הכנה קלילה ויעילה של Glycopolymers פלורסנט Tri-רכיב באמצעות פלמור שליטת רפסודה

המטרה הכוללת של הליך זה היא סינתזה מבוקרת היטב של פולימרי גליקו ליניאריים סטטיסטיים פלואורסצנטיים באמצעות פיצול תוספת הפיך, העברת שרשרת או פילמור רפסודה. זה מושג תחילה על ידי סינתזה של מונומר הגליקו שני לקטו ביו אתיל מת' אקרילאמיד, או L-A-E-M-A. השלב השני הוא להשתמש בפילמור רפסודה של L-A-E-M-A-N שני אמינו אתיל מת' אקרילאמיד, או A EMA ו-N שני הידרוקסיאתיל אקרילאמיד או GAA כדי לסנתז את פולימר הגליקו המתאים בפיזור נמוך.

לאחר מכן, פולימר הגליקו משתנה על אחד האמינים העיקריים שלו על ידי תגובה עם קרבוקסי פלואורסצאין xito אסטר אמצעי לייצור פולימר גליקו עם פלואורסצאין. השלב האחרון הוא לקשור את פולימר הגליקו המקורי של הפלואורסצאין לחרוזי רווקים מצופים לקטין עם ספציפיות קשירת פחמימות ידועה. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית משמשת לניתוח הקישור של פולימרי הגליקו לחרוזים שנוצרו, ומאשרת כי פולימר הגליקו מחזיק בפחמימה המעניינת ומסומן בתג פלואורסצנטי.

היתרון של פילמור RAF על פני שיטות קיימות המשתמשות בפילמור רדיקלים חופשיים קונבנציונליים הוא שתהליך הזעם הוא טכניקת פילמור בקרה הממזערת את מספר השרשראות הנגזרות מהיוזם. התוצאה היא פולימרים בעלי משקלים מולקולריים קבועים מראש ומתלה פיזור פולי צר מאוד. ניתן ליישם פילמור על תערובת מוגדרת של מונומרים להכנת פולימרי גליקו פלואורסצנטיים ספציפיים.

לפולימרי גליקו אלה יש יכולות קשירה מוגדרות שניתן לאמת על ידי שימוש בחרוזים מצופים לקטין. ההכנה היעילה של פולימרי גליקו פלואורסצנטיים אמורה להתגלות כבעלת ערך רב למחקר הביולוגיה של הגליקו בעתיד. כדי להתחיל, ממיסים שני גרם של חומצה בקטו ביונית בשלושה מיליליטר של מתנול נטול מים.

לאחר מכן, הוסף לאט אתנול מוחלט טיפה לתמיסה עד שהיא פשוט הופכת לעכורה. השתמש במאייד סיבובי כדי להסיר את כל הממיסים. חזור על תהליך זה שלוש פעמים כדי לייצר 1.94 גרם לקטו ביו אחד חמש לקטון בתפוקה של 98%.

הוסף תמיסה של גרם אחד של לקטו ביו לקטון בשלושה מיליליטר מתנול לתמיסה של A EMA ו-MEHQ בשני מיליליטר מתנול. לאחר מכן, מוסיפים מיליליטר אחד של טריאתילאמין ומערבבים את התערובת בטמפרטורת החדר. לאחר 48 שעות מוסיפים לתערובת 20 מיליליטר מים נטולי יונים ומעבירים למאייד סיבובי.

לאדות עד לייבוש מלא. ממיסים את השאריות ב -20 מיליליטר מים נטולי יונים ומורחים את התמיסה על החלק העליון של עמוד חילופי אניונים בגודל 10 על 20 מילימטר. הנח המכילה מיליגרם אחד של MEHQ מתחת לשקע והוציא את העמוד לתוך הכוס.

לאחר שאיבת התמיסה במאייד סיבובי, ממיסים את השאריות ב -20 מיליליטר מים נטולי יונים ומוסיפים מיליגרם אחד של שרף חילופי יונים. עד שבדיקת הברז שלילית, מבוצעת בבדיקות ברז על ידי הוצאת מיקרוליטר אחד מהתמיסה ומריחתו על פלטת כרומטוגרפיה בשכבה דקה. מרססים את הצלחת בתמיסת אתנול של 2% ומחממים בחום של 90 מעלות צלזיוס למשך דקה על פלטה חמה.

נקודת הסיום הושגה כאשר לא נוצר צבע כחול. לאחר מכן, סנן את התמיסה דרך משפך זכוכית פריטי לתוך מבחנה. הקפיאו את התמיסה בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס ולאחר מכן העבירו אותה לליופילייזר לייבוש בהקפאה.

ממיסים את השאריות בכמות מינימלית של מתנול ומזרזים את המוצר על ידי הוספת מינוס 20 מעלות צלזיוס ואצטון נטול מים. אסוף את ה-L-A-E-M-A המשקע על ידי סינון דרך משפך זכוכית מצומצם. העבירו את המשפך ושקעו לייבוש ואקום לייבוש תחילה ב-0.5 גרם של כ-150 ננו-חלקיקי תחמוצת אלומיניום למיליליטר אחד של HEAA בדרגה מסחרית במבחנה של שני מיליליטר.

צנטריפוגה של הצינור ב-300 פעמים G למשך 30 שניות והשתמש בשכבה העליונה כמעכב ללא HEAA ממיס בזהירות 32.8 מיליגרם של L-A-E-M-A, 1.7 מיליגרם של EMA ו-27.5 מיקרוליטר של HEAA ללא מעכב ו-0.4 מיליליטר מים נטולי יונים והעביר את התמיסה לצינור צד מנוקה היטב של מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של מגיב רפסודה ו -50 מיקרוליטר של מגיב יוזם לצינור וערבב על ידי הקשה עדינה על צד הצינור כשהשסתום סגור. חבר את הצינור לקו ואקום והקפיא את התכולה באמצעות אמבט אתנול קרח יבש.

לאחר מכן הפחת את לחץ הצינור כדי לנטות ל -50 מיליטור עם משאבה וסגור את השסתום. הסר את אמבט הקרח היבש ואפשר לתכולה להפשיר. חזור על מחזור ההקפאה, הוואקום וההפשרה פעמיים בזהירות רבה יותר.

בדוק את הצינור כדי לוודא שהתוכן מומס לחלוטין ומערבל בעדינות במידת הצורך. לפני הישיבה, הסר את הצינור הסגור מקו הוואקום והנח אותו בשקית ואקום מפלסטיק שקופה. פנה את האוויר מהשקית בעזרת משאבת יד מפלסטיק.

לאחר מכן הכניסו את השקית לאמבט מים מכוסה בחום של 70 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר מכן, הוציאו את הצינור מהשקית והעבירו את תכולתו לשקית דיאליזה עם חתך משקל מולקולרי של 3,500 דלטונים. הכניסו את שקית הדיאליזה לכוס ובצעו דיאליזה כנגד שני ליטר מים נטולי יונים למשך 24 שעות.

העבירו את תכולת שקית הדיאליזה למבחנה והכניסו למקפיא בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס. לאחר ההקפאה, מעבירים לליופילייזר ומקפיאים יבשים. כדי להשיג תחילה את פולימר הגליקו הלבן הרך PMA LA EMA, הכינו תמיסה של חמישה מיליגרם של PMA LA EMA ב -0.9 מיליליטר PBS.

לאחר מכן, הוסיפו לאט 0.6 מיליגרם של קרבוקסי פלואורסצאין cin, אמצע ב-100, מיקרוליטר של דימתילפורממיד לתמיסה המעורבת במהירות, צינור המיקרו ונייר הכסף, וערבבו לאט במשך 16 שעות בטמפרטורת החדר, העבירו את התמיסה לשקית דיאליזה עם חיתוך משקל מולקולרי של 3,500 דלטונים. הכניסו את השקית לכוס ובצעו דיאליזה כנגד שני ליטר מים נטולי יונים למשך 16 שעות תוך שמירה על הגנה מפני האור. העבירו את תכולת שקית הדיאליזה למבחנה.

לאחר הקפאת התמיסה בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס, יש להקפיא יבש. כדי להשיג את הפלואורסצ הצהוב הרך שכותרתו P-M-A-L-A-E-M-A, פולימר גליקו, קבע את המשקל המולקולרי הממוצע של המספר, המשקל, המשקל המולקולרי הממוצע והפיזור של פולימרי הגליקו עם מערכת HPLC. תחילה ב -1.5 מיליליטר PBS ועד תרחיף של 50 מיקרוליטר של ארי קריסטה גלרי לקטין מצופה חרוזי ארו בצינור צנטריפוגה.

ואז צנטריפוגה את הצינור ב -300 פעמים G למשך דקה אחת. לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט וחזרו על הכביסה פעמיים נוספות לפני שתוסיפו לבסוף 0.5 מיליליטר PBS. הוסף תמיסה של שלושה מיקרוגרם של הפלואורסצאין שכותרתו PMA LA EMA בשישה מיקרוליטרים של PBS לצינור המכיל את החרוזים המצופים לקטין.

השתמש בפלואורסצאין שכותרתו P-M-A-G-A-E-M-A כבקרה שלילית. לאחר מכן, עטפו את הצינורות בנייר כסף ודגרו אותם בטמפרטורת החדר למשך שעה. צנטריפוגה את הצינור למשך דקה אחת והשליכו את הסופרנטנט.

ואז ראוס, השעו את החרוזים ב -1.5 מיליליטר PBS טרי וחזרו על הכביסה שלוש פעמים. לבסוף, ראוס משהה את החרוזים ב-0.2 מיליליטר PBS מעבירים ארבעה מיקרוליטרים של החרוזים התלויים לבאר של מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי. החלק וכסה עם תקליט החלקה של כיסוי זכוכית.

תמונות של השקופית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במסנן FITC אובייקטיבי פי 10 ומצלמה. פולימרי הגליקו נותחו על ידי כרומטוגרפיה של חדירת ג'ל. לפולימרים המסונתזים ללא שימוש ברפסודה יש פיזור גבוה בהרבה מאלה המיוצרים באמצעות רפסודה.

כאשר הוא מסומן בפלואורסצאין, המראה הפיזי של פולימר הגליקו משתנה מלבן לצבע צהוב חזק המוצג באור UV. תמיסה של פולימר ללא תווית נשארת כהה בעוד שהפולימר המסומן בפלואורסצאין זוהר ירוק בוהק המאשר את נוכחות הקישור הספציפי לתווית לחרוזים מצופים לקטין מתרחש רק עם פולימרים הנושאים שאריות סוכר תליון חרוזים זוהרים בירוק כאשר הם קשורים, בעוד שהם נשארים כהים כאשר הם מטופלים בפולימרים חסרי שאריות סוכר תליון. טכניקת פילמור מבוססת רפסודה זו מאפשרת גמישות רבה בסוג פולימרי הגליקו הניתנים לסינתזה.

ניתן להשיג תיוג עוקב של פולימרי הגליקו גם עם מגוון גדול של ריאגנטים פלואורסצנטיים, המסוגלים להגיב באמצעים ראשוניים בסביבה מימית. חוקרים בתחום הביולוגיה של הגליקו יכולים להשתמש בטכניקה זו כדי להשיג בקלות פולימרי גליקו מגוונים ומוגדרים ביותר. פולימרי גליקו אלה יכולים לשמש ככלים לחקור את הספציפיות של קשירת הפחמימות, כגון אלה שנצפו במסלול הנשימה של חולים עם סיסטיק פיברוזיס או כאלה המעורבים בסוגים רבים של סרטן אנושי.