Name: ייצור שיבוט וקנה מידה גדולה של וקטורי adenoviral בקיבולת גבוהה המבוססים על סוג Adenovirus האדם 5 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: למד לייצר וקטורים אדנובירליים בקיבולת גבוהה לטיפול גני באמצעות שיבוט וקנה מידה גדולה. שיטה זו מאפשרת העברת עד 35 קילו-בסיסים של DNA זר לתיקון גנים או הוספתם במחלות תורשתיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק DFG EH 192/5-1 (A.E.), פרויקט Transposmart של האיחוד האירופי (E-rare-2), UWH Forschungsförderung (E.S. ו-W.Z), ותוכנית הדוקטורט של אוניברסיטת Witten/Herdecke (P.B). J.L. נתמך על ידי מלגה של מועצת המלגות הסינית ו-T.B. ו-M.G על ידי קרן Else Kröner-Fresenius (EKFS).

<ol><li>Benihoud, K., Yeh, P., Perricaudet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+vectors+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus vectors for gene delivery.</a> Curr Opin Biotechnol. 10 (5), 440-447 (1999).</li>
<li>Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus%3A+the+first+effective+in+vivo+gene+delivery+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adenovirus: the first effective in vivo gene delivery vector.</a> Hum Gene Ther. 25 (1), 3-11 (2014).</li>
<li>Parks, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+helper-dependent+adenovirus+vector+system%3A+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13565-13570 (1996).</li>
<li>Palmer, D., Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+system+for+helper-dependent+adenoviral+vector+production%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.</a> Mol Ther. 8 (5), 846-852 (2003).</li>
<li>Morral, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+doses+of+a+helper-dependent+adenoviral+vector+yield+supraphysiological+levels+of+alpha1-antitrypsin+with+negligible+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">High doses of a helper-dependent adenoviral vector yield supraphysiological levels of alpha1-antitrypsin with negligible toxicity.</a> Hum Gene Ther. 9 (18), 2709-2716 (1998).</li>
<li>Muruve, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-dependent+adenovirus+vectors+elicit+intact+innate+but+attenuated+adaptive+host+immune+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Helper-dependent adenovirus vectors elicit intact innate but attenuated adaptive host immune responses in vivo.</a> J Virol. 78 (11), 5966-5972 (2004).</li>
<li>Ehrhardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene-deleted+adenoviral+vector+results+in+phenotypic+correction+of+canine+hemophilia+B+without+liver+toxicity+or+thrombocytopenia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A gene-deleted adenoviral vector results in phenotypic correction of canine hemophilia B without liver toxicity or thrombocytopenia.</a> Blood. 102 (7), 2403-2411 (2003).</li>
<li>Cots, D., Bosch, A., Chillon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper+dependent+adenovirus+vectors%3A+progress+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Helper dependent adenovirus vectors: progress and future prospects.</a> Curr Gene Ther. 13 (5), 370-381 (2013).</li>
<li>Mizuguchi, H., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+construction+of+a+recombinant+adenovirus+vector+by+an+improved+in+vitro+ligation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficient construction of a recombinant adenovirus vector by an improved in vitro ligation method.</a> Hum Gene Ther. 9 (17), 2577-2583 (1998).</li>
<li>Mizuguchi, H., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+constructing+E1-+and+E1%2FE4-deleted+recombinant+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">A simple method for constructing E1- and E1/E4-deleted recombinant adenoviral vectors.</a> Hum Gene Ther. 10 (12), 2013-2017 (1999).</li>
<li>Ehrhardt, A., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+adenoviral+helper-dependent+vector+results+in+long-term+therapeutic+levels+of+human+coagulation+factor+IX+at+low+doses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A new adenoviral helper-dependent vector results in long-term therapeutic levels of human coagulation factor IX at low doses in vivo.</a> Blood. 99 (11), 3923-3930 (2002).</li>
<li>Jager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+protocol+for+construction+and+production+of+high-capacity+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rapid protocol for construction and production of high-capacity adenoviral vectors.</a> Nat Protoc. 4 (4), 547-564 (2009).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הפרוטוקול שהוצג כאן מאפשר טיהור של וקטורי HCAdV מבוססים על סוג אדנווירוס אדם 5 מבוססים על נהלים שתוארו קודם לכן 4,12. הגנום HCAdV בתוך פלסמיד pAdFTC הוא נטול כל הגנים אדנווירוס ורק נושא את 5&#39;- ו3&#39;- ITRS ואות האריזה. באסטרטגיה זו HV AdNG163R-2 4 מספק את כל הגנים הנחוצים לייצור וירוס יעיל בטראנס. זה מציע קיבולת אריזה של עד 35 קילו, אשר בבירור outcompetes עו&quot;ד דור הראשון והשני או lentivirus בשימוש נרחב (LV) - או וירוס adeno קשור (AAV) וקטור...

עבור יישומים טיפוליים גן זה הוא בעל חשיבות רבה, כדי למנוע תופעות לוואי רעילות לתאים וחיסוניים הנגרמות על ידי ביטוי של חלבונים נגיפיים, transgene עצמו או על ידי חלבונים נגיפיים נכנסים. וקטורי אדנווירוס (עו&quot;ד) נמצאים בשימוש נרחב כדי להציג דנ&quot;א זר לתוך מגוון רחב של תאים כדי לחקור את ההשפעה של ביטוי transgene 1,2. הגרסה המתקדמת ביותר של עו&quot;ד מיוצגת על ידי וקטורי קיבולת גבוהה אדנווירוס (HCAdV) חסרים כל רצפי הקידוד הנגיפיים 3,4 ובכך מציע קיבולת אריזה עד 35 קילו בשילוב עם חיסוני נמוכות ונמוכה רעילות 5-8. בשל יכולת האריזה שלהם גבוהה הם מאפשרים משלוח של transgenes הגדול או מרובה באמצעות מינון וקטור יחיד. לכן, הם מייצגים כלי רב ערך עבור קהילת המחקר. בניגוד לראשון או עו&quot;ד דור השני חסר גנים המוקדמים E1 ו / או E3 שניתן להפיק בקלות באמצעות ערכות מסחריות, vecטור ייצור בניית הגנום ווירוס של HCAdV הוא מורכב יותר. המערכת לבניית הגנום HCAdV מבוססת על פלסמיד שנשא pAdFTC הגנום HCAdV נטול כל רצפי הקידוד הנגיפיים ופלסמיד הסעות pHM5 9-12. כל גן של עניין של עד 14 קילו בסיסים (KB) ניתן לשכפל לpHM5 וקטור הסעות שבאתר השיבוט מרובה מוקף הכרה / ביקוע אתרים של endonucleases ביות PI- SCE אני ואני- Céu I. לכן, גן משובט של עניין ניתן לשחרר על ידי PI- רצוף SCE אני ואני- Céu אני מעכל להכנסה הבאה מופנה לאותם אתרי ההגבלה הנוכחיים בגנום HCAdV הכלול בpAdFTC פלסמיד. בpAdFTC אתר הכנסת transgene ממוקם בין PI- SCE אני ואני- Céu אני מחשוף אתרים מוקף stuffer DNA ורצפי adenoviral noncoding נדרשים לאריזת הגנום כגון חוזר מסוף כ5 &#39;ו 3&#39; הפוכים (ITRS)בשני קצוות ואות האריזה במורד הזרם של 5&#39;ITR. Stuffer DNA נוסף מספק גודל אופטימלי של הגנום HCAdV הסופי הנע 27-36 קילו כדי להבטיח אריזה יעילה בייצור וירוס. מאז pAdFTC הוא פלסמיד גדול עם עד 45 קילו (תלוי בגודל של transgene הוכנס) ואת השימוש של endonucleases ביות עם אתרי הכרה comparably ארוכים DNA מציג DNA החזק מחייב, כמה צעדי ניקוי נחוצים בעת העברה של transgene מpHM5 לpAdFTC. טיפול זהיר הימנעות כוחות הגז מומלץ. ITRS של הגנום HCAdV נמצא לצד לא אני אתרי הכרת אנזים הגבלה ממוקמים ישירות במעלה הזרם של 5&#39;ITR ומורד זרם של 3&#39;ITR 12. לכן, יכול להיות שפורסם על ידי HCAdV לא אני לעכל לtransfection הבא של הגנום הנגיפי לתוך קו תא מפיק HCAdV. שימו לב שהשימוש באנזים ההגבלה לא אני לrelקלות הגנום הנגיפי מpAdFTC פלסמיד מרמזת כי transgene הוכנס הוא נטול הכרת אתרים לא אני DNA. תאי מפיק תא HEK293 מבוססים (116 תאים) ביציבות להביע recombinase Cre. להגברת וירוס 116 תאים שיתוף נגועים בוירוס עוזר (HV) מספק את כל הגנים עו&quot;ד דרושים לשכפול ואריזה ב3,4 טרנס. HV הוא עו&quot;ד דור ראשון עם אות אריזת floxed אשר הוסרה במהלך ההגברה וירוס על ידי recombinase Cre בא לידי ביטוי בתאים 116 4. הדבר מבטיח כי הגנום בעיקר HCAdV מכיל אות אריזת שלמי encapsidated. טרום הגברה של HCAdV מתבצעת על ידי ביצוע צעדי passaging סידוריים ב116 תאים גדלו על משטחים במנות בתרבית רקמה. אחרי כל קטע חלקיקים נגיפיים משתחררים מהתאים נגועים על ידי ביצוע שלושה שלבים להקפיא להפשיר ברציפות. עם כל מעבר מספר רב של תאים נגועים ב1/3 של lysate תא מהמעבר הקודם. לבסוף lysate מהשלב טרום ההגברה האחרונה משמש להדביק תאי מפיק גדלו בהשעיה בבקבוק טווה להגברה בקנה מידה גדולה. Virions הם מטוהרים מתאי ההשעיה על ידי ביצוע ultracentrifugation בצפיפות צזיום כלוריד שיפוע 4,12. עם הליך זה חלקיקים ריקים וחלקיקים שנאספו באופן מלא מופרדים לשתי להקות שונות. להתרכז HCAdV נוסף חלקיקי צעד ultracentrifugation הלא הדרגתי שני מבוצע. בהמשך לכך וכתוצאה מהלהקה המכילה את HCAdV נאסף ודיאליזה נגד מאגר פיסיולוגי. הכנות וקטור סופיות מתאפיינות ביחס למספרים של חלקיקים נגיפיים מוחלטים, חלקיקים מזהמים ורמות זיהום HV. חלקיקים נגיפיים מוחלטים יכולים להיקבע על ידי lysing חלקיקים נגיפיים ומדידת הספיגה ב 260 ננומטר או על ידי ביצוע בזמן אמת PCR (qPCR) 12. הדבקה של PURחלקיקי נגיף ified יכולים להיקבע על ידי הגנום HCAdV מדידת qPCR הנוכחי בתוך תאים נגועים לאחר זיהום 3 שעות.

<table><tbody><tr><td>CeuI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0699S</td><td>הגבלת תקציר</td></tr><tr><td>PI-SceI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0696S</td><td>תקציר הגבלה</td></tr><tr><td>T4 Ligase</td><td>New Engand Biolabs</td><td>M0202S</td><td>קשירה</td></tr><tr><td>SwaI</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>R0604S</td><td>הגבלת תקציר</td></tr><tr><td>NotI</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>R0189S</td><td>תקציר הגבלה</td></tr><tr><td>פוספטאז אלקליין במעי עגל (CIP)</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0290S</td><td>זרחון של פלסמידים מעוכלים</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>PAN Biotech</td><td>P02-015</td><td>מבחר של CRE המבטא 116 תאים</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-03590&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>מדיום תרבית תאים Hek293T</td></tr><tr><td>מדיום חיוני מינימלי (MEM) Eagle</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-08500</td><td>116 מדיום תרבית תאים&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>דולבקו s מאגר פוספט מלח (DPBS)</td> <td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td>שטיפת תאים, השעיה מחדש של תאים</td></tr><tr><td>בקבוק אחסון 250 מ"ל</td><td>זיהום Sigma</td><td>CLS430281-24EA</td><td>של 116 תאים הגדלים בתרחיף</td></tr><tr><td>500 מ"ל PP צנטריפוגות צינורות</td><td>Sigma</td><td>CLS431123-36EA</td><td>שקיעה של תאים מתרבית תרחיף</td></tr><tr>בקבוק<td>ספינר</td><td>Bellco</td><td>1965-61030</td><td>גידול של 116 תאים ב </td></tr><tr><td>מתלה צינורות אולטרה-צנטריפוגה אולטרה ברורים</td><td>בקמן קולטר</td><td>צנטריפוגה שיפוע צפיפות</td><td>344059</td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td></td><td>צנטריפוגה שיפוע צפיפות</td></tr><tr><td>קולטר רוטור SW-41</td><td>צנטריפוגה שיפוע</td><td>צפיפות בקמן קולטר</td><td></td></tr> ספקטרום <tr><td>מעבדות ספקטרפור ממברנה</td><td>VWR</td><td>צינורות</td><td>דיאליזה</td> 132129</tr><tr><td>קלטות דיאליזה מוכנות לשימוש&nbsp;</td><td>תרמו</td><td>66383</td><td>דיאליזה</td></tr><tr><td>זריקה אחת DH10B אלקטרוכשיר E. coli</td><td>invitrogen</td><td>C4040-52</td><td>טרנספורמציה של תגובות קשירה</td></tr><tr><td>PureYield פלסמיד Midiprep מערכת Promega</td><td></td><td>A2495</td><td>midiprep</td></tr><tr><td>peqGOLD רקמות DNA מיני ערכה&nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>12-3396-02</td><td>בידוד של DNA גנומי</td></tr><tr><td>SuperFect Transfection Reagent</td><td>Qiagen</td><td>301305</td><td>העברה של 116 תאים</td></tr><tr><td>אופטי MEM (10% FBS)</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>טרנספקציה של 116 תאים</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>&nbsp; 170-8882</td><td>q-PCR</td></tr><tr><td>CFX 96 C1000 מגע&nbsp;</td><td>מכונת Biorad</td><td></td><td>qPCR</td></tr><tr><td>פנול/כלורופורם/איזואמיל אלכוהול&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>A156.1</td><td>טיהור DNA</td></tr><tr><td>צזיום כלוריד</td><td>Carl Roth</td><td>8627.1</td><td>צנטריפוגה שיפוע צפיפות</td></tr><tr><td>נתרן אצטט 99%</td> <td>Carl Roth</td><td>6773.2</td><td>משקעי DNA</td></tr><tr><td>LB בינוני&nbsp;</td><td>קארל רוט</td><td>X968.3</td><td>אתנול בינוני לגידול חיידקים</td></tr><tr><td>&nbsp; 99.8%</td><td>קארל רוט</td><td>טהור 9065.5&nbsp;</td><td>משקעים ושטיפה של DNA</td></tr><tr><td>SDS 99.5%</td><td>Carl Roth</td><td>2326.2</td><td>lysis&nbsp; מאגר</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth</td><td>8043.2</td><td>lysis&nbsp; buffer</td></tr><tr><td>Tris-HCl 99%</td><td>Carl Roth</td><td>9090.3</td><td>מאגר דיאליזה/ליזה&nbsp; בופר</td></tr><tr><td>גליצרול 99.5%</td><td>Carl Roth</td><td>3783.1</td><td>מאגר דיאליזה</td></tr><tr><td>MgCl2 98.5%</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.2</td><td>מאגר דיאליזה</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td>מאגר דיאליזה אופציונלי</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Carl Roth</td><td>3904.2</td><td>מאגר דיאליזה אופציונלי</td></tr><tr><td></td><td>סוכרוז Carl Roth</td><td>9286.1</td><td>מאגר דיאליזה אופציונלי</td></tr><tr><td>Na2HPO4x2H2O</td><td>Carl Roth</td><td>4984.2</td><td>מאגר דיאליזה אופציונלי</td></tr><tr><td>צינורות 1.5 מ"ל</td><td>SARSTEDT</td><td>72,730,005</td><td>אחסון תכשירי וירוסים ב-80 & deg; ג</td></tr></tbody></table>

ייצור שיבוט וקנה מידה גדולה של וקטורי adenoviral בקיבולת גבוהה המבוססים על סוג adenovirus האדם 5

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

וקטורים אדנו-ויראליים בעלי קיבולת גבוהה (HCAdV) נטולי כל רצפי קידוד ויראליים מייצגים את אחד מווקטורים להעברת גנים המתקדמים ביותר בשל יכולת האריזה הגבוהה שלהם (עד 35 קילו-בייט), אימונוגניות נמוכה ורעילות נמוכה. עם זאת, עבור מעבדות רבות השימוש ב-HCAdV נפגע על ידי ההליך המסובך לבניית גנום וקטורי וייצור וירוסים. כאן, מתואר פרוטוקול מפורט לשיבוט וייצור יעיל של HCAdV המבוסס על הפלסמיד pAdFTC המכיל את גנום HCAdV. בניית הגנום של HCAdV מבוססת על מערכת וקטור שיבוט המשתמשת באנדונוקלאזות ביות (I-CeuI ו-PI-Sce I). כל גן מעניין של עד 14 קילו-בייט יכול להיות משובט לתוך וקטור המעבורת pHM5, המכיל אתר שיבוט מרובה שמשני צדיו I-CeuI ו-PI-Sce I. לאחר שחרור בתיווך I-CeuI ו-PI-Sce I של הטרנסגן מווקטור המעבורת, ניתן להכניס את הטרנסגן לתוך וקטור השיבוט HCAdV pAdFTC. בגלל הגודל הגדול של הפלסמיד pAdFTC ואתרי הזיהוי הארוכים של האנזימים המשומשים הקשורים לקשירת DNA חזקה, יש צורך בטיפול זהיר בשברי השיבוט. לייצור וירוסים, הגנום HCAdV משוחרר על ידי NotI digest ומועבר לקו תאי יצרן מבוסס HEK293 המבטא ביציבות Cre recombinase. כדי לספק את כל הגנים האדנוויראלים להגברת אדנו-וירוס, נדרשת הדבקה משותפת בנגיף עוזר המכיל אות אריזה המוקף באתרי loxP. הגברה מוקדמת של הווקטור מתבצעת בתאי יצרן הגדלים על משטחים והגברה בקנה מידה גדול של הווקטור מתבצעת בצלוחיות ספינר עם תאי יצרן הגדלים בתרחיף. לטיהור נגיפים מבוצעים שני שלבי אולטרה-צנטריפוגה המבוססים על שיפועי צזיום כלוריד ואחריהם דיאליזה. כאן מוצגים טיפים, טריקים וקיצורי דרך שפותחו במהלך השנים האחרונות בעבודה עם מערכת וקטורית HCAdV זו.

דוגמאות כאן נציג לשיבוט, הגברה וטיהור של הכנות HCAdV מוצגות. סקירה של אסטרטגית השיבוט (איור 1) ודוגמאות מייצגות לשכפול ולשחרורו של הגנום HCAdV על ידי הגבלת אנזים עיכול מסופקים (איור 2). דפוס אופייני הגבלה לאחר שחרורו של קלטת ממשלת ישראל-הביטוי מpHM5 ידי PI- SCE אני ואני- Céu אני לעכל וחילוץ פנול, כלורופורם שלאחר מכן ומשקעים EtOH (ראה גם צעדים 1.2 1.5) מוצגים (איור 2 א). בדרך כלל נ...

מוצג פרוטוקול ליצירת וקטורים אדנו-ויראליים בעלי קיבולת גבוהה החסרים את כל רצפי הקידוד הוויראליים. שיבוט של טרנסגנים הכלולים בגנום הווקטור מבוסס על אנדונוקלאזות ביות. הגברת הנגיף בתאי יצרן הגדלים כתאים נצמדים ובתרחיף מסתמכת על וירוס עוזר המספק גנים נגיפיים בטרנס.

ייצור שיבוט וקנה מידה גדולה של וקטורי adenoviral בקיבולת גבוהה המבוססים על סוג Adenovirus האדם 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להפיק וקטור אדנו-ויראלי בעל קיבולת גבוהה עם מחיקת גנים, לצורך הובלה וביטוי של טרנס-גנים טיפוליים בתאים או באורגניזמים חיים. שיטה זו יכולה לסייע לתחום הטיפול הגנטי בהובלת טרנס-גנים גדולים שאינם נכנסים לווקטורים ויראליים אחרים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שאדנו-וירוסים בעלי קיבולת גבוהה נטולי גנים ויראליים.באמצעות וקטורים אלו ניתן להעביר עד 35 kb של DNA זר. יישום טכניקה זו נרחב לטיפול במחלות תורשתיות, מכיוון שהיא מסייעת בהעברת וקטורים טיפוליים לתיקון גנים או להוספת גנים. שיטה זו מספקת כלי מתקדם להעברה ביולוגית של טרנס-גנים טיפוליים וניתן ליישמה הן בתרביות תאים והן באורגניזמים חיים.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן הגברה של וקטור וטיהור של וקטור דורשים ניסיון מסוים. יש להפעיל מגע נכון במהלך טיהור הוקטור. יש לבדוק אליקוט של פלסמיד ביטוי של גנום אדנווירוס בקיבולת גבוהה, שעבר ליניאריזציה ודלול ביחס של 1:10, באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל.יש להיות ניתן לזיהוי מקטע של תשעה kilobase עבור שלד הפלסמיד pAd-FTC ומקטע DNA שני, בגודל של 28 עד 36 kilobase עבור הגנום של האדנווירוס בעל הקיבולת הגבוהה, בתוספת הגן הנחקר. לאחר מכן, בצע טרנספקציה של צלחת 60 milometer של תאי one one six ברמת התמזגות (confluency) של 50% עד 80%, עם חמישה micrograms של הגנום הלינארי של האדנווירוס בעל הקיבולת הגבוהה, בהתאם לנהלים הסטנדרטיים. 16 עד 18 שעות לאחר הטרנספקציה, הסר בזהירות את המצע והוסף שלושה milliliters של מצע טרי.לאחר מכן, הדביקו את התאים בווירוס העזר AdNG 163R2, תוך יישום של חמש יחידות טרנסדוקציה לתא. דגרו באינקובטור לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius וב-5%CO2. נערהו את הפלטה בכל 20 דקות במהלך השעה הראשונה של הדגירה כדי להפיץ את וירוס העזר באופן שווה לכל התאים.48 שעות לאחר ההדבקה, קצרו את התאים על ידי שטיפתם מכלי התרבית באמצעות תוצר התרבית. שמרו מנה של 0.5 מיליליטר של תאי מעבר אפס (passage zero) לצורך בידוד DNA גנומי. לאחר מכן, בצעו הפשרה והקפאה חוזרת למנה של 2.5 מיליליטר של תאי מעבר אפס באמצעות טבילה בחנקן נוזלי.או הצבת התאים במקפיא בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס ולאחר מכן העברתם למקלח מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס 3 עד 4 פעמים. ערבבו 2.5 מיליליטר של ליזט עם מיליליטר אחד של מצע טרי והוסיפו נגיף עזר בריכוז של שתי יחידות טרנספורמציה לתא. שאבו את המצע מתוך צלחת של 60 מילימטר המכילה תאי 116 במידת התמזגות (confluency) של 90% עד 95% והוסיפו לתאים את תערובת הנגיפים.דגרו את התאים למשך 48 שעות כפי שנעשה קודם לכן. לאחר מכן, קצרו את התאים וחזרו על נהלי ההקפאה/הפשרה וההדבקה פעמיים כדי לקבל ליזטים של מעבר ראשון ומעבר שני. לאחר קבלת הליזט של מעבר שני, ערבבו 2.5 milliliters של ליזט עם 17.5 milliliters של מצע טרי והוסיפו שתי יחידות טרנספורמציה לתא של וירוס עזר.שאבו את המצע מתוך צלחת של 150 מילימטר הכוללת תאי one one six בהסמכה של 80% עד 100%, והדביקו את התאים בתערובת הנגיפית. 48 שעות לאחר ההדבקה, אספו את הליזאט ממעבר 3 (passage three) באמצעות הפרוצדורה שהודגמה כעת. כדי להתחיל בשלב זה, הוסיפו 900 מיליליטר של מצע שחומם מראש לבקבוק תרבית מסוג spinner בנפח של שלושה ליטר.הסר את המצע מלפחות 10 צלחות בודדות של 150 מילימטר של תאי one one six בדרגת התמזגות (confluency) של 90 עד 100%. שטוף את התאים באמצעות 10 מיליליטר של מצע טרי ומחומם מראש. בצע פיפטור למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לקבל תגסוס תאים הומוגני.לאחר מכן, העבירו את התאים ישירות לבקבוק הספינר (spinner flask). דגרו את בקבוק הספינר על בוחש מגנטי בתוך אינקובטור לתרביות רקמה למשך 24 שעות ב-37 °C ו-5%CO2. כווננו את הבוחש המגנטי ל-70 RPM כדי למנוע היצמדות של התאים למשטחי הזכוכית.24 שעות לאחר הקמת בקבוק תרבית הספינר, הוסיפו 500 milliliters של מצע טרי. חזרו על שלב זה פעם נוספת לאחר 24 שעות נוספות. 72 שעות לאחר הקמת התרבית, הוסיפו לבקבוק ליטר אחד של מצע טרי, כך שיתקבל נפח כולל של שלושה ליטרים של תרחיף תאים.לאחר 24 שעות, קצור את תאי הסספנסיות בנפח של 10⁶ באמצעות סבוב (centrifugation) למשך עשר דקות ב-500 ×g בטמפרטורת החדר. השלף את הנוזל העליון (supernatant) וסספנד מחדש את המשקע ב-150 milliliters של מצע גידול באמצעות פיפוט מעלה ומטה כחשמונה עד עשר פעמים. העבר את התאים לבקבוק אחסון של 250 milliliters המצויד במגנט ערבוב סטרילי.לאחר מכן, בצעו זיהום משותף של התאים באמצעות הליזאט ממעבר שלישי ושני יחידות טרנספורמציה של וירוס עזר לכל תא. כאן מספר התאים הכולל הוא כ-9×10⁸ תאים, ולפיכך, מתווספות 1.8×10⁹ יחידות טרנספורמציה. ערבבו את תערובת התאים והוירוס בעזרת בוחש מגנטי בתוך אינקובטור לתרביות רקמה למשך שעתיים במהירות של 60 RPM.יש לוודא שבקבוק האחסון אינו סגור לחלוטין כדי לאפשר סירקולציה של אוויר. שעתיים לאחר ההדבקה, העבירו את הנפח הכולל של תערובת התאים והנגיף בחזרה אל בקבוק תרבית ה-spinner בנפח של שלושה ליטרים. הוסיפו 1850 milliliters של מצע טרי ומחומם מראש, והדגירו באינקובטור לתרביות רקמה למשך 48 שעות ב-70 RPM.לאחר 48 שעות, העבירו את תרחיף התאי-וירוס למבחנות צנטריפוגה של 500 milliliter. לאחר מכן, סבבו בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-890 ×g בטמפרטורת החדר. הסירו את המצע והשעיו שוב את התאים שהשקיעו בנפח כולל של 28 milliliters של DPBS.יש לאחסן את ת сусפנזיית התאיים המודבקים בנגיף בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד למועד טהרת הנגיף. כדי להכין את הליזאט הנגיפי לטיהור במעבר של צסיום כלוריד, יש להקפיא ולהפשיר את סוספנזיית התאיים המודבקים בנגיף ארבע פעמים. לאחר מכן, יש לצנטריפוג את הליזאט הנגיפי ב-500 ×g למשך שמונה דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, אספו את העלייה המכילה את האדנו-וירוס בעל הקיבולת הגבוהה. העבירו בפיפטה בזהירות ובאיטיות תמיסות צסיום כלוריד למבחנות לפי הסדר הבא: 0.5 milliliters של תמיסה בריכוז 1.5 grams per cubic centimeter, שלושה milliliters של תמיסה בריכוז 1.35 grams per cubic centimeter ו-3.5 milliliters של תמיסה בריכוז 1.25 grams per cubic centimeter. הוסיפו מעל שכבת ה-1.25 grams per cubic centimeter כ-4.5 milliliters של העלייה המזוקקת של הווקטור.סבב את המדרגות במערכת אולטרה-צנטריפוגה באמצעות רטור swing-out בטמפרטורה של 12 degrees Celsius למשך שעתיים לפחות ב-226, 000 times g, כדי להפריד את החלקיקים הוויראליים המכילים גנום של adenovirus בעל קיבולת גבוהה מחלקיקים ריקים ומשאריות תאים. לאחר הסבב, נוצר פס מפוזר של שאריות תאים בחלק העליון של המבחנות. מתחתיו, ניתן להבחין בשני פסים לבנים.הפס העליון מכיל חלקיקים ריקים, בעוד שהפס התחתון הוא האדנווירוס בעל קיבולת גבוהה. הסירו בזהירות את השכבות של פסולת התאים והחלקיקים הריקים. לאחר מכן, אספו מיליליטר אחד מהפסים התחתונים מכל מבחנה.העבירו את הנגיף למבחנה סטרילית של 50 milliliter. הוסיפו עד 24 milliliters של תמיסת cesium chloride בריכוז 1.35 grams per cubic centimeter לחלקיקי הנגיף שנאספו וערבבו בזהירות. מלאו את מבחנות הצנטריפוגה עד למעלה בתמיסת נגיף של cesium chloride בריכוז 1.35 grams per cubic centimeter.לאחר מכן, סבבו במרכזפוגה למשך לילה ב-226,000 ×g בטמפרטורה של 12 °C באולטרה-צנטריפוגה עם רוטור מסוג swing out, תוך שימוש בהאצה והאטה איטיות. הסירו את השכבות העליונות מהחלק העליון באמצעות פיפטה. לאחר מכן, אספו את האדנווירוסים בעלי הקיבולת הגבוהה הנמצאים בפס התחתון הבולט באמצעות טיפ של פיפטה חדשה.לבסוף, בצעו דיאליזה לחלקיקי הווירוס שנאספו לצורך החלפת חוצץ (buffer exchange). לאחר מכן, קבעו את הריכוז (titer) של התכשיר הסופי בהתאם להוראות המפורטות בפרוטוקול הכתוב. היסטוגרמה זו מציגה מספרים מוחלטים של חלקיקים עבור תכשיר וקטור בודד כפי שנקבעו באמצעות שלוש שיטות שונות: ריכוז OD שנמדד באמצעות צפיפות אופטית, ריכוז זיהומים וזיהום של וירוס עזר (helper virus) שנמדדו באמצעות qPCR.כאן מוצג היחס בין סך חלקיקי האדנו-וירוס הזיהומיים בעלי הקיבולת הגבוהה לבין רמות זיהום הווירוס העזר שנמדדו באמצעות qPCR. אם וקטור שלך מכיל גן מסמן פלואורסצנטי, ניתן לבצע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לנטר את ההגברה המוקדמת של הווקטור ולאפיין את יכולת ההדבקה של תכשיר הווקטור הסופי. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הייצור של אדנו-וירוסים בעלי קיבולת גבוהה עם מחיקה גנטית.במיוחד כיצד להחדיר את הגן התחליפי שלך וכיצד להגביר ולטהר את הווקטורים.

cloning-large-scale-production-high-capacity-adenoviral-vectors-based

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors 

ב-15 השנים האחרונות, וקטורים שמקורם באדנווירוס כלבים מסוג 2 (CAV2) הוכיחו את יעילותם בהתמרת תאים במבחנה וב-vivo ונמצאים בשימוש נרחב לחיסון וריפוי גנטי. כאן, אנו מתארים הליך לבנייה, ייצור וטיהור של וקטורי CAV2, מה שמוליד תרחיפים נגיפיים בעלי טיטר גבוה.

ייצור וטיהור של וקטורים שמקורם באדנווירוס כלבים מסוג 2 שאינם משוכפלים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצור וקטור הוכחה של עיקרון סוג אדנווירוס דו הערכי 5 (Ad5) Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 על ידי ניצול אסטרטגית Antigen capsid על-ההתאגדות. וקטור זה הודגם להפגין כושר איכותי, היכולת להימלט סרה Ad5 חיובית במבחנה, וantigenicity כמו גם חיסונית לאנטיגנים המשולבים.

ניצול capsid על-התאגדות האסטרטגיה Antigen לפיתוח גישות Adenovirus סרוטיפ 5-וקטורי חיסון

כאן, אנו מתארים אסטרטגיית לשחזור ויעילה כדי לייצר כייל נוגדנים, בקרת איכות קבוצות של וקטורים adeno-הקשורים וירוס. היא מאפשרת למשתמש לקבל הכנה וקטור עם כייל גבוה (≥1 x 1013 וקטור הגנום/mL) ואת טוהר גבוהה, מוכן לשימוש במבחנה או ויוו .

הפקה, טיהור, ובקרת איכות על Adeno-הקשורים וקטורים מבוסס-וירוס

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור אדנווירוס באמצעות מערכת pAdEasy. הטכנולוגיה כוללת שילוב מחדש של pAdTrack ו pAdEasy-1 פלסמידים, האריזה וההגברה אדנווירוס, טיהור של חלקיקים אדנו-ויראליים מן מדיום lysate ותרבות התא, titration ויראלי, ואת הבדיקה הפונקציונלית של אדנווירוס.

שיטה יעילה לייצור אדנווירוס

כאן אנו מספקים הליך מפורט לייצור בקנה מידה גדול של וקטורים AAV ברמה מחקרית באמצעות תאי HEK 293 דבקים הגדלים בערימות תאים וטיהור כרומטוגרפיה של זיקה. פרוטוקול זה מניב באופן עקבי &gt;1 x 1013 גנומים וקטוריים /mL, ומספק כמויות וקטוריות המתאימות למחקרים גדולים בבעלי חיים.

ייצור וקטורים הקשורים אדנו וירוס בערימות תאים למחקרים פרה קליניים במודלים בעלי חיים גדולים

כאן מוצג פרוטוקול ייצור AAV מבוסס תאי HEK293 מתלה, וכתוצאה מכך זמן ועבודה מופחתים הדרושים לייצור וקטורי באמצעות רכיבים הזמינים למטרות מחקר מספקים מסחריים.

ייצור אצוות וקטוריות משויכות אדנו בעלות תפוקה גבוהה באמצעות תאי תרחיף HEK293

ככל שתחום הריפוי הגנטי ממשיך להתפתח, יש צורך הולך וגובר בשיטות חדשניות שיכולות להתמודד עם אתגרים אלה. כאן מוצגת שיטה ייחודית, המייעלת את תהליך יצירת וקטורי AAV בעלי תפוקה גבוהה וטוהר גבוה באמצעות פלטפורמה של מפעל תאים, העומדים בתקני האיכות למחקרי in vivo .

הליך יעיל וסטנדרטי ליצירת וקטורי וירוסים הקשורים באדנו באיכות גבוהה ובאיכות גבוהה תוך שימוש בפלטפורמת מפעל תאים

למרות תכונות מכניות ביוכימי הבולטים של משי עכביש, חומר זה לא ניתן לקצור בכמויות גדולות באמצעים קונבנציונליים. כאן אנו מתארים אסטרטגיה יעילה לטוות קורי עכביש מלאכותיים סיבי, שהוא תהליך חשוב עבור החוקרים הלומדים ייצור עכביש המשי ואת השימוש בהם הדור הבא של biomaterials.

ייצור סינתטי קורי עכביש בקנה מידה מעבדה

אלקטרודות יון סלקטיבית כל מצב מוצק (ASSISEs) הבנויות ממתמר פולימר מוליך (CP) לספק כמה חודשים של חיים תפקודי בתקשורת נוזלית. כאן, אנו מתארים את תהליך הייצור וכיול של ASSISEs בפורמט מעבדה על שבב. ASSISE הוא הוכיח ששמר על פרופיל מדרון קרוב Nernstian לאחר אחסון ממושך בתקשורת הביולוגית מורכבת.

Biochip Multi-אנליטי (MAB) על בסיס אלקטרודות יון-All-סלקטיבית של מצב מוצק (ASSISE) למחקר הפיזיולוגי

למד לייצר וקטורים אדנובירליים בקיבולת גבוהה לטיפול גני באמצעות שיבוט וקנה מידה גדולה. שיטה זו מאפשרת העברת עד 35 קילו-בסיסים של DNA זר לתיקון גנים או הוספתם במחלות תורשתיות.

ייצור שיבוט וקנה מידה גדולה של וקטורי adenoviral בקיבולת גבוהה המבוססים על סוג Adenovirus האדם 5

גלה סרטונים נוספים