ויזואליזציה immunohistochemical של היפוקמפוס Neuron פעילות לאחר מרחבי למידה במודל עכבר של הפרעות נוירו-התפתחותי

אנו מתארים פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה ללמוד את הפרופיל של הפעלת תא עצב בהיפוקמפוס בעקבות חשיפה למשימה למידה מרחבית במודל של עכברים מתאפיינים בליקויים קוגניטיביים ממוצא התפתחות נוירולוגית. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על שני המודלים של העכברים גנטיים או תרופתיים המאופיין בליקויים קוגניטיביים.

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לזהות שינויים בזרחון IRK בהיפוקמפוס בעקבות למידה מרחבית בשני עכברי נוקאאוט כמודל להפרעות נוירו-התפתחותיות. זה מושג על ידי בדיקה ראשונה הן מסוג הבר והן בגביע שני עכברי נוקאאוט במבוך המים של מוריס. כשלב שני, מוחות העכברים מוסרים ומכינים פרוסות מעכברים מסוג בר ונוקאאוט על ידי חיתוך ויומי.

לאחר מכן, פרוסות מוח מעכברים מסוג בר ונוקאאוט מעובדות לאימונוהיסטוכימיה ומשמשות לאיתור שינויים בזרחון בהיפוקמפוס. התוצאות מראות הבדלים בזרחון RC בהיפוקמפוס בין סוג הבר לגביע שני עכברי נוקאאוט בהתבסס על הדמיה של מיקרוסקופ אור של הצביעה האימונוהיסטוכימית. שיטה זו מאפשרת לזהות תת-קבוצות ספציפיות של נוירונים בהיפוקמפוס המופעלים בעקבות משימת למידה מיוחדת התלויה בהיפוקמפוס כמו מבוך המים של מוריס.

הוספנו לראשונה את הרעיון לשיטה זו כאשר החלטנו לחקור את המפל המולקולרי שמדגיש את הגירעון המולקולרי בעכברי נוקאאוט בדרגה 2, מודל עכברי להפרעות בספקטרום האוטיזם. להתחיל לאמן עכברים מרקעים שונים בעלי עניין במשימת למידה מרחבית כמו מוריס ווטר מיי. עקוב אחר משטר האימונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה בסוף תקופת האימון, המתת חסד של העכברים ולאחר מכן תקן והסר את מוחם.

כאשר אתה מוכן להמשיך בהליך, השתמש באזמל כדי להסיר את המוח הקטן. לאחר מכן הדביקו את שאר המוח זקוף על לוחית המחזיק של הוויברטו. חותכים את המוח למקטעים סדרתיים בעובי של 20 עד 40 מיקרון ברחבי ההיפוקמפוס הגבי.

מעבירים כל פרוסה לבאר אחת של צלחת 24 בארות מלאה במיליליטר אחד של 0.1 PBS מולארי, מעבירים שלושה עד חמישה קטעי היפוקמפוס גביים לכל עכבר לבארות של צלחת מרובת בארות המכילה 500 מיקרוליטר של 0.1 PBS מולארי לכל אחד. יש לשטוף היטב את החלקים הכלולים בכל באר עם 500 מיקרוליטר של 0.1 PBS מולארי, לבצע את כל השטיפות והדגירות בטמפרטורת החדר בתסיסה עדינה, אלא אם כן צוין אחרת. מתחת למכסה אדים, דגרו את החלקים ב-40% מתנול, 1% מי חמצן ב-0.1 PBS מולארי למשך 20 דקות על מנת להרוות את פעילות הפרוקסידאז האנדוגנית.

לאחר שלוש שטיפות נוספות ב-0.1 PBS מולארי סלחל את החלקים על ידי דגירה ב-500 מיקרוליטר של 0.2% טריטון X 100 למשך חמש דקות בזמן שהחלקים דגירה, הכינו מספיק מאגר חוסם לכל הניסוי. לאחר מכן הסר את התמיסה החדירה והוסף 100 מיקרוליטר ממאגר החסימה לכל אחד. ובכן דגרו את החלקים למשך שעה.

לאחר מכן, הסר את המאגר החוסם וכסה את החלקים בקינאז מווסת חוץ-תאי זרחני. הנוגדן הראשוני דילל בין 1 ל-500 במאגר חוסם. דגרו את החלקים למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה למחרת לאחר שטיפת החלקים שלוש פעמים ב-0.1 PBS מולארי למשך חמש דקות.

כל אחד מדגר את החלקים עם נוגדן משני מצומד ביוטין מדולל 1 עד 250 במאגר חוסם למשך שעה בטמפרטורת החדר במהלך הדגירה. הכן את המגיב A BC לפחות 30 דקות לפני השימוש על מנת לאפשר מספיק זמן להיווצרות קומפלקס עדן וביוטין. לאחר שטיפת החלקים שלוש פעמים נוספות עם 0.1 PBS מולארי, הוסף את המגיב A, b, C ואפשר לו לדגור עם הדגימה למשך 45 דקות.

במהלך הסט הבא של שלוש כביסות ב-PBS, הכינו את פתרון העבודה של DAB במכסה האדים בהתאם למפרט היצרן, תוך ציטוט פתרון העבודה של DAB בצלחת. לאחר מכן העבירו חלקים לבארות המכילות את תמיסת העבודה DAB וסובבו לאט את הצלחת כדי לאפשר חשיפה מקסימלית של החלקים לתמיסה. עקוב אחר תגובת ה-DAB במיקרוסקופ עד שיתפתח אות מתאים.

תוך כשתיים עד חמש דקות, עצרו את התגובה בעוצמת הצבע הרצויה על ידי שטיפת הרקמה ב-0.1 PBS מולארי. לאחר שלוש כביסות נוספות ב-PBS, הרכיבו את החלקים על שקופיות מצופות ג'לטין וייבשו אותם בטמפרטורת החדר למשך שלוש עד ארבע שעות לפחות. לאחר ייבוש באוויר העבירו את מכסה המנוע וייבשו את החלקים על ידי הנחתם ברצף תמיסות אתנול משולבות למשך שתי דקות כל אחת, ואז נקו את השקופיות ב-100% קסילן למשך חמש דקות.

מכסים, מחליקים את השקופיות באמצעות מדיום הרכבה ומשאירים אותן במכסה המנוע למשך הלילה לייבוש מעבירים את השקופיות למיקרוסקופ שדה בהיר, מצויד במצלמה ועדשת אובייקטיבית פי 20. רכוש מספר תמונות שדה בהירות מכל קטע בהגדלה של פי 200 המכסות את תמונת ההיפוקמפוס הגבי. שלושה עד חמישה חלקים מכל חיה.

מוצגים כאן קטעים מאזורי ההיפופוטם קמפי הגביים של עכבר מסוג פרא ועכבר שני נוקאאוט מוכתם לזרחן. חוץ-תאי מווסת קריאה מולקולרית אמינה של הפעלה עצבית תלוית למידה. שני העכברים הללו עברו משטר משימות למידה מרחבית קלאסי תלוי היפוקמפוס, מבוך המים של מוריס לפני ההקרבה.

ביום האחרון של הבדיקות, שני עכברי הנוקאאוט הפגינו ליקוי למידה מרחבי משמעותי בהשוואה לעכברי הבר. כדי לנתח את פרוסות המוח מהעכברים, המספר הכולל של תאים חיוביים נספר באזורים השונים של ההיפוקמפוס. בשכבת שלושת הפרמטרים של CA, לעכברים מסוג בר היו הרבה יותר תאים חיוביים ל-RK זרחניים לאזור מאשר בעכברי הנוק-אאוט.

תוצאות הפוכות נמצאו בשכבת תאי ההילי והגרגיר או GCL. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחקור ניסוח פוס על פרוסות מוח מההיפוקמפוס של מודלים גנטיים ותרופתיים של עכברים של הפרעות נוירו-התפתחותיות המאופיינות בליקויים קוגניטיביים. ניתן להשתמש בטכניקה זו גם כדי לחקור שינויים בניסוח כוח העצב באזורים אחרים במוח, כמו גם לעקוב אחר משימות התנהגותיות קוגניטיביות שונות ממבוך מוריס ווטר.

אל תשכח שעבודה עם DIA benzine יכולה להיות עריקות ביותר ולפי אמצעי זהירות, כגון לבישת הגנות מתאימות יש לנקוט תמיד בעת ביצוע הליך זה.