Name: אינדוקציה ישירה של Hemogenic האנדותל ודם על ידי יתר של גורמי שעתוק בתאי גזע pluripotent האדם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-03T10:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: למד אינדוקציה ישירה של אנדותל המוגני ותאי דם מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות יתר של גורמי שעתוק. שיטה זו מאפשרת חקר מעבר אנדותלי-המטופואטי במעבדה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למאט ריימונד על עזרת העריכה. עבודה זו נתמכה על ידי כספים מהמכון הלאומי לבריאות (U01HL099773, R01HL116221 ו-P51 RR000167) וקרן שרלוט גייר.

1. הכנות וירוס וצירופי גורם שעתוק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות עם פלסמיד ביטוי lentiviral pSIN-EF1α מכיל DNA המקודדים חלבונים לETV2, GATA1, GATA2, TAL1 וLMO2 (טבלת 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הריכוז וטוהר הכנות פלסמיד המשמשות לייצור lentiviral על ידי הקלטת קליטת UV עם ספקטרופוטומטר ב 230 ננומטר, 260 ננומטר, ו -280 ננומטר. הערה: הכנות DNA A260 / 280 וA260 / 230 ערכי הוכחה גדולים יותר מאשר 1.8 נחשבים בדרך כלל באיכות טובה. A260 / 280 ערכים נמוכים עלולים להצביע על זיהום חלבון, בעוד A260 / 230 ערכים נמוכים מצביעים על זיהומים עם מלחים או כמה כגון פנול הממס. ריכוז פלסמיד מומלץ הוא 1-3 מיקרוגרם / μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצר lentiviruses לtransductions כפי שתואר בפרוטוקולים שפורסמו בעבר 11. אינדוקציה שלו עם פוטנציאל פאן-מיאלואידית דורשת שיתוף ביטוי של ETV2 וGATA1, או ETV2 וGATA2.אינדוקציה שלו עם פוטנציאל erythro- וmegakaryocytic דורשת GATA2 וTAL1. התוספת של LMO2 משפרת באופן משמעותי את התשואה של תאי erythro-megakaryocytic מhPSCs בנוכחות GATA2 וTAL1 10. </li></ol> 2. hPSCs תרבות פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאי גזע pluripotent במושבות הדוקות עם קצוות חדים לconfluency 70-80% לפני subculturing. מארק ולהסיר הבדיל מושבות באופן ספונטני לפני passaging תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל ג&#39;ל המסחרי תאי מטריצה ​​(ראה טבלה 2) על פי הוראות היצרן וצלחות מעיל 6-גם הלילה ב 4 ° C, או לפחות שעה אחת על 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. לפני passaging תאים, לשאוב את המטריצה, להוסיף 2 מיליליטר של culturemedium המלא המסחרי הטרי (ראה טבלה 2) ולשמור על צלחות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד התאים מוכנים לזריעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> hPSCs מעבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ASPIRAבינוני te מטוב אחד ומחוברות של 6-גם צלחת עם hPSCs ולהוסיף 1.5 מיליליטר של תמיסת Dispase השני מראש חימם (2 מ&quot;ג / מיליליטר בDMEM / F12, מעוקר על ידי סינון דרך 0.22 מיקרומטר מסננים). דגירה 5-7 דקות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד הקצוות של מושבות להתחיל להרים מהמשטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון לשאוב Dispase השני ובזהירות לשטוף את המושבות פעמיים על ידי הוספה ולאחר מכן aspirating 2 מיליליטר של מדיום DMEM / F12 הטרי. לאחר מכן, באמצעות פיפטה זכוכית סרולוגיות 5 מיליליטר, לנתק hPSCs עם 3 מיליליטר של מדיום תרבות השלמה מסחרי טרי (ראה טבלה 2) על ידי pipetting השעיה תא למעלה ולמטה מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מיליליטר של השעיה תא היטב בכל צלחת 6-היטב המכילה 1.5 מיליליטר של מדיום תרבות השלמה המסחרי (ראה טבלה 2). להתסיס את צלחת קדימה ואחורה וזכות מספר פעמים שמאלי כדי להבטיח חלוקת תא אחידה כאשר למקם את הצלחת לתוך החממה. שמור את התאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ל18-24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי היום הבינוני הבאה למדיום תרבות השלמה מסחרי טרי (ראה טבלה 2) ולבחון את מורפולוגיה hPSCs. תוצאות passaging מוצלחות במושבות קטנות, מצורפים היטב שמירת מורפולוגיה hPSC. hPSCs חייב להיות מוזן עם 2.5-3 מיליליטר freshmedium לכל גם על בסיס יומי וpassaged כל 4-5 ימים בלא יותר ממפגש 70-80%. הערה: אם hiPSCs נשמרו על fibroblasts העכבר העוברי (MEFs), הם צריכים להיות מועברים לתנאים ללא מזין וpassaged 2-3 פעמים לפני שהתמרה כדי להבטיח בידול יעיל. </li></ol></li></ol> 3. אינדוקציה של Hematoendothelial Pprecursors מhPSCs (יום 0, התמרה של hPSCs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום תגובה לשלב 1.3 מיליליטר של מדיום סרום ללא שלם מסחרי (ראה טבלה 2), וירוס, polybrene, ומעכב Y27632 ROCK (טבלת 1): להוסיף 1.3 μl של מעכבי ROCK 10 מ&quot;מ 1.3 מיליליטר בינוני עד Concentra סופיtion של 10 מיקרומטר, וpolybrene למיקרוגרם / מיליליטר ריכוז 6 סופי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף כמות מתאימה של תרכיז נגיפי (ים) בריכוז סופי של 0.5-1.0 משרד הפנים (ריבוי של זיהום) של כל וירוס לכל תא. שמור בינוני תגובה על קרח או על 4 מעלות צלזיוס עד ההשעיה התא הבודד מוכנה. הערה: אותו הסכום של משרד הפנים לכל וירוס בGATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1, ותערובות GATA2 / TAL1 / תגובת LMO2 הוא אופטימלית לאינדוקציה של בידול. תרבויות עם זאת, בETV2 / GATA2 transduced הכפלת משרד הפנים לGATA2, ביחס לETV2, משפרת בידול. לכן, לתרבויות אלה, יחס 1: 2 למשרד פנים של ETV2 ומשרד הפנים של 1 GATA2 מומלץ (למשל, אם להתרכז ויראלי מוערך בכ 6.8 x 10 7 מיליליטר / חלקיקים, להוסיף 10 μl של ETV2 ו -20 μl של תרכיזים נגיפיים GATA2 ל 0.68 x 10 6 תאים לכל תגובת ETV2 / GATA2 אחד בבאר 35 מ&quot;מ של צלחת 6-היטב). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן hPSCs בתליוני תא בודדיםension. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול hPSCs בתנאים ללא מזין כפי שתואר בסעיף 2. ביום 4 בעקבות המעבר האחרון, להתבונן צפיפות תאים ומורפולוגיה תחת מיקרוסקופ הפוכה. hPSCs צריך לגדול במושבות הדוקות עם קצוות חדים ללא התמיינות ספונטנית ולהגיע ~ confluency 60-70% ביום של התמרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני לשאוב, להוסיף 1.5-2 מיליליטר של מגיב תא דיסוציאציה המסחרי (טבלה 1) לכל היטב ולדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 5-7 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים לכמויות שווה של מדיום שלם מסחרי (ראה טבלה 2) עם 10 מיקרומטר של מעכבי ROCK, לספור את התאים ולקבוע את הכדאיות. תאים גלולה על ידי צנטריפוגה XG 200 במשך 5 דקות ולאחר מכן resuspend תאים בינוניים שלם מסחרי עם 10 מיקרומטר של מעכבי ROCK לריכוז של 3.4-5 x 10 6 תאים לכל מיליליטר. הערה: כדאיות תא היא קריטיות עבור התמרה ויראלי מוצלחת ובידול שלאחר מכן.בדרך כלל, כדאיות תא לפני התמרה יעלה על 90%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של ההשעיה התא, המכיל תאי .68-1 x10 6, ל1.3 מיליליטר של מדיום התגובה שהוכן ב3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון המטריצה ​​מצלחת 6-היטב מצופה הלילה הערוך 2.2., להעביר את תערובת התגובה לטובה אחד של צלחת 6-היטב ולהפיץ תאים באופן שווה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות לפחות 80% מהתאים צריכים להיות מחוברים למטריצה. </li></ol> 4. אינדוקציה של Hematoendothelial מבשרי מhPSCs (יום 1-7) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לאחר התמרה-, להסיר בינוני המכיל וירוס ולשטוף תאים מצורפים עם מדיום תרבות תא שלם מסחרי (ראה טבלה 1) ולאחר מכן להוסיף 3 מ&quot;ל לכל טוב של מדיום תרבות תא שלם מסחרי המכילים ציטוקינים hematopoietic: SCF 100 ng / ml, TPO 50 מיליליטר ng /, bFGF 20 ng / ml (להלן כ3F-בינוני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף בינוני מוחלט עם 3F-בינוני טרי בימים 2, 3 ויום 4 להסרת תאים מתים ופסולת. לאחר יום 4, כאשר תאי hematopoietic צפים הם מתעוררים, להחליף מחצית מ3F-הבינוני בכל יום אחר, תוך השמירה על הנפח הכולל ב 4 מיליליטר. הערה: פלסמידים ביטוי lentiviral pSIN-EF1α לשלב גן התנגדות puromycin ובכך לאפשר לסלקציה חיובית של תאי transduced. 1 מיקרוגרם / מיליליטר של puromycin ניתן להוסיף עד בינוני במהלך 1-2 הימים הראשונים של בידול לחסל את כל hPSCs מובחן שייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב מורפולוגיה תא ביום 4 תחת מיקרוסקופ הפוכה: אשכולות צפופים של תאים עם מורפולוגיה האנדותל טיפוסית מתחילים להופיע (2A דמויות, 3A). תאי דם עגולים מופיעים מיום 5 ליום 7 של בידול, ואילו באזורים מסוימים עשויים לשמור מורפולוגיה hPSCs. לנתח הוא ובידול hematopoietic כמתואר להלן. הערה: שונה hematoendothelial מוצלחiation תוצאות בייצור של תאי דם המופיעים תאים עגולים refractile כפי שצורף לתאי האנדותל שטוחים בסיס רופף. תאים אלה באופן פעיל להתרבות יוצרים אגרגטים קטנים, וסופו של דבר לנתק ולצוף (2A דמויות ו3A). תאי דם בשידור חי יכולים להיות מכובדים מבחינה ויזואלית מהתאים המתים וגוססים מבוססים על היכולת שלהם כדי לשקף את האור ולהרחיב בתנאי תרבות. </li></ol> 5. ניתוח של שלב האנדותל (HE) Hemogenic של בידול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי היווצרות HE בין ימים 3 ו -4 של בידול על ידי תצפית מיקרוסקופית של תאים עם מורפולוגיה האנדותל. אין תאי דם צפים בתרבות, בשלב זה של בידול. נוכחות שהוא יכול להיות מאושר על ידי צביעת immunofluorescent וזרימת ניתוח cytometric באמצעות נוגדני VE-cadherin, CD73, CD226 וCD43. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך היווצרותו על ידי תאי שימוש ניתוח התזרים cytometric ביום 3ויום 4 מניסוי אחד. איסוף תאים על ידי דוגרים של תרבויות עם מגיב תא דיסוציאציה מסחרי (ראה טבלה 1) למשך 5-10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ולאחר מכן להשתמש עד 1 x 10 5 תאים לכל תגובה מכתימה (cytometry זרימת ההליך מכתים המתוארים ב 12). הערה: VE-cadherin + HE תאים לרכוש ביטוי של CD226 סמן hematopoietic מוקדם, אבל חוסר הביטוי של CD73 וCD43 6. לעומת זאת, תאים שאינם HE להביע (2B דמויות, 3B) CD73. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכתים immunofluorescence כי הוא נגזר hPSC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את monolayer המצורף של תאים עם מי מלח פוספט (PBS) ולאחר מכן לתקן תאים בparaformaldehyde 4% 30-60 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את תאים שוב עם PBS ולאחר מכן Permeabilize באמצעות 0.1% Triton X-100 ב PBS במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים בPBS שני שלוש פעמים ולאחר מכן דגירה בחסימת מאגר בהיקף של PBS עם 10% בסרום שור עוברי (FBS), למשך 30 עד 120 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מכתים, המכיל את שני נוגדנים ראשוניים (1: 1,000 דילול) CD43 אנטי אנושי בעכבר וארנב אנטי אנושי VE-cadherin בPBS עם FBS 5%, (טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את מאגר החסימה מהתאים ולהוסיף 1 מיליליטר לכל טוב של חיץ מכתים עם הנוגדנים העיקריים הוסיפו; דגירה 3 שעות בטמפרטורת חדר, או הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים שלוש פעמים על ידי הוספת 2 מיליליטר של PBS עם 5% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ מכתים שני, המכיל נוגדנים משני בשעת 1: 500 דילול ב PBS עם 5% FBS: חמור נגד ארנב מצומדות עם צבע ירוק ניאון, ואנטי עכבר מצומדות עם צבע אדום ניאון (טבלת 1). הוסף 1 מיליליטר לכל טוב של חיץ מכתים המשני ודגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים עם PBS ללא סרום. תאי כתם עם 300 ננומטר DAPI עובד פתרון ב DH2 O במשך 10-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם PBS פעמיים ולהוסיף 2-3 מיליליטר של PBS לתוך היטב עם תאים מוכתמים. שים לב הקרינה עם מסנני מיקרוסקופ ירוקים, אדום וכחול. </li></ol></li></ol> 6. ניתוח של מבשרי Hematopoietic המושרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על תרבויות בידול עד תאים צפים להרחיב באופן משמעותי, עד 10-14 ימים, שינוי מחצית 3F-הבינוני, כפי שתוארו בסעיף 3.1, בכל יומיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק ולאסוף ההבחנה monolayers של תאים על ידי טיפול בתאים עם מגיב תא דיסוציאציה המסחרית (ראה טבלה 1) למשך 5-10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע cytometry זרימה באמצעות אנטי VE-cadherin-, נוגדני CD43 וCD45 להעריך hematopoiesis בתרבויות 12. שים לב שחלק גדול של תאים, עד 40% מתאי ETV2 וGATA2 transduced, שיתוף מבטא VE-CAD וCD43. הנוגדנים הבאים יכולים לשמש כדי לזהות שושלות תאים ספציפיות הבאים דוארxpansion או בידול של אבות דם מושרה: CD235a (תאי erythroid), CD41a (megakaryocytic), CD32 (כל סוגי תאי מיאלואידית), CD66b (נויטרופילים) וCD163 (מקרופאגים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע CFC-assay באמצעות מדיום מסחרי clonogenic (טבלת 1) על פי הוראות היצרן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 1-2 x 10 4 תאים לתוך 3 מיליליטר של מדיום clonogenic המסחרי (ראה טבלה 3) כדי להעריך את מספר תאי מושבה יוצרים וסוגים של מושבות hematopoietic. צפיפות זריעה אופטימלית מאפשרת זיהוי והבידוד של מושבות אחת שגדלות בנפרד זה מזה ואינו חופף. צפיפות זריעה עשויה להשתנות בין ניסויים בהתאם ליעילות בידול, אבל לא תעלה על 1 x 10 4 תאים לכל 1 מיליליטר של מדיום clonogenic המסחרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים תאים בינוניים clonogenic המסחרי על ידי vortexing העדין, ולהעביר 3 מיליליטר של השעיה לשני מנות של 35 מ&quot;מ מצורף נמוכות במיוחדעבור assay CFC, 1.5 מיליליטר של השעיה לכל מנה. להפיץ בינוני באופן שווה ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 14 יום. להימנע מלהפריע המנות; להתבונן הקמת מושבה ביום 7 ויום 10 של assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות ולספור מושבות hematopoietic לפי המורפולוגיות ביום 14. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Zape, J. P., Zovein, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemogenic+endothelium%3A+origins%2C+regulation%2C+and+implications+for+vascular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Hemogenic endothelium: origins, regulation, and implications for vascular biology.</a> Semin Cell Dev Biol. 22, 1036-1047 (2011).</li>
<li>Swiers, G., Rode, C., Azzoni, E., de Bruijn, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+history+of+hemogenic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells%2C+Mol+%26+Dis%22%5BJournal%5D)">A short history of hemogenic endothelium.</a> Blood Cells, Mol & Dis. 51, 206-212 (2013).</li>
<li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lymphocyte+potential+marks+the+emergence+of+definitive+hematopoietic+progenitors+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Rep. 2, 1722-1735 (2012).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+and+hematopoietic+cell+fate+of+human+embryonic+stem+cells+originates+from+primitive+endothelium+with+hemangioblastic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties.</a> Immunity. 21, 31-41 (2004).</li>
<li>Rafii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ESC-derived+hemogenic+endothelial+cells+undergo+distinct+waves+of+endothelial+to+hematopoietic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human ESC-derived hemogenic endothelial cells undergo distinct waves of endothelial to hematopoietic transition.</a> Blood. 121 (5), 770-780 (2012).</li>
<li>Choi, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+hemogenic+endothelial+progenitor+and+its+direct+precursor+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Rep. 2, 553-567 (2012).</li>
<li>Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukosialin+%28CD43%29+defines+hematopoietic+progenitors+in+human+embryonic+stem+cell+differentiation+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures.</a> Blood. 108, 2095-2105 (2006).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+inhibition+enhances+the+generation+of+hematopoietic+progenitors+from+human+ES+cell-derived+hemogenic+endothelial+cells+using+a+stepwise+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">TGFbeta inhibition enhances the generation of hematopoietic progenitors from human ES cell-derived hemogenic endothelial cells using a stepwise strategy.</a> Cell Res. 22, 194-207 (2012).</li>
<li>Uenishi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tenascin+C+promotes+hematoendothelial+development+and+T+lymphoid+commitment+from+human+pluripotent+stem+cells+in+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Tenascin C promotes hematoendothelial development and T lymphoid commitment from human pluripotent stem cells in chemically defined conditions.</a> Stem Cell Rep. 3, 1073-1084 (2014).</li>
<li>Elcheva, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+induction+of+haematoendothelial+programs+in+human+pluripotent+stem+cells+by+transcriptional+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators.</a> Nat Commun. 5, 4372(2014).</li>
<li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).</li>
<li>Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoendothelial+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 23, Unit 23.6(2007).</li>
<li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+gene-transfer+efficiency+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imgn+and+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells.</a> Mol Imgn and Biol. 12, 15-24 (2010).</li>
</ol>

IS היא בעל מניות מייסדים ויועץ לCynata.

השיטה מתוארת לעיל לבידול hematopoietic של hPSCs ידי ביטוי יתר של TFS, מייצגת גישה מהירה ויעילה לייצור הוא ואבות מיאלואידית וerytho-magakaryocytic מhESCs וiPSCs, ובכך לאפשר את ייצור תאי דם עד 30 מיליון מ תאי גזע pluripotent מיליון 10. שיטה זו הציגה בידול עקבי בקווי hESC וiPSCs מרובים 10. במהלך בידול על ידי ETV2 וGATA2, גורמי GATA1 כמו גם גורמי GATA2 וTAL1, תאי האנדותל דם יוצרים הפקה, הוא ולעבור האנדותל למעבר hematopoietic. היווצרות הוא בדרך כלל נצפתה בין ימים ...

היכולת הייחודית של תאי גזע pluripotent האנושיים (hPSCs) לעצמית לחדש ולהתמיין לתאים של שלוש השכבות נבט, כוללים דם, לגרום להם כלי רב ערך עבור המחקרים מכניסטית של פיתוח hematopoietic, מודלים של מחלות דם, הקרנת סמים, מחקרים רעילים, והפיתוח של טיפולים סלולריים. בגלל היווצרות דם בתמורת העובר מהאנדותל hemogenic (HE) דרך מעבר hematopoietic אנדותל 1,2, הדור של HE בתרבויות תהיה חיוני כדי ללמוד את המנגנונים המולקולריים המסדירים את המעבר לאנדותל hematopoietic ומפרט hematopoietic. שיטות נוכחי ללימודים של HE מבוססות על האינדוקציה של בידול hematoendothelial באגרגטים (EBS) עם התוספת של ציטוקינים hematopoietic 3-5, וcoculture של hPSCs עם תאי סטרומה hematopoiesis-תומך 6,7 או בתרבויות דו ממדים עם תאי מטריצות וגytokines 8,9. שיטות הבחנה הקלאסיות אלה מבוססות על ההיכרות של אותות חיצוניים הפועלים על פני השטח של התאים וייזום מפלי מסלולים מולקולריים שסופו של דבר יובילו להפעלה של תכנית תעתיק המנחה פיתוח hematoendothelial. לפיכך, את היעילות של בידול hPSCs במערכות אלה מסתמך על אינדוקציה יעילה של אותות אלה, הולכים אותות לגרעין, והפעלה של רגולטורי תעתיק ספציפיים וכתוצאה מכך. בנוסף, המחקר של HE בתרבויות בידול קונבנציונליים דורש צעד נוסף של בידוד HE תאים באמצעות מיון תא. כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט לזירוז הישיר שלו ודם על ידי ביטוי יתר של גורמי שעתוק hematopoietic. שיטה זו מאפשרת לאינדוקציה היעילה של HE בצלחת ותצפית ישירה של האנדותל למעבר hematopoietic ללא הצורך בבידוד של HE באמצעות הליך מיון תא מסורבל. היווצרות הוא והדם מתאי גזע pluripotent אנושיים יכולים להיגרם ביעילות על ידי overexpressing רק כמה גורמי שעתוק (TFS). שילוב האופטימלי של TFS מסוגל גרימת hematopoiesis פאן-מיאלואידית החזקה מhPSCs כולל וGATA1 או GATA2 ETV2. לעומת זאת, שילוב של GATA2 וTAL1 גורם erythromegakaryocytopoiesis 10. תכנות hPSCs דרך ביטוי יתר של גורמים אלה מבדיל hPSCs ישירות לVE-CAD + CD43 - CD73 - הוא תאים שירכשו את הפנוטיפ hematopoietic שהוגדר על ידי הביטוי של CD43 סמן hematopoietic מוקדם 7 בהדרגה. שיטה זו מבוססת על lentiviral לתכנות הישיר של שיטת תאי גזע pluripotent האנושית היא ישימה עבור הדור שלו ותאי דם למחקרים מכניסטית, מחקרים של האנדותל למעבר דם, ורגולצית תעתיק של פיתוח ומפרט hematopoietic. למרות גפרוטוקול urrent מתאר ייצור דם באמצעות ביטוי מכונן של transgenes, ניתן להשיג תוצאות דומות באמצעות mRNA שונה 10.

<table><tbody><tr><td colspan="4">טבלה 1. אינדוקציה של התמיינות hPSCs עם גורמי טרנקריפטציה וניתוח של אנדותל ותאי דם המוגניים.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>פלסמיד #61061</td><td>וקטור לנטי-ויראלי</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61063</td><td>וקטור לנטי-ויראלי</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>פלסמיד #61062</td><td>וקטור לנטי-ויראלי</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>פלסמיד #61062</td><td>וקטור לנטי-ויראלי</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>פלסמיד #61064</td><td>וקטור לנטי-ויראלי</td></tr><tr><td>Hexadimethrine bromide (פוליברן)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td>פולימר קטיוני המשמש להגברת יעילות הזיהום</td></tr><tr><td>Y-27632 (דיהידרוכלוריד) מעכב ROCK</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td>מעכב מסלול RHO/ROCK מעכב ROCK</td></tr><tr><td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/ stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>A11105-01</td><td>מגיב</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> דיסוציאציה של תאים <tr><td>מדיום תרבית לא שלם (ללא גורם גדילה)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; mTeSR1 נוסחה מותאמת אישית&nbsp;</td><td>מכון המחקר WiCell (מדיסון, ויסקונסין)</td><td>MCF</td><td><a name="RANGE! מדיום mTeSR1 נטול סרום D12 אינץ' > ללא bFGF ו-TGFb&nbsp; </a></td></tr><tr><td>human SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td>פרימיום כיתה</td></tr><tr><td>אנושית TPO</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td>דרגת מחקר</td></tr><tr><td>אנושי FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>פרימיום כיתה</td></tr><tr><td>CD144 (VE-cad) FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>560411</td><td>סמן אנדותל (FACS)</td></tr><tr><td>CD226 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>338305</td><td>Hematopoietic ( FACS)</td></tr><tr><td>CD43 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>560199</td><td>Hematopoietic (FACS)</td></tr><tr><td>CD73 APC</td><td>R& D Systems</td><td>FAB5795A</td><td>סמן אנדותל (FACS)</td></tr><tr><td>CD45 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>555485</td><td>Hematopoietic (FACS)</td></tr><tr><td>7AAD</td><td>Life Technologies</td><td>A1310</td><td>בדיקה חיה/מתה (FACS)</td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P6148-500G</td><td>קיבוע תאים&nbsp;</td></tr><tr><td>טריטון X-100&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T9284-500ML&nbsp;</td><td>פרמיביליזציה&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3007003</td><td>סרום בקר עוברי</td></tr><tr><td>עכבר אנטי אנושי CD43</td><td>BD Biosciences</td><td>551457</td><td>נוגדן טהור וראשוני לצביעת אימונופלואורסצנציה (IF)</td></tr><tr><td>ארנב אנטי-אנושי VE-cadherin</td><td>BenderMedSystem</td><td>BMS158</td><td>ראשוני (IF)</td></tr> <tr><td>אנטי-ארנב Alexa Fluor 488-מצומד</td><td>JacksonResearch</td><td>715-486-152</td><td>משני (IF)</td></tr><tr><td>אנטי עכבר Alexa Fluor 594-מצומד</td><td>JacksonResearch</td><td>715-516-150&nbsp;</td><td>משני (IF)</td></tr><tr><td>צבע חומצת גרעין DAPI</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>D1306&nbsp;</td><td>בדיקת חי/מת (IF)</td></tr><tr><td>מדיום קלונוגני MethoCult H4435 מועשר</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>4435</td><td>CFC-assay</td></tr><tr><td>תמיסת כתמים רייט</td><td>סיגמא -Aldrich</td><td>32857</td><td>צביעת ציטוספינים</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr> <td colspan="4"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">טבלה 2. hPSCs culture.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs)&nbsp;</td><td>מכון המחקר של WiCell (מדיסון, ויסקונסין)</td><td>hESCs (WA01, WA09) תאי גזע עובריים אנושיים; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ללא טרנסגנים</td><td>hPSCs מסוגלים להתחדש בעצמם ולהתמיין לתאים של שלוש שכבות נבט</td></tr><tr><td>מדיום שלם ללא סרום לתרבית של hPSCs&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; מדיית mTeSR1&nbsp; &nbsp;</td><td>מכון המחקר WiCell (מדיסון, ויסקונסין)</td><td>M500&nbsp;</td><td>ללא סרום&nbsp; בינוני עם גורמי גדילה לתרבית נטולת מזין של ESC/iPSCs</td></tr><tr><td>מטריגל</td><td>BD Biosciences/ קורנינג&nbsp;</td><td></td><td>מטריצת 356234 לתחזוקת גזעי ESC/iPSCs אנושיים</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, אבקה&nbsp;</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>12500-062</td><td>מדיום בסיסי&nbsp;</td></tr><tr><td>אבקת PBS של HyClone Dulbecco</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>dSH30013.04</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Dispase II, powder</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>17105-041</td><td>פרוטאז ניטרלי, דיסוציאציה</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr>של תאים<td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">טבלה 3. פריימרים לזיהוי אינטגרציה גנומית של נגיף.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>שם הפריימר</td><td><חזק>פורוורד (Fwd)&nbsp; 5' -->3' </חזק></td><td><חזק>הפוך (סיבוב) 5'-->3' </חזק></td><td><חזק>תיאור&nbsp; </חזק></td></tr><tr><td>pSIN EF1a Fwd</td><td>TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA</td><td>--</td><td>EF1a רצף מקדם</td></tr><tr><td>GATA1 Rev</td><td>--</td><td>TCC CTG TAG GCC AGT GC</td><td>&nbsp; אזור קידוד&nbsp;</td></tr><tr><td>GATA2 Rev</td><td>--</td><td>GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG&</td><td>nbsp; אזור קידוד&nbsp;</td></tr><tr><td>TAL1 Rev</td><td>--</td><td>AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT</td><td>&nbsp; אזור קידוד&nbsp;</td></tr><tr><td>LMO2 Rev</td> <td>--</td><td>GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC</td><td>&nbsp; אזור קידוד&nbsp;</td></tr><tr><td>ETV2 Rev</td><td>--</td><td>GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC&nbsp;</td><td>&nbsp; אזור קידוד&nbsp;</td></tr></tbody></table>

אינדוקציה ישירה של hemogenic האנדותל ודם על ידי יתר של גורמי שעתוק בתאי גזע pluripotent האדם

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

במהלך פיתוח, תאי hematopoietic נובעים ממשנה מיוחד של תאי האנדותל, האנדותל hemogenic (HE). פיתוח מודלים הוא במבחנה הוא חיוני למחקרים מכניסטית של מעבר אנדותל-hematopoietic ומפרט hematopoietic. כאן, אנו מתארים שיטה לזירוז יעיל של HE מתאי אנושיים pluripotent גזע (hPSCs) בדרך של ביטוי יתר של קבוצות שונות של גורמי שעתוק. השילוב של ETV2 וGATA1 או GATA2 TFS משמש כדי לגרום לו עם פוטנציאל פאן-מיאלואידית, תוך שילוב של GATA2 וגורמי שעתוק TAL1 מאפשר לייצורו עם erythroid ופוטנציאל megakaryocytic. התוספת של LMO2 לGATA2 ושילוב TAL1 משמעותית מאיצה בידול ומגבירה את ייצור תאי erythroid וmegakaryocytic. שיטה זו מספקת אמצעי יעיל ומהיר של האינדוקציה HE מhPSCs ומאפשרת לתצפית של האנדותל-hematopoietiמעבר ג בצלחת תרבות. הפרוטוקול כולל נהלי התמרה hPSCs וניתוח שלאחר התמרה-שלו ואבות דם.

התרשים סכמטי של הוא ואינדוקצית דם מhPSCs ידי ביטוי יתר של גורמי שעתוק מוצג באיור 1. ETV2 עם שילוב GATA1 או GATA2 גורם hematopoiesis פאן-מיאלואידית, בעוד GATA2, TAL1 +/- שילוב LMO2 גורם hematopoiesis בעיקר erythro-megakaryocytic. שני שילובי TF ישירות מושרה תאיו שהפכו בהמשך לאבות דם עם ספקטרום שונה של בידול hematopoietic. בידול של hPSCs ממדינת pluripotent לדם הפקה הוא לוקח על 4 ימים בממוצע. תאי דם עגולים יוצאים ראשון ביום 5 של בידול. בהמשך לכך, תאי דם צפים רבים מופי...

פרוטוקול זה מתאר אינדוקציה יעילה של אנדותל המוגני ואבות המטופויאטיים רב-פוטנציאליים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות ביטוי מאולץ של גורמי שעתוק.

אינדוקציה ישירה של Hemogenic האנדותל ודם על ידי יתר של גורמי שעתוק בתאי גזע pluripotent האדם

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להפיק תאי דם אריתרואידיים ומילואידיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים על ידי ביטוי מאולץ של גורמי שעתוק. שיטה זו ישימה להפקת אנדותליום הומוגני בתאי דם לצורך מחקרים של מעבר מאנדותליום להמטופואזה (hepo transition) ובקרה שעתוקית של התפתחות ואפיון המטופואזי. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהשיטה מספקת אמצעי יעיל ומהיר להשראת אנדותליום הומוגני מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, ומאפשרת מעקב אחר המעבר האנדותלי-המטופואזי בתוך צלחת תרבית תאים.ד"ר Bruske, עוזר מחקר במעבדתו של ד"ר Lin, ידגים את הפרוצדורה. לפני התחלת התהליך, יש לצפות שיש שש לוחיות עם מטריצה חוץ-תאית כגון mat gel על ידי דילולו בהתאם להוראות היצרן ומזיגתו לבארות. יש להדגיר את הלוחיות למשך 30 עד 60 דקות ב-37 °C עבור מצע הטרנסדוקציה. ראשית, הכינו מנות (aliquots) של לנטי-וירוס עבור כל סדרת טרנסדוקציה, כך שריבוי הזיהום המוערך (multiplicity of infection או MOI) של וירוס לתאים יהיה וירוס אחד לכל תא, ושמרו אותן ב-4 °C.בשלב הבא, ערבבו מצע ללא סרום (complete serum free medium) עבור hbsc viruses poly brain לריכוז סופי של 6 µg/mL ומעכב ROCK Y 2 7 6 3 2 לריכוז סופי של 10 µM, בנפח כולל של 1.3 mL לכל סט טרנסדוקציה, והניחו את התערובות על קרח בזמן הכנת התאים. התחילו עם סבב בריא של תאי גזע פלוריפוטנטיים ב-70% confluence, כארבעה ימים לאחר המעבר האחרון. אם תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים תוחזקו על מצע MATRIGEL, יש להעבירם לתנאים ללא תאי מאכיל (feeder free), שני עד שלושה מעברים לפני ניסויי הטרנסדוקציה, ולוודא שהם מייצגים תרביות בריאות של תאי גזע פלוריפוטנטיים.נקי מדdifferentiation ספונטני. שאבו את מצע ה-HPSC והוסיפו שני מיליליטר של תמיסות ניתוק מבוססות מלח, כגון Accutane, לכל באר של פלטת 6 בארות, והדגירו את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide למשך חמש עד שבע דקות. לאחר מכן, הוסיפו שני מיליליטר של מצע מלא עם 10 µM ROCK inhibitor ואספו את התאים שנותקו.לאחר הכנת תרחיף תאים הומוגני, קחו אליקווט קטן וספרו את התאים החיוניים בשיטת הדחת Trypan blue. לאחר מכן, סנטריפוגו את התאים ב-200 ×g למשך חמש דקות ותלה את המשקע במדיום מלא עם 10 µM מעכב ROCK בריכוז סופי של 3.4 × 10⁶ תאים חיים למילליליטר. לאחר מכן, הוסיפו 200 µL של תרחיף תאים המכיל 0.68 × 10⁶ תאים לכל אחד מ-1.3 מ"ל של מדיום טרנסדוקציה שהוכנו קודם לכן.הוצא את הפלטה בעלת ששת הבארים המצופה במטריקס מ-37 °C. לאחר מכן, שאב את תמיסת המטריקס והעבר כל אחת מתערובות הטרנסדוקציה לבאר, וסובב את הפלטה כדי להפיץ את התאים באופן שווה בבאר. 24 שעות.לאחר הטרנסדוקציה, הדמיאו את הבארות תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שלפחות 80% מהתאים נצמדו. השליכו את תמיסת הווירוס ושטפו את התאים הצמודים במצע חסר (incomplete medium) ללא גורמי גדילה. לאחר מכן, הוסיפו לתאים שלושה מיליליטר של המצע המועשר בציטוקינים, המכונה three F.Medium.הדגרימו את התאים למשך לילה. ביום למחרת, החליפו את המצע למצע Three F טרי המכיל 1 µg/mL של puromycin, כדי להשמיד את התאים הבלתי-טרנסדוקציוניים שנותרו.יש להחליף מצע זה כל 24 שעות כדי להסיר תאים מתים. לאחר 48 שעות של טיפול, יש להפסיק את השימוש ב-puromycin ולהשתמש רק במצע three F טרי ביום הרביעי. לאחר הטרנסדוקציה, יש לבחון את התאים תחת המיקרוסקופ כדי לאתר הופעת צבירי תאים בעלי מורפולוגיה אנדותליאלית, לצורך קביעת היווצרותם של תאי hemo-endothelial.ראשית, יש להפריד את התאים מהצלחת התרבית בין היום השלישי לרביעי באמצעות תמיסה לניתוק תאים. אספו את התאים שנותקו למדיום מלא וסובבו אותם בצנטריפוגה, השעיו את התאים ב-max buffer בטמפרטורת החדר וספרו אותם באמצעות המוציטומטר; לאחר מכן, דגרו 1×10⁵ תאים לכל תגובת צביעה עם נוגדנים מתאימים לזיהוי של v catrin, CD 2 26, CD 73 ו-CD 43, שהם סממני שטח של התא.ביצוע ציטומטריה עם זרימה מתואר בפרוטוקול הטקסט החל מהיום הרביעי. לאחר התעתוק, המשך את התהליך של בידול התאים על ידי החלפת מחצית מהתווך בכל באר, מדי 48 שעות בין היום החמישי לשביעי; בתאים אלו יופיעו תאי דם בצורה של אגרגטים רופפים שירחפו מעל שכבת התאים האנדותליאליים. השאר את התרביות עד ל-14 ימים, שבמהלכם צפויה התרחבות משמעותית של התאים הצפים.ניתוח ציטומטרי של ETV2, GATA1 ו-ETV2. תאים שעברו טרנסדוקציה של GATA2 מראים היווצרות של המו-אנדותל חיובי ל-terin, שניתן לזהות על ידי ביטוי של CD226 והיעדר ביטוי של CD73 ביום השלישי עד הרביעי של הדיפרנציאציה. ניתוח ציטומטרי של ETV2, GATA1 ו-ETV2. תאים שעברו טרנסדוקציה של GATA2 מראים השראה של תאי דם המבטאים CD43 ביום השביעי.לאחר התעתוק, ניתוח ציטומטרי של זרימה של תאים שהושרה על ידי gata two TAL one LMO two ביום ה-14 לאחר התעתוק מראה היווצרות של תאי דם המבטאים CD 2 35 A ו-CD 41 A. הכנות צביעה של תאים המטופויטיים שהושרה על ידי gata two TAL one lmo two הראו מורפולוגיות של תאי אריתרואידים, מקרופאגים ומגקריוציטים בבדיקות של תאים יוצרי מושבות. ניתן לבצע את התעתוק של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים בפחות משעה במהלך ביצוע הליך התעתוק. חשוב להקפיד על חיוניות תאי הגזע, לכלול תמיד מעכב rock בתערובת התגובה ולהשתמש בכמות אופטימלית של נגיף לתא לאחר שלושת הימים הראשונים.לאחר התעתוק, ניתן לבצע שיטות כגון צביעה אימונוהיסטוכימית, בדיקת יצירת מושבות (colony forming assay) וציטומטריית זרימה, כדי לענות על שאלות בנוגע ליעילות הדיפרנציאציה ולסוג מחלת הדם שהושרה. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן הבידוד וההדבקה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, ושל מה לצפות בתרביות דיפרנציאציה במהלך שבעת עד עשרת הימים הראשונים. לאחר שהגורמים השעתוקיים הועברו בהצלחה לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, התאים מאבדים את הפלוריפוטנטיות שלהם ומתמיינים בהדרגה לגורל המטופואטי.בכך, יעמדו החוקרים בדיספוזיציה של מודל in vitro נוח לחקר המכניזמים המולקולריים של המעבר מאנדותל להמטופואזה. אין לשכוח כי עבודה עם אזורים המכילים לנטי-וירוס עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי וסילוק נאות של אזורים המכילים וירוסים בעת ביצוע פרוצדורה זו.

direct-induction-hemogenic-endothelium-blood-overexpression

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט ויעיל עבור הדור של iPSCs אדם ממ"ל של 3-4 דם היקפי באמצעות וקטור תכנות מחדש lentiviral אחת. תכנות מחדש של תאי דם זמינים ונגישים מבטיח להאיץ את הניצול של טכנולוגית iPSC ידי ההפיכה לנגישה לקהילת מחקר רחבה יותר.

דור של תאים אנושיים מושרים pluripotent גזע מדם היקפי באמצעות STEMCCA lentiviral הווקטור

שיטה פותחה לנובעת באופן ישיר בתאי גזע עצביים אנושיים מתאי אבות היווצרות הדם מועשרים מתאי דם היקפיים.

אינדוקציה ישירה של תאי גזע עצביים אדם מתאי הדם היקפי Hematopoietic אב

הפרוטוקול המתואר כאן מפרט את השראת תוכנית המוגנית בפיברובלסטים עובריים של עכברים באמצעות ביטוי יתר של קבוצה מינימלית של גורמי שעתוק. טכנולוגיה זו עשויה להיות מתורגמת למערכת האנושית כדי לספק פלטפורמות למחקר עתידי של המטופואיזה, מחלות המטולוגיות והשתלת תאי גזע המטופויאטיים.

תכנות מחדש עכבר עוברי פיברובלסטים עם גורמי שעתוק כדי לגרום תכנית Hemogenic

אנו מציעים פרוטוקול לתכנות מחדש של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs). על ידי ציפוי תאי הדם המומרים על צלחות מצופות מטריצה עם צנטריפוגה, iPSCs מושרים בהצלחה מתאים צפים. טכניקה זו מציעה פרוטוקול תכנות מחדש פשוט ויעיל עבור תאים כגון PBMCs ו-CBMCs.

נייד דור גזע מושר מתאי דם באמצעות וירוס Sendai ו צנטריפוגה

פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת לייצור יעיל של iPSCs ללא אינטגרציה מתאי דם היקפיים אנושיים בוגרים. עם שימוש בארבעה וקטורים אפיזומליים מבוססי oriP/EBNA כדי לבטא את גורמי התכנות מחדש, KLF4, MYC, BCL-XL, או OCT4 ו-SOX2, ניתן להשיג אלפי מושבות iPSC מ-1 מ"ל של דם היקפי.

דור של תאי גזע מושרים אינטגרציה נטולה מן אדם הדם ההיקפי mononuclear תאי שימוש וקטורי Episomal

כאן, אנו מציגים pluripotent האנושי פרוטוקולים התרבות תאי גזע (hPSC), נהגו להבדיל hPSCs לתוך CD34+ אבות hematopoietic. שיטה זו משתמשת ספציפיות שלב מניפולציה של חגיגת הקנוני איתות לציין תאים באופן בלעדי לתוכנית או סופית או פרימיטיבי hematopoietic.

ביים הבידול של אבות Hematopoietic פרימיטיבי, מהווים הסופית מתאי גזע Pluripotent אנושי

מתאי הגזע האנושיים החזקים ביותר. במצב מזינה-ונטול-כאלה שיטה זו יהיו בעלי יישומים נרחבים במידול מחלות והקרנה לתרכובות טיפוליות.

הומוגניים אנדותל בידול מתאי גזע האדם Pluriפוטנטי במזין-ו-Xeno-תנאי מוגדר חינם

פרוטוקול זה ממחיש את האינדוקציה של תוכנית המטוגניים בתוך הגוף האנושי פיברותקיעות על ידי ביטוי נאכף של הגורמים שעתוק GATA2, GFI1B ו-FOS כדי ליצור גזע המטפאות ובתאי קדמון.

הומוגניים מתיכנות מראש של האדם פיברותקיעות על ידי ביטוי שנאכף של גורמים שעתוק

מוצג כאן פרוטוקול פשוט להתמיינות מכוונת של תאי אנדותל המוגני מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים תוך כשבוע.

התמיינות מכוונת של תאי אנדותל המוגניים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

פרוטוקול זה מתאר את היצירה של כלי דם המארגנים את עצמם מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ומושרים פלוריפוטנטים. רשתות כלי דם אלה מציגות רשת אנדותל נרחבת ומחוברת המוקפת בפריציטים, אקטין שריר חלק וקרום מרתף רציף.

יצירת אורגנואידים של כלי דם אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים

מתואר כאן תהליך עבודה פשוט להבדיל בין תאי אנדותל לתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ואחריו פרוטוקול מפורט לגירוי המכני שלהם. זה מאפשר לחקור את המכנוביולוגיה ההתפתחותית של תאי אנדותל. גישה זו תואמת לבדיקות במורד הזרם של תאים חיים שנאספו משבב התרבית לאחר גירוי מכני.

במבחנה מודל של כלי דם אנושיים עובריים על שבב לחקר מכנוביולוגיה התפתחותית

למד אינדוקציה ישירה של אנדותל המוגני ותאי דם מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות יתר של גורמי שעתוק. שיטה זו מאפשרת חקר מעבר אנדותלי-המטופואטי במעבדה.

אינדוקציה ישירה של Hemogenic האנדותל ודם על ידי יתר של גורמי שעתוק בתאי גזע pluripotent האדם

גלה סרטונים נוספים