות האדם.כאן יודגם רק תהליך ההכנה של תרביות מועשרות מפירות ים. אנא עיינו בטקסט הפרוטוקול לצורך הכנת תרביות מפירות וירקות. כדי להכין תרבית מועשרת מפירות ים, השתמשו תחילה בפינצטות סטריליות כדי להוציא את מערכת העיכול מהשרימפס.העבירו את החומר המבודד למבחנה סטרילית של 1.5 milliliter המכילה 200 microliters של בופר פוספט נתרן. רסקו את הדגימה באמצעות עלי מכתש ליצירת הומוגנאט ובצעו ערבוב ב-vortex. העבירו במהירות חמישה milliliters של מצע LB broth לשתי מבחנות סטריליות של חמישה milliliters, והחדירו לכל אחת מהן את ההומוגנאט ממאכלי הים.נער את שני המבחנות למשך לילה ב-200 OPM, תוך דגירה של מבחנה אחת ב-25 degrees Celsius והשנייה ב-37 degrees Celsius. ביום למחרת, אחסן את התרביות ב-four degrees Celsius עד לדרישה לבידוד מושבות בודדות מתרבית מעורבת חיובית ל-PCR. ראשית, בצע דילול סדרתי של התרבית פי עשרה בבופר sodium phosphate על ידי הוספת 1 mL מהתרבית המעורבת ל-9 mL של בופר sodium phosphate וערבב באמצעות vortex.הוסיפו מיליליטר אחד של המיהול לעוד תשעה מיליליטרים של בופר סודיום פוספט וחזרו על הפעולה עד להשגת מהול סדרתי של 10⁻⁸. פזרו 100 µL מהמהולים בריכוזים שבין 10⁻⁴ ל-10⁻⁸ של התרבית המהולה על מצע LB agar. הדגישו את הפעולה בשכפולים, והדגירו את הצלחות הפטריות למשך לילה בטמפרטורה שבה השתמשו עבור התרבית המעורבת הראשונית, ביום למחרת.ניתן לבחור מושבות בודדות מלוחות הדילול הסידורי. להכנת DNA, יש לוודא שכל הלוחות ומבחנות הדגימה מסומנים בבירור לפני התחלת העבודה. יש להרטיב קיסם סטרילי במושבה בודדת ולאחר מכן להעבירו למבחנת PCR המכילה 100 µL של מים סטריליים.סובב את קיסם השיניים בין האצבעות כדי לשחרר חלק מהתאים אל תוך המים; באמצעות אותו קיסם שיניים, זרע על צלחת LB פס של כל מושבה שנבחרה. ניתן לאחסן מספר רב של מושבות על צלחות מסומנות. אם כל פס הוא באורך של כסנטימטר אחד, סגור את המכסה מיד כדי להפחית זיהום בין הדגימות.בחרו כמה שיותר סוגי מושבות שונים באמצעות קריטריונים כגון גודל המושבה, צורתה וצבעה. דגרו את צלחות ה-LB למשך לילה בטמפרטורה שבה נעשה שימוש עבור תרבית ההעשרה הראשונית. לאחר מכן ניתן לאחסן את התרביות בטמפרטורה של 4 °C עד למועד הכנת ה-DNA מהסספנסיות החיידקיות.חממו את הדגימות ל-99 °C למשך 10 דקות באמצעות תרמוסייקלר, ולאחר מכן סובבו במיקרו-צנטריפוגה ב-14,000 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לשקיע את פסולת התאים, והחזירו לקרח. לאחר מכן, בצעו סקר של ה-DNA באמצעות PCR עם הפריימרים HS 4 63 A ו-HS 4 64. בהתאם לנהלים המתוארים בטקסט הפרוטוקול, חשוב להימנע מכל מקור פוטנציאלי לזיהום DNA בעת ביצוע ה-PCR; כדי להעריך את תוצאות ההגברה, בצעו אלקטרופורזה.שבעה µL מכל תוצר PCR על ג'ל agarose בריכוז 2% שנמזג והורץ בבופר TBE לאחר צביעת הג'ל בצבע DNA. הדמיית ה-DNA תתבצע באמצעות UV transluminator. בידודים הנושאים אינטגרון מסוג class one יפיקו פס בודד חזק בגודל 471 base pairs. DNA גנומי שהופק מבידודים שהניבו תוצאת PCR חיובית משמש לאנליזות אלו. הפשיר את ה-DNA הגנומי על קרח, בצע וורטקס קצר וספינטריפוגה (pulse spin) במהירות 14,000 ×g למשך 20 שניות.רצפי הפריימרים ותנאי ה-PCR ששימשו עבור ה-PCR האבחנאי מוצגים בטבלה 1 במאמר. ראשית, חזור על ה-PCR עבור הגן של ה-class 1 integrase כדי לאשש כי הבידוד חיובי לאמפליקון של 471 base pair. לאחר מכן, זהה את התרביות החיוביות ברמת המין על ידי הגברה של הגן 16S rDNA המקודד ל-small subunit ribosomal RNA.כל המטרות החיידקיות צריכות להניב אמפליקון 16S של כ-1,450 זוגות בסיסים, מכיוון שרבות מהתרביות החיוביות הללו יהיו זהות. ניתן להבחין בין מיני החיידקים השונים באמצעות עיכול רסטריקציה של תוצר ה-16S PCR. אנזים הרסטריקציה HIF1 מומלץ, מכיוון שהוא מייצר גיוון טוב ממטרות 16S והוא אנזים אמין וזול.הכינו תערובת מאסטר לעיכול רסטריקציה בנפח של 30 µL במבחנה סטרילית והוסיפו 20 µL של תוצר 16S PCR לא מטהר. הדגירו במקלח מים בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה. למחרת, בדקו את העיכול על ג'ל agarose בריכוז של 2%. תוצרי 16S PCR נבחרים מטהרים לאחר מכן באמצעות ערכה מסחרית ונשלחים למעבדה לריצוף DNA. השתמשו ברצף ה-DNA שהתקבל כדי לבצע שאילתה במאגר הנתונים NCBI DNA באמצעות פונקציית BlastN; זהות נוקלאוטידית של יותר מ-97% נחשבת בדרך כלל כזיהוי של המין.ביצוע סריקה של תרביות מעורבות של בידודים אנטיבקטריאליים לנוכחות של הגן של אינטגראז מסוג class one באמצעות PCR. בשימוש בפריימרים HS 4 63 A ו-HS 4 64, מושבות חיוביות יוצרות פס אחד חזק ב-471 base pairs. DNA גנומי מבידודים טהורים משמש לאפיון של מערכי קסטות בינ-קסטטיים; הגברה של מערכי קסטות מאינטגרונים TN 4 0 2 באמצעות פריימרים HS 4 58 ו-HS 4 59 יוצרת גדלי מוצר משתנים התלויים בזהות ובגודל של הקסטות המרכיבות את המערך.זיהוי קסטות אלו דורש ריצוף DNA. אינטגרונים מסוג Environmental Class 1 מוטמעים לעיתים קרובות בכרומוזומים חיידקיים. ניתן להגביר את המערכים שלהם באמצעות הפריימרים MG 2 84 ו-MG 2 85, המטרגטים את אתרי הרקומבינציה הפרוקסימליים והדיסטליים ביותר, בהתאמה. PCR זה מייצר גם גדלי מוצר משתנים התלויים בזהות ובגודל של הקסטות המרכיבות את המערך.עם זאת, קסטות במערכים סביבתיים אינן צפויות לקודד עמידות לאנטיביוטיקה. מיני חיידקים מזוהים על ידי הגברה של 16 S-R-D-N-A וסריקה של תוצרי ה-PCR באמצעות עיכול. באמצעות HIF, מין בודד ייצור תבניות ייחודיות כך שניתן יהיה לזהות בקלות את הבידודים של אותו מין ולאשר אותם על ידי ריצוף DNA.לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבודד אינטגרונים (integrons) מסוג Class 1 ואת קסטות העמידות לאנטיביוטיקה שלהם ממזונות יומיומיים.

screening-foodstuffs-for-class-1-integrons-and-gene-cassettes

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

שיטה מהירה ויעילה לשלב דנ"א זר של עניין תוך מוכנות זנים נוטלים, המכונות משטח נחיתה זנים, מתואר. השיטה מאפשרת לאתר ספציפי לשילוב של הקלטת ה-DNA לתוך לוקוס משטח מהונדסים הנחיתה של זן מסוים, דרך הצמידה וביטוי integrase ΦC31.

אתר ספציפי הנדסה כרומוזום בקטריאלי: ΦC31 מתווכת integrase קלטת Exchange (IMCE)

חיידקים מייצרים תרכובות מופרשות שיש לו את הפוטנציאל להשפיע על הפיסיולוגיה של חיידקי השכנים שלהם. כאן אנו מתארים מסך coculture המאפשר זיהוי של אינטראקציות כאלה interspecies תיווך כימי על ידי ערבוב של חיידקים אדמה עם זני כתב תעתיק ניאון של Bacillus subtilis על תקשורת מוצקה.

שימוש Coculture לזהות אינטראקציות interspecies המתווכת כימית

עבודה זו מציגה שיטה לסריקת תפוקה גבוהה באמצעות מערכת סינון אנזימים גנטית אוניברסלית שניתן ליישם באופן תיאורטי על למעלה מ-200 אנזימים. כאן, מערכת הסינון היחידה מזהה שלושה אנזימים שונים (ליפאז, צלולאז ופוספטאז אלקליין) פשוט על ידי שינוי הסובסטרט המשמש (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside ופניל פוספט).

הקרנה רב-אנזים באמצעות מערכת הקרנת אנזים הגנטי תפוקה גבוהה

סלמונלה spp /שיגלה spp. הם נפוצים פתוגנים לייחס שלשול. כאן, אנו מתארים פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp / spp.שיגלה באמצעות PCR בזמן אמת בשילוב עם תרבות מודרכים.

פלטפורמה תפוקה גבוהה להקרנה של סלמונלה spp /שיגלה spp.

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור השימוש קיימות מגירות עמידות לאנטיביוטיקה מחיקה בונה כבסיס ליצירת מוטציות מחיקה זנים אחרים e. coli . מוטציות מחיקה כאלה יכולים להיות גייסה ונוסף מיקומה המקביל של זן נמען באמצעות התמרה חושית bacteriophage P1.

הפקת ג'ין מחיקות ב- Escherichia coli מאת P1 התמרה חושית עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה ניתן לניתוח

הגברה איזותרמית בתיווך לולאה (LAMP) היא מבחן הגברה של חומצת גרעין (iNAAT) אשר משך עניין נרחב בתחום זיהוי הפתוגן. כאן, אנו מציגים פרוטוקולסלמונלה LAMP מרובה מעבדות כשיטה מהירה, אמינה וחזקה להקרנת סלמונלה במזון לבעלי חיים ולאימות סלמונלה חזקה מבידוד תרבותי.

הגברה איזותרמית בתיווך לולאה להקרנת סלמונלה במזון לבעלי חיים ואישור סלמונלה מבידוד תרבות

הפרוטוקול מתאר כיצד להשיג שינויים מכווני אתר בגנום של יתושי מלריה אנופלס באמצעות מערכת φC31 . השינויים המתוארים כוללים הן את האינטגרציה והן את חילופי הקלטות מהונדסות בגנום של קווי עגינה נושאי attP.

אתר φC31-בתיווך אינטגרציה וחילופי קלטות בוקטורים אנופלס של מלריה

קמפילובקטר הוא הגורם המוביל לדלקת גסטרואנטריטיס חיידקית המועברת במזון ברחבי העולם. למרות שמפעלים נוקטים צעדים להפחתת השכיחות בכל המתקנים שלהם, מוצרים מזוהמים מגיעים באופן עקבי לצרכנים. הטכניקה שפותחה בשתים עשרה השנים האחרונות נותנת מענה למגבלות של השיטות הקיימות לבידוד וגילוי קמפילובקטר spp. מבשר נא.

איתור ובידוד של קמפילובקטר spp. מבשר נא

אנו מתארים הליך קל להשלמה כרומוזומלית בעותק יחיד של גן משאבת אפלוקס באמצעות מערכת ביטוי מבוססת מיני Tn7 לזן מהונדס חסר אפלוקס של Acinetobacter baumannii. כלי גנטי מדויק זה מאפשר ביטוי גנים מבוקר, שהוא המפתח לאפיון משאבות אפלוקס בפתוגנים עמידים לתרופות רבות.

אפיון מערכות אפלוקס רב-תרופתי ב-Acinetobacter baumannii באמצעות זן חיידקי חסר אפלוקס ומערכת ביטוי גנים חד-פעמית

מחקר זה קובע קבוצה של נהלי הפעלה סטנדרטיים (SOPs) לסינון ובידוד יעיל של חיידקי מעיים המסוגלים לבקע C-גליקוזידים.

סינון ובידוד של חיידקי מעיים החותכים C-גליקוזיד

למדו לזהות אינטגרונים מסוג 1 וקסטות גנים של עמידות לאנטיביוטיקה במזון באמצעות PCR וריצוף DNA. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר התפשטות הגנים במזון גולמי.

הקרנת מזון לכיתה Integrons 1 וג'ין קלטות

גלה סרטונים נוספים