ויזואליזציה immunohistochemical של היפוקמפוס Neuron פעילות לאחר מרחבי למידה במודל עכבר של הפרעות נוירו-התפתחותי
12 במאי 2015
אנו מתארים פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה ללמוד את הפרופיל של הפעלת תא עצב בהיפוקמפוס בעקבות חשיפה למשימה למידה מרחבית במודל של עכברים מתאפיינים בליקויים קוגניטיביים ממוצא התפתחות נוירולוגית. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על שני המודלים של העכברים גנטיים או תרופתיים המאופיין בליקויים קוגניטיביים.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לזהות שינויים בזרחון IRK בהיפוקמפוס בעקבות למידה מרחבית בשני עכברי נוקאאוט כמודל להפרעות נוירו-התפתחותיות. זה מושג על ידי בדיקה ראשונה הן מסוג הבר והן בגביע שני עכברי נוקאאוט במבוך המים של מוריס. כשלב שני, מוחות העכברים מוסרים ומכינים פרוסות מעכברים מסוג בר ונוקאאוט על ידי חיתוך ויומי.
לאחר מכן, פרוסות מוח מעכברים מסוג בר ונוקאאוט מעובדות לאימונוהיסטוכימיה ומשמשות לאיתור שינויים בזרחון בהיפוקמפוס. התוצאות מראות הבדלים בזרחון RC בהיפוקמפוס בין סוג הבר לגביע שני עכברי נוקאאוט בהתבסס על הדמיה של מיקרוסקופ אור של הצביעה האימונוהיסטוכימית. שיטה זו מאפשרת לזהות תת-קבוצות ספציפיות של נוירונים בהיפוקמפוס המופעלים בעקבות משימת למידה מיוחדת התלויה בהיפוקמפוס כמו מבוך המים של מוריס.
הוספנו לראשונה את הרעיון לשיטה זו כאשר החלטנו לחקור את המפל המולקולרי שמדגיש את הגירעון המולקולרי בעכברי נוקאאוט בדרגה 2, מודל עכברי להפרעות בספקטרום האוטיזם. להתחיל לאמן עכברים מרקעים שונים בעלי עניין במשימת למידה מרחבית כמו מוריס ווטר מיי. עקוב אחר משטר האימונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה בסוף תקופת האימון, המתת חסד של העכברים ולאחר מכן תקן והסר את מוחם.
כאשר אתה מוכן להמשיך בהליך, השתמש באזמל כדי להסיר את המוח הקטן. לאחר מכן הדביקו את שאר המוח זקוף על לוחית המחזיק של הוויברטו. חותכים את המוח למקטעים סדרתיים בעובי של 20 עד 40 מיקרון ברחבי ההיפוקמפוס הגבי.
מעבירים כל פרוסה לבאר אחת של צלחת 24 בארות מלאה במיליליטר אחד של 0.1 PBS מולארי, מעבירים שלושה עד חמישה קטעי היפוקמפוס גביים לכל עכבר לבארות של צלחת מרובת בארות המכילה 500 מיקרוליטר של 0.1 PBS מולארי לכל אחד. יש לשטוף היטב את החלקים הכלולים בכל באר עם 500 מיקרוליטר של 0.1 PBS מולארי, לבצע את כל השטיפות והדגירות בטמפרטורת החדר בתסיסה עדינה, אלא אם כן צוין אחרת. מתחת למכסה אדים, דגרו את החלקים ב-40% מתנול, 1% מי חמצן ב-0.1 PBS מולארי למשך 20 דקות על מנת להרוות את פעילות הפרוקסידאז האנדוגנית.
לאחר שלוש שטיפות נוספות ב-0.1 PBS מולארי סלחל את החלקים על ידי דגירה ב-500 מיקרוליטר של 0.2% טריטון X 100 למשך חמש דקות בזמן שהחלקים דגירה, הכינו מספיק מאגר חוסם לכל הניסוי. לאחר מכן הסר את התמיסה החדירה והוסף 100 מיקרוליטר ממאגר החסימה לכל אחד. ובכן דגרו את החלקים למשך שעה.
לאחר מכן, הסר את המאגר החוסם וכסה את החלקים בקינאז מווסת חוץ-תאי זרחני. הנוגדן הראשוני דילל בין 1 ל-500 במאגר חוסם. דגרו את החלקים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה למחרת לאחר שטיפת החלקים שלוש פעמים ב-0.1 PBS מולארי למשך חמש דקות.
כל אחד מדגר את החלקים עם נוגדן משני מצומד ביוטין מדולל 1 עד 250 במאגר חוסם למשך שעה בטמפרטורת החדר במהלך הדגירה. הכן את המגיב A BC לפחות 30 דקות לפני השימוש על מנת לאפשר מספיק זמן להיווצרות קומפלקס עדן וביוטין. לאחר שטיפת החלקים שלוש פעמים נוספות עם 0.1 PBS מולארי, הוסף את המגיב A, b, C ואפשר לו לדגור עם הדגימה למשך 45 דקות.
במהלך הסט הבא של שלוש כביסות ב-PBS, הכינו את פתרון העבודה של DAB במכסה האדים בהתאם למפרט היצרן, תוך ציטוט פתרון העבודה של DAB בצלחת. לאחר מכן העבירו חלקים לבארות המכילות את תמיסת העבודה DAB וסובבו לאט את הצלחת כדי לאפשר חשיפה מקסימלית של החלקים לתמיסה. עקוב אחר תגובת ה-DAB במיקרוסקופ עד שיתפתח אות מתאים.
תוך כשתיים עד חמש דקות, עצרו את התגובה בעוצמת הצבע הרצויה על ידי שטיפת הרקמה ב-0.1 PBS מולארי. לאחר שלוש כביסות נוספות ב-PBS, הרכיבו את החלקים על שקופיות מצופות ג'לטין וייבשו אותם בטמפרטורת החדר למשך שלוש עד ארבע שעות לפחות. לאחר ייבוש באוויר העבירו את מכסה המנוע וייבשו את החלקים על ידי הנחתם ברצף תמיסות אתנול משולבות למשך שתי דקות כל אחת, ואז נקו את השקופיות ב-100% קסילן למשך חמש דקות.
מכסים, מחליקים את השקופיות באמצעות מדיום הרכבה ומשאירים אותן במכסה המנוע למשך הלילה לייבוש מעבירים את השקופיות למיקרוסקופ שדה בהיר, מצויד במצלמה ועדשת אובייקטיבית פי 20. רכוש מספר תמונות שדה בהירות מכל קטע בהגדלה של פי 200 המכסות את תמונת ההיפוקמפוס הגבי. שלושה עד חמישה חלקים מכל חיה.
מוצגים כאן קטעים מאזורי ההיפופוטם קמפי הגביים של עכבר מסוג פרא ועכבר שני נוקאאוט מוכתם לזרחן. חוץ-תאי מווסת קריאה מולקולרית אמינה של הפעלה עצבית תלוית למידה. שני העכברים הללו עברו משטר משימות למידה מרחבית קלאסי תלוי היפוקמפוס, מבוך המים של מוריס לפני ההקרבה.
ביום האחרון של הבדיקות, שני עכברי הנוקאאוט הפגינו ליקוי למידה מרחבי משמעותי בהשוואה לעכברי הבר. כדי לנתח את פרוסות המוח מהעכברים, המספר הכולל של תאים חיוביים נספר באזורים השונים של ההיפוקמפוס. בשכבת שלושת הפרמטרים של CA, לעכברים מסוג בר היו הרבה יותר תאים חיוביים ל-RK זרחניים לאזור מאשר בעכברי הנוק-אאוט.
תוצאות הפוכות נמצאו בשכבת תאי ההילי והגרגיר או GCL. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחקור ניסוח פוס על פרוסות מוח מההיפוקמפוס של מודלים גנטיים ותרופתיים של עכברים של הפרעות נוירו-התפתחותיות המאופיינות בליקויים קוגניטיביים. ניתן להשתמש בטכניקה זו גם כדי לחקור שינויים בניסוח כוח העצב באזורים אחרים במוח, כמו גם לעקוב אחר משימות התנהגותיות קוגניטיביות שונות ממבוך מוריס ווטר.
אל תשכח שעבודה עם DIA benzine יכולה להיות עריקות ביותר ולפי אמצעי זהירות, כגון לבישת הגנות מתאימות יש לנקוט תמיד בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול של אימונוהיסטוכימיה לניתוח הפעלת נוירונים בהיפוקמפוס במודל עכבר עם ליקויים קוגניטיביים בעקבות משימה של למידה מרחבית. השיטה ישימה הן למודלים גנטיים והן למודלים פרמקולוגיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- אימונוהיסטוכימיה
- גירעונות קוגניטיביים
רקע
- נוירונים של ההיפוקמפוס ממלאים תפקיד מכריע בלמידה מרחבית.
- הבנת הפעלת נוירונים עשויה לשפוך אור על ליקויים קוגניטיביים.
- מדגמי עכברים משמשים באופן נפוץ לחקר הפרעות התפתחותיות נוירולוגיות.
- אימונוהיסטוכימיה מאפשרת ויזואליזציה של שינויים נוירונליים ספציפיים.
מטרת המחקר
- לזיהוי שינויים בפספורילציה של ההיפוקמפוס לאחר למידה מרחבית.
- להשוואה בין עכברים מסוג בר (wild type) לעכברים עם נוק-אאוט (knockout) במטלת למידה.
- לזיהוי תת-אוכלוסיות של נוירונים מופעלים בהיפוקמפוס.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ביצוע מבחן מבוך המים של מוריס בעכברים.
- הכנת חיתוכי מוח מעכברי פרא (wild type) ועכברי knockout.
- עיבוד חיתוכים לצורך אימונוהיסטוכימיה.
- ויזואליזציה של שינויים בפוספורילציה באמצעות מיקרוסקופיה של אור.
תוצאות עיקריות
- נצפו הבדלים בphosphorylation של ההיפוקמפוס בין עכברים מסוג wild type לעכברי knockout.
- תתי-קבוצות ספציפיות של נוירונים הופעלו במהלך משימת הלמידה המרחבית.
- צביעה אימונוהיסטוכימית סיפקה ויזואליזציה ברורה של שינויים אלה.
- הממצאים תורמים להבנת ליקויים קוגניטיביים בהפרעות נוירו-התפתחותיות.
מסקנות
- הפרוטוקול מזהה ביעילות דפוסי הפעלה עצבית.
- ניתן ליישמו במגוון מודלים של עכברים עם ליקויים קוגניטיביים.
- מחקר זה מעמיק את הבנתנו לגבי הנוירוביולוגיה של למידה וזיכרון.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר זיהוי של הפעלה נוירונלית תלוית-למידה באמצעות אימונוהיסטוכימיה של pERK, ובכך מספק מדד כמותי לתיקוף מטרות (target validation) במודלים של הפרעות נוירו-התפתחותיות. הוא תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קישור בין גירעונות בלמידה מרחבית לבין שינויים באותות ספציפיים לתתי-שדות של ההיפוקמפוס. גישה זו מעניקה ביטחון חיזוי להערכת התערבויות טיפוליות ב-ASD ובמודלים של גירעונות קוגניטיביים קשורים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בחינת היפותזות טיפוליות באמצעות מיפוי דפוסי פוספורילציה של ERK המושרים על ידי למידה בתתי-שדות של ההיפוקמפוס.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף של מטרות פונקציונליות באמצעות פרופיל הפעלה ספציפי לסוגי תאים לאחר אתגר התנהגותי.
- ערך ניבוי: תומך בסינון תיקי מוצרים על ידי כימות הבדלים בתגובה הנוירונלית בין סוגים של wild-type למודלים של מחלות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנה של חתכי היפוקמפוס סטנדרטיים לצורך זיהוי שחזור של pERK במודלים גנטיים ופארמקולוגיים.
- פלט כמותי: מספק קריאות מבוססות-ספירה של נוירונים חיוביים ל-pERK, המאפשרות השוואה סטטיסטית של פרופילי הפעלה.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: ביסוס של תהליך עבודה להיסטוכימיה עקיפה (immunohistochemistry) הניתן להעברה, עבור סריקת תרכובות בשלבים הבאים במודלים של ליקוי קוגניטיבי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: ממדל באופן ישיר ליקוי בלמידה התלויה בהיפוקמפוס שנצפה בפנוטיפים של הפרעות בספקטרום האוטיסטי.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין פנוטיפיקה התנהגותית למדדים מולקולריים כדי לתמוך במעורבות מטרה המיושרת עם סמנים ביולוגיים.
- קידום מותאם סיכון: מספק מידע להחלטות המשך/עצירה (go/no-go) על ידי זיהוי גירעונות באותות ספציפיים לאזורים הקשורים לביצועים קוגניטיביים.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לבדיקת יעילות פרה-קלינית, ובכך מאפשרת הערכה מונחית-השערה של הצלה קוגניטיבית.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בהבהרת מסלולים ביולוגיים באמצעות ויזואליזציה של מקבצי נוירונים המופעלים על ידי למידה באזורי ההיפוקמפוס הדורסליים.
- סריקה: מספקת תוצרי אימונוהיסטוכימיה כמותיים וסטנדרטיים המתאימים להערכה ברמת דיוק גבוהה של תרכובות.
- אנליזה: מספקת מדידות המבוססות על ספירת תאים המאפשרות השוואה של הפעלת אותות בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין ביצועים במבוך המים של מוריס לבין ביטוי pERK בהיפוקמפוס, ובכך מחזקת את התוקף הפנוטיפי.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמה שניתן להשתמש בה שוב להערכת הפעלת נוירונים במגוון מודלים של התפתחות נוירולוגית ונוירופסיכיאטריה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במסלולי למידה וזיכרון.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות אימונוהיסטוכימיה של חתכים קבועים וספירת תאים עיוורת.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים מוקדמת של מטרות, בהתבסס על הפעלה נוירונלית תפקודית.
- השפעה על הפורטפוליו: מקל על תיעדוף מותאם סיכון באמצעות זיהוי מודלים בעלי פנוטיפים התנהגותיים ומולקולריים תואמים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באימונוהיסטוכימיה, נוירוביולוגיה התנהגותית וספירה סטריאולוגית של תאים.
- תלוי בחיתוך באמצעות קריוסטט או ויברטום, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית או במיקרוסקופיית שדה בהיר, ובכלי ניתוח תמונות.
- מצריך סטנדרטיזציה בין מעבדות עבור דילול נוגדנים, חשיפת אנטיגנים (antigen retrieval) ורגישות גילוי.
- חייב לקחת בחשבון שונות בעובי החיתוכים, בדיוק הדיסקציה של ההיפוקמפוס ובביצועי המטלה ההתנהגותית.
- מוגבל למדידות בנקודת סיום; אינו לוכד דינמיקה בזמן אמת של הפעלת קינאז.
