דור של, Nanocomposites יחס Scalable מתכתי גבוהה היבט בביולוגי נוזלי בינוני

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לייצר קומפוזיטים של מיקרו וננו בעלי יחס גובה-רוחב גבוה וליניאריים, תוך שימוש בחומרי מוצא המכילים נחושת ובציסטאין. דבר זה מושג תחילה על ידי שילוב של ננו-חלקיקי נחושת שעברו סוניקציה או נחושת גסולפט עם ציסטין ומים בתוך בקבוק תרבית סטרילי ומאוורר. השלב השני של הסינתזה הוא הנחת הבקבוק עם הרכיבים המשולבים באינקובטור עם 5%CO2 בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך שש שעות לפחות.

בשלב הבא, הבקבוק נבחן בעין ובמיקרוסקופיה באור לבן. כדי לקבוע את מידת היווצרות המבנה הליניארי, השלב הסופי הוא סיום הסינתזה על ידי הנחת בקבוק הסינתזה במקרר המוחזק בטמפרטורה של 4 °C. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה דיגיטלית כדי לאפיין את המבנים המסונתזים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שיקוע אלקטרודי, הוא שניתן להגדיל בקלות את קנה המידה של הסינתזה המתוארת בצורה נוזלית, והתהליך מתרחש בתנאים פיזיולוגיים.

ההשלכות של טכניקה זו חולשות לכיוון של טיפול או אבחון של מחלות כגון סרטן, מכיוון שמבנים מסונתזים יכולים להתפרק על ידי תאים, ובכך לספק פוטנציאלית אמצעי להובלת תרופות. הרעיון לשיטה זו עלה לי לראשונה כאשר ביצענו ניסויים לבחינת הרעילות הפוטנציאלית של ננו-חומרים שונים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן את שלבי הסינתזה הסופיים עשוי להיות קשה ללמוד.

נהלים שגויים עלולים להוביל להיווצרות של מבנים מצומקים או לאי-היווצרות של מבנים כלל. כדי לבצע את סינתזת ההרכבה העצמית באמצעות ננו-חלקיקי נחושת או CMPs, הכין תמיסה של ננו-חלקיקי נחושת על ידי שקילה של לפחות two milligrams של CMPs. הרכב כפפות חד-פעמיות במהלך שלב זה כדי למנוע מגע אפשרי של ה-CMPs עם העור.

העבירו את הננו-חלקיקים מבקבוקון זכוכית סטרילי ריק בנפח 16 מיליליטר לבקבוקון המכיל CMPs. הוסיפו מים סטריליים דה-יוניים בנפח המתאים כדי להכין תמיסה בריכוז של 2 mg/mL, וערבלו את התמיסה במערבל וורטקס למשך 20 שניות כדי להבטיח פיזור של הננו-חלקיקים לפני תחילת הסינתזה. אין למלא את הבקבוקון ביותר מחצית מהנפח במים, שכן הדבר יעכב את התהליך.

בעת ערבוב באמצעות וורטקס, ה-CMPs ישקעו במהירות לתחתית המבחנה וצבען יהיה כהה. בצע סוניקציה לתמיסת ה-CNP למשך 17 דקות בטמפרטורת החדר כדי להשיג דיספרסיה מקסימלית של ה-CMPs לפני תחילת הסינתזה. בדוק מדי פעם כדי לוודא שביצוע הסוניקציה גורם לערבוב של ה-CMPs; לאחר סוניקציה מוצלחת, ה-CMPs נשארים תלויים בתמיסה למשך 30 דקות לפחות, והתמיסה תהיה בעלת צבע כהה.

שקלו 7.29 milligrams של cystine לצורך הסינתזה. מכיוון ש-cystine אינו ממיס ישירות במים, העבירו את ה-cystine שנשקל לכלי שקילה אנטי-סטטי המכיל cysteine. הוסיפו נפח מספיק של sodium hydroxide סטרילי בריכוז one molar כך שה-cystine ימוס לחלוטין להכנת תמיסה בריכוז 72.9 milligram per milliliter.

המס את הציסטאין באופן מלא ב-100 µL של נתרן הידרוקסיד בריכוז 1 M. לאחר מכן, ערבב 7 µL של הציסטאין המומס עם 6,643 µL של מים סטריליים בבקבוק סינתזה סטרילי. הנח את הבקבוק עם התמיסו המשולב באינקובטור למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 °C, כאשר פקק הבקבוק פתוח חלקית כדי לאפשר ערבוב יעיל.

זהו יהיה תמיסת העבודה של הציסטאין. יש לערבב מחדש את תמיסת ה-CNP בריכוז של 2 mg/mL באמצעות וורטקס למשך 30 שניות, מכיוון שה-CMPs ישקעו לאחר שלב הסוניקציה עבור נפח סינתזה כולל של 7 mL. העבירו את תמיסת העבודה של הציסטאין לבקבוק תרבית תאים של 25 cm² והוסיפו 350 µL של CMPs שעורבבו מחדש.

החזירו את הפקק לבקבוק והדקו אותו כך שיהיה מאובטח. לאחר שילוב כל רכיבי הסינתזה, ערבבו בעדינות בתוך הבקבוק על ידי סיבוב של ארבע עד חמש פעמים. הניחו את הבקבוק באינקובטור פחמן דו-חמצני ואווררו את הבקבוק על ידי שחרור הפקק כדי לאפשר חילוף גזים לתוך הבקבוק וממנו.

במהלך הסינתזה, יש להשאיר את התהליך באינקובטור למשך כ-24 שעות. במהלך הסינתזה, ניתן להבחין באמצעות מיקרוסקופ ובעין בנקודות השלב של היווצרות קומפוזיטים לינאריים מאוד. שלב זה הוא קריטי כדי להבטיח שחלק מהמבנים נוצרים ושתהליך ההרכוב העצמי אינו נמשך זמן רב מדי.

סיימו את הסינתזה של הביוקומפוזיטים ברגע שנצפו מבנים ליניאריים בבקבוק על ידי סגירה הרמטית של בקבוק הסינתזה, סמנו את הבקבוק עם תנאי הסינתזה, כולל תאריך ביצוע הסינתזה והאינקובציה, ומשך זמן הסינתזה לפני הסיום. לאחר מכן, אחסנו את הכלי במקרר, שכן המבנים שנוצרו נותרים יציבים בצורה זו למשך שנה לפחות. לחלופין, כדי לבצע את סינתזת ההרכבה העצמית באמצעות נחושת גופיתית, החליפו את ה-CMPs במלח נחושת גופיתית תוך שימוש בטכניקה סטרילית, והמיסו לפחות 2 mg של נחושת גופיתית בנפח מספיק של מים דה-יוניים סטריליים כדי להכין תמיסה בריכוז של 2 mg/mL.

גבישי נחושת(II) סולפט נמסים בקלות בתמיסה בריכוז זה, אך יש לערבל את המבחנה ב-vortex במידת הצורך ולבדוק בעין שכל הגבישים נמסו לאחר הכנת נחושת(II) הסולפט. בצע את הסינתזה כפי שהודגם זה עתה, אך החלף את ה-CMPs בנחושת(II) סולפט. אפיין ביו-קומפוזיטים שהופקו מ-CMPs ומנחושת(II) סולפט באמצעות מיקרוסקופיה באור לבן ומיקרוסקופיה אלקטרונית לצורך אפיון ובדיקה של הביו-קומפוזיטים.

בבדיקת פרא-סינתזה באמצעות מיקרוסקופיית אור לבן, השתמש במיקרוסקופ הפוך. הקומפוזיטים ישקעו למשטח התחתון של הבקבוק תוך מספר דקות מהנחת הבקבוק במצב מאוזן, ולאחר מכן ניתן יהיה להביאם למיקוד. השתמש בהגדרת השדה המואר (bright field) במיקרוסקופ כדי למקסם את הניגודיות בין הביו-קומפוזיטים לבין התווך הנוזלי; קומפוזיטים שנגזרו מ-CMPs ומנחושת גסולפט ייראו שקופים עד עכורים בצבעם, אך אגרגטים של CNP שלא הגיבו ייראו ככהים מאוד.

השתמשו במיקרוסקופיה של אור לבן עם מיסוף הפוך כדי להעריך את יעילות הסינתזה עבור ניסוי נתון. לדוגמה, תיעדו את נוכחותם או היעדרם של CMPs שאינם תגובתיים בסינתזה. בקבוקים ששימשו להכנת ביו-קומפוזיטים המופקים מ-CNP מבקבוקים בעלי פרמטרים שונים, כגון זמן דגירה או משך סוניקציה.

חלקיקי CMP בודדים קטנים מכדי שניתן יהיה לצפות בהם באמצעות מיקרוסקופ אור, אך אגרגטים של CNP שאינם תגובתיים יופיעו כאובייקטים כהים בעלי צורה עגולה. זאת בניגוד לקומפוזיטים של CNP שסונתזו בהצלחה, אשר יהיו בעלי יחס גובה-רוחב גבוה, צורה ליניארית ומגוון של אורכים שונים. הימנעו מביצוע הסינתזה למשך פרק זמן ממושך מדי לפני הסיומה, שכן הדבר יוביל למבנים מסוג קיפוד בעלי הסתעפות רבה, אשר קשה לפזר למבנים בודדים לאחר שנוצרו.

השתמשו גם במיקרוסקופיית אור לבן הפוכה כדי להעריך את יעילות הסינתזה עבור ניסוי נתון המשתמש בנחושת גופיתית (copper sulfate). כיוון שנחושת גופיתית נמסה באופן מלא בתמיסה, בשימוש בפרוטוקול זה, התמיסה תיראה פחות כהה מהתמיסה שהתקבלה מהסינתזה. בשימוש ב-CMPs.

תעדו את הגודל וההיקף של תרכובות נחושת גופית על ידי השוואת בקבוקים עם תנאי סינתזה שונים, כגון משך הסינתזה לפני הסיומה. כדי לרכז תחילה את התרכובות הביולוגיות לאחר הסינתזה, הוסיפו ששה מיליליטרים של מבנים נגזרים מ-CNP או מבנים נגזרים מנחושת גופית לשפופרת צנטריפוגה של 15 מיליליטר. צנטריפוגו למשך 10 דקות ב-500 ×g ובטמפרטורת החדר כדי ליצור משקע עבור נפחים קטנים יותר.

הוסיפו 500 µL של המבנים בתמיסה למבחנות בנפח 0.6 ml, צנטריפגו ב-2000 ×g ובטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לפחות כדי להוות משקע (pellet). העבירו את המבנים למים דה-יוניים סטריליים ובצעו סוניקציה למשך 10 דקות לפחות כדי להחזירם לתמיסה. באמצעות תהליך זה לאורך זמן, המבנים הופכים למקוטעים ואורכם הממוצע קטן.

תיעוד השינויים בגדלי הקומפוזיטים בזמני סוניקציה שונים באמצעות מיקרוסקופ אור לבן הפוך ומצלמה דיגיטלית מציג את התוצאות המייצגות שלנו; מגילוי ביו-קומפוזיטים במדיום תרבית תאים לאורך 82 שעות, פיזורים ראשוניים אחידים של CMPs מצטברים למבנים מיקרוסקופיים. עם הזמן, חלקיקים מתפנים ואגריגטים גדולים יותר נוצרים. לבסוף, מופיעים אגריגטים גדולים יותר בעלי מבנים ליניאריים היוצרים מבנים דמויי קיפוד.

מוצג תהליך הטרנספורמציה של CMPs לביו-קומפוזיטים לינאריים. CMPs שולבו עם ציסטאין ומים מתוך דਿਸפרסיות ראשוניות אחידות של CMPs. אגרגטים יוצרים מיקרו-מבנים לאחר שלוש שעות, ומבנים ביניים נוצרים עד לשש שעות.

מבנים בעלי יחס היבט גבוה נוצרים במיקרוסקופיה אלקטרונית. אפיון של ביו-קומפוזיטים מסונתזים מוצג במיקרוסקופיה אלקטרונית חודרת (TEM), המראה את חומר המוצא CNP עם קומפוזיטים ליניאריים היווצרים; CMPs התחלתיים הם עגולים, כפי שמוצג במיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת או SEM. מאפיינים ננו-מיקרוסקופיים של קומפוזיטים שנוצרו מ-CMPs וציסטאין מוצגים באמצעות SEM.

מאפיינים של קומפוזיטים שנוצרו מנחושת גופית וציסטאין מוצגים גם באמצעות SEM Energy dispersive. מוצג ניתוח אלמנטרי באמצעות ספקטרוסקופיית קרני X של חומרי המוצא והרכיבים הליניאריים המסונתזים. CMPs התחלתיים מראים שיא בולט של נחושת ללא גופרית.

ביוקומפוזיטים מ-CMPs וציסטין מראים הופעה של פסגות גופרית ופחמן עקב שימוש בציסטין כנקודת התחלה של נחושת גופריתת. החומר מראה פסגות עבור נחושת וגופרית. ביוקומפוזיטים מנחושת גופריתת וציסטין מראים הופעה של פסגות פחמן עקב הציסטין. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך 12 עד 24 שעות, במידה והיא מבוצעת כראוי.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לעקוב אחר התקדמות הסינתזה הן בעין והן באמצעות מיקרוסקופ, כדי למנוע אגרגציה מרובה של המבנים המסנתזים. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון סימון פלואורסצנטי של המבנים, על מנת לענות על שאלות נוספות, למשל האם המבנים המסנתזים נקשרים לתאים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן הכנת הרכיבים לסינתזה, שילובם בצורה נכונה, מעקב אחר התקדמות הסינתזה, וריכוז ושינוי של המבנים לאחר הסינתזה.