ייצור שיבוט וקנה מידה גדולה של וקטורי adenoviral בקיבולת גבוהה המבוססים על סוג Adenovirus האדם 5

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר וקטור אדנו-ויראלי בעל קיבולת גבוהה שנמחק על ידי גנים לאספקה וביטוי של טרנסגנים טיפוליים בתאים חיים או אורגניזמים. שיטה זו יכולה לעזור לתחום הריפוי הגנטי לספק גנים טרנס גדולים שאינם מתאימים לווקטורים נגיפיים אחרים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאדנו-וירוסים בעלי קיבולת גבוהה נטולי גנים נגיפיים.

באמצעות וקטורים אלה ניתן להעביר עד 35 קילו-בייט של דנ"א זר. היישום של טכניקה זו משתרע על הטיפול שלנו במחלות תורשתיות מכיוון שהיא עוזרת לספק מיזמים טיפוליים לתיקון גנים או הוספת גנים. שיטה זו מספקת כלי מתקדם להעברה ביולוגית של טרנסגנים טיפוליים וניתן ליישם אותה בתרבית תאים כמו גם באורגניזמים חיים.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא חיונית מכיוון שהגברה וקטורית וטיהור וקטור דורשים ניסיון מסוים. צריך מגע נכון במהלך טיהור וקטור. בדוק ציון של אחד מכל עשרה פלסמיד ביטוי גנום אדנו-וירוס ליניארי מדולל בעל קיבולת גבוהה על ידי אלקטרופרזיס ג'ל.

יש לזהות שבר של תשעה קילו-בסיס עבור עמוד השדרה של הפלסמיד pAd-FTC ושבר DNA שני, 28 עד 36 קילו-בסיס עבור גנום אדנו-וירוס בעל קיבולת גבוהה, בתוספת גן מעניין. לאחר מכן, העבירו צלחת של 60 מילומטר של תא אחד אחד שישה במפגש של 50 עד 80% עם חמישה מיקרוגרם של גנום אדנו-וירוס בעל קיבולת גבוהה, על פי נהלים סטנדרטיים. 16 עד 18 שעות לאחר הטרנספקציה, הסר בזהירות את המדיום והוסף שלושה מיליליטר של מדיום טרי.

לאחר מכן, הדביקו את התאים בנגיף העוזר AdNG 163R2, תוך שימוש בחמש יחידות התמרה לכל תא. דגירה בחממת תרביות רקמה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. ומערבבים את הצלחת כל 20 דקות במהלך השעה הראשונה של הדגירה כדי להפיץ באופן שווה את הנגיף המסייע לכל התאים.

48 שעות לאחר ההדבקה, קצרו את התאים על ידי שטיפתם מצלחת התרבית באמצעות מדיום התרבית. שמור 0.5 מיליליטר של תאי אפס המעבר לבידוד DNA גנומי. לאחר מכן, הקפיאו/הפשירו שוב ושוב 2.5 מיליליטר של תאי אפס מעבר על ידי טבילה בחנקן נוזלי.

או לשים את התאים במקפיא שלילי של 80 מעלות צלזיוס ואז להעביר לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס 3 עד 4 פעמים. מערבבים את 2.5 מיליליטר הליזאט עם מיליליטר אחד של מדיום טרי ומוסיפים וירוס עוזר בשתי יחידות טרנספורמציה לכל תא. שאפו את המדיה מצלחת של 60 מילימטר של תא אחד אחד שישה במפגש של 90 עד 95% והוסיפו את התערובת הנגיפית לתאים.

דגרו על התאים למשך 48 שעות כמו קודם. לאחר מכן, קצרו את התאים וחזרו על הליכי ההקפאה/הפשרה והזיהום פעמיים כדי להשיג ליזטים של מעבר אחד ומעבר שני. לאחר קבלת שני ליזאטים, ערבבו את 2.5 מיליליטר הליזאט עם 17.5 מיליליטר של מדיה טרייה והוסיפו שתי יחידות טרנספורמציה לכל תא של וירוס עוזר.

שאפו את המדיה מצלחת 150 מילימטר של 80 עד 100% של תא אחד אחד שישה והדביקו את התאים בתערובת הנגיפית. 48 שעות לאחר ההדבקה, קצרו את המעבר שלוש ליזאט באמצעות ההליך שהוצג זה עתה. כדי להתחיל בשלב זה, הוסף 900 מיליליטר של מדיה מחוממת מראש לבקבוק תרבית ספינר של שלושה ליטר.

הסר את המדיה מלפחות 10 צלחות, 150 מילימטר של תא אחד, שישה תאים במפגש של 90 עד 100%. ולשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של מדיה טרייה ומחוממת מראש. פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לקבל תרחיף תאים הומוגני.

ואז להעביר את התאים ישירות לבקבוק הספינר. דגרו את בקבוק הספינר על מערבל מגנטי בחממת תרבית רקמות למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. כוונן את המערבל המגנטי ל-70 סל"ד כדי למנוע הצמדת תאים למשטחי הזכוכית.

24 שעות לאחר הקמת בקבוק תרבית הספינר, הוסף 500 מיליליטר מדיה טרייה. חזור על שלב זה שוב לאחר 24 שעות נוספות. 72 שעות לאחר הקמת התרבית, הוסף ליטר אחד של מדיה טרייה לבקבוק, וכתוצאה מכך נפח כולל של שלושה ליטר תרחיף תאים.

24 שעות לאחר מכן, קצרו את אחד שישה תאי ההשעיה על ידי צנטריפוגה למשך עשר דקות ב -500 פעמים גרם בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הכדור ב-150 מיליליטר של מדיה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה כשמונה עד עשר פעמים. העבירו את התאים לבקבוק אחסון של 250 מיליליטר המצויד במוט ערבוב מגנטי סטרילי.

לאחר מכן, הדביקו את התאים במעבר של שלוש יחידות ליזאט ושתי יחידות טרנספורמציה של וירוס עוזר לכל תא. כאן מספר התאים הכולל הוא בערך תשע כפול עשר לתאים השמינית, לכן מתווספות נקודה אחת שמונה כפול עשר לתשיעית יחידות הטרנספורמציה. מערבבים את תערובת נגיף התאים על מערבל מגנטי בחממת תרבית הרקמה למשך שעתיים ב-60 סל"ד.

ודא שבקבוק האחסון אינו סגור לחלוטין כדי לאפשר זרימת אוויר. שעתיים לאחר ההדבקה, העבירו את הנפח הכולל של תערובת נגיף התאים בחזרה לבקבוק תרבית הספינר של שלושה ליטר. הוסף 1850 מיליליטר של מדיה טרייה ומחוממת מראש ודגירה בחממת תרבית הרקמה למשך 48 שעות ב-70 סל"ד.

לאחר 48 שעות, העבירו את תרחיף נגיף התא לצינורות צנטריפוגה של 500 מיליליטר. ואז, צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 890 פעמים גרם בטמפרטורת החדר. הסר את המדיום והשהה מחדש את התאים הגלולים בנפח כולל של 28 מיליליטר DPBS.

אחסן את תרחיף וירוס התא בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן לטיהור הנגיף. כדי להכין את הליזאט הנגיפי לטיהור שיפוע צזיום כלוריד, הקפיאו/הפשירו את תרחיף נגיף התא ארבע פעמים. לאחר מכן, צנטריפוגה את הליזאט הנגיפי ב -500 פעמים גרם למשך שמונה דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, אספו את הסופרנטנט המכיל את האדנו-וירוס בעל הקיבולת הגבוהה. הכניסו בזהירות ובאיטיות תמיסות צזיום כלוריד לצינורות בסדר הבא, 0.5 מיליליטר של 1.5 גרם לתמיסת סנטימטר מעוקב, שלושה מיליליטר של תמיסת 1.35 גרם לסנטימטר מעוקב ו -3.5 מיליליטר של 1.25 גרם לתמיסת סנטימטר מעוקב. שכבו כ-4.5 מיליליטר של סופרנטנט וקטורי מנוקה על גבי שכבת 1.25 גרם לסנטימטר מעוקב.

צנטריפוגה את השיפועים באולטרה-צנטריפוגה באמצעות רוטור מתנדנד החוצה ב-12 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות ב-226,000 פעמים גרם כדי להפריד את גנום אדנו-וירוס בעל הקיבולת הגבוהה המכיל חלקיקים נגיפיים מחלקיקים ריקים ופסולת תאים. לאחר הצנטריפוגה נוצרת רצועה מפוזרת של פסולת תאים על גבי הצינורות. מתחת לכך ניתן להבחין בשתי רצועות לבנות.

הרצועה העליונה מכילה חלקיקים ריקים, ואילו הרצועה התחתונה היא אדנו-וירוס בעל קיבולת גבוהה. הסר בזהירות את שכבות פסולת התאים והחלקיקים הריקים. לאחר מכן, אסוף מיליליטר אחד מהרצועות התחתונות מכל צינור.

העבירו את הנגיף לצינור סטרילי של 50 מיליליטר. הוסף עד 24 מיליליטר של 1.35 גרם לסנטימטר מעוקב תמיסת צזיום כלוריד לחלקיקי הנגיף שנאספו וערבב בזהירות. מלאו את צינורות הצנטריפוגה למעלה בתמיסת נגיף צזיום כלוריד של 1.35 גרם לסמ"ק.

לאחר מכן צנטריפוגה למשך הלילה ב-226, 000 פעמים גרם ב-12 מעלות צלזיוס באולטרה-צנטריפוגה באמצעות רוטור מתנדנד החוצה עם האצה והאטה איטית. הסר את השכבות העליונות מלמעלה בעזרת פיפטה. לאחר מכן, אסוף את האדנו-וירוס בעל הקיבולת הגבוהה הקיים ברצועה התחתונה הבולטת באמצעות קצה פיפטה טרי.

לבסוף, דיאליזה של חלקיקי הנגיף שנאספו להחלפת חוצץ. ואז, טיטר את ההכנה הסופית על פי ההוראות המפורטות בפרוטוקול הכתוב. היסטוגרמה זו מציגה מספרים מוחלטים של חלקיקים עבור תכשיר וקטור יחיד כפי שנקבע בשלוש שיטות שונות, טיטר OD הנמדד על ידי צפיפות אופטית, טיטר זיהומים וזיהום וירוס עוזר הנמדד על ידי qPCR.

היחס בין סך חלקיקי האדנווירוס המדבקים בעלי הקיבולת הגבוהה לבין רמות הזיהום של נגיף העזר שנמדדו על ידי qPCR מוצג כאן. אם קיים גן סמן פלואורסצנטי בווקטור שלך, ניתן לבצע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לנטר את ההגברה המוקדמת של הווקטור ולאפיין את ההדבקה של הכנת הווקטור הסופית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר אדנו-וירוסים שנמחקו בגנים ובעלי קיבולת גבוהה.

במיוחד איך להכניס את הטרנסגן שלך ואיך להגביר ולטהר את הווקטורים.