Name: הכנה קלילה ויעילה של Glycopolymers פלורסנט Tri-רכיב באמצעות פלמור שליטת רפסודה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: למד סינתזה של גליקופולימרים פלואורסצנטיים בשליטת RAFT לחקר גליקוביולוגיה. שיטה זו מייצרת פולימרים עם פיזור נמוך ותכונות קשירה ספציפיות ללקטינים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המעבדות הכימיות של תחנת הניסויים של אוניברסיטת מיזורי, ועל ידי איגוד סיסטיק פיברוזיס של מיזורי.

1. סינתזה של Glycomonomer 2-Lactobionamidoethyl Methacrylamide <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר 2 גרם של חומצת lactobionic ב3.0 מיליליטר של מתנול נטול מים ולאט לאט להוסיף אתנול מוחלט באופן חכם ירידה עד הפתרון פשוט הופך מעונן, ולאחר מכן להסיר הממסים באמצעות rotoevaporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את השאריות, מהשלב 1.1, 3.0 במתנול נטול מים מיליליטר ו, שוב, לאט להוסיף אתנול מוחלט עד מעונן פשוט, אז להתאדות הממסים באמצעות rotoevaporation. חזור על פעולה זו 3 פעמים כדי לקבל lactobiono-1,5-לקטון (1.94 גר &#39;, תשואת 98%). מוצר זה הוא של טוהר מספיק כדי לשמש בתגובות הבאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1.0 גרם של lactobionolactone ב3.0 מיליליטר של מתנול לN - (2-aminoethyl) methacrylamide (AEMA, 0.58 גר &#39;) ואתר monomethyl הידרוקינון (MEHQ, 1.0 מ&quot;ג), מעכב של פילמור העצמי, ב2.0 מיליליטר של מתנול, ואחרי על ידי 1.0 מיליליטר של triethylamine. מערבבים על RT במשך 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 20 מיליליטר של H 2 O deionized (DH 2 </תת&gt; O) לבקבוק התגובה, ולאחר מכן להסיר מתנול וtriethylamine בחינם על ידי אידוי ליובש באמצעות rotoevaporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר כל חומצת lactobionic שנותרה, להוסיף 20 מיליליטר של DH 2 O, לאחר מכן להעביר את התמיסה המימית דרך עמודת אניוני (OH - טופס, 10 מ&quot;מ x 20 מ&quot;מ) לתוך מבחנה המכילה 1.0 מ&quot;ג קבלה של MEHQ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר triethylamine, מיוצרת בשלב 1.5, על ידי מתאדה ליובש באמצעות rotoevaporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 20 מיליליטר של DH 2 O ולהסיר AEMA unreacted ידי הוספה לאט aliquots 1 מ&quot;ג של שרף חילוף קטיון (H + טופס) עד שלא ninhydrin חומרים תגובתי הם לזיהוי. צג ההסרה על ידי לקיחת aliquots μl 1 לפתרון לאחר כל הוספת שרף, ליישם אותו לצלחת כרומטוגרפיה בשכבה דקה, ואז ריסוס הצלחת עם ninhydrin 2% בפתרון אתנול. כאשר אין צבע כחול עמוק הוא ציין לפתח כאשר הצלחת מחוממת ל -90 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות, כבר הגיעה לנקודת הסיום. </li><li&gt; סנן את הפתרון דרך משפך זכוכית fritted, להעביר את התסנין למבחנה, להקפיא את המדגם ב -80 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן Lyophilize. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר MEHQ מהמדגם על ידי המסת החומר מיובש בהקפאה בסכום מינימאלי של מתנול (~ 0.5 מיליליטר), ולאחר מכן להוסיף אצטון נטול מים קרים (-20 ° C, 15 מיליליטר) כדי לזרז את המוצר. לאסוף את המשקע על ידי סינון באמצעות משפך זכוכית fritted, לאחר מכן לייבש המשקע בייבוש תחת ואקום להשיג methacrylamide 2-lactobionamidoethyl (LAEMA) כאבקה מחוץ לבן (0.94 גר &#39;, תשואת 68%). מוצר זה הוא של טוהר מספיק כדי לשמש בתגובות הבאות. </li></ol> 2. סינתזה של מונומר 2-Gluconamidoethyl Methacrylamide הערה: הכנת methacrylamide 2-gluconamidoethyl (GAEMA), שאינו בעלי סוכר תליון, הותאמה משיטה שפורסמה 15. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 2.0 גרם של AEMA המומס ב 10 מיליליטר של מתנול לפתרוןשל D-gluconolactone (1.6 גר &#39;) ב -30 מיליליטר של מתנול ו, עם ערבוב, מוסיף באיטיות 1.6 מיליליטר של triethylamine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את התגובה בRT למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את המוצר זירז באמצעות משפך זכוכית fritted ולשטוף את המשקע שלוש פעמים עם 10 מיליליטר כל אחד מisopropanol, ולאחר מכן לשטוף עם 10 מיליליטר של אצטון היבש. ייבש את המוצר זירז בייבוש תחת ואקום. </li></ol> 3. רפסודת Glycopolymer סינתזה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את MEHQ הנוכחי בN המסחרי המעכב - (2-hydroxyethyl) acrylamide (HEAA), להוסיף 1 מיליליטר של HEAA לצינור 2 מיליליטר microcentrifuge, ואחריו הוספתי 0.5 גרם של חלקיקי תחמוצת אלומיניום. צנטריפוגה הצינור ב XG 300 במשך 30 שניות, ולהשתמש בHEAA השכבה העליונה בתגובה הבאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 32.8 מ&quot;ג של LAEMA (70.0 μmol), 1.7 מ&quot;ג של AEMA (10.5 μmol) ו27.5 μl של HEAA (270 μmol) בזהירות, כל מומסים ב0.4 מיליליטר של DH 2 O, לצינור 1 מיליליטר Schlenk ניקה היטב, ובכך יש monomאה יחס טוחנת של 20: 3: 77. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתגובה מקבילה, על מנת לייצר פולימרים שליטה שלא להחזיק כל סוכר תליון, במקום באמצעות LAEMA בשלב 3.2, להחליף 21.4 מ&quot;ג של GAEMA (70.0 μmol) בתגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצינור המתאים Schlenk (כלומר, 3.2 או 3.3), ברצף להוסיף 50 μl של DMF מכיל 0.53 מ&quot;ג של (חומצת 4-cyanopentanoic) -4-dithiobenzoate (1.9 μmol, סוכן רפסודה), ו -50 μl של DMF המכיל 250 מיקרוגרם של 4,4&#39;-azobis- (חומצת 4-cyanovaleric) (0.9 μmol, יוזם). לערבב בעדינות על ידי קשה באצבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את התוכן הכלול בצינור Schlenk העסקת קרח יבש: אמבטיה אתנול (קרח יבש 75 גרם ב 100 מיליליטר אתנול), תחול ואקום לבתוך 10-50 mTorr, אז סגור את שסתום Schlenk ולאפשר הפתרון ללהפשיר לאט לRT . חזור על מחזור ההקפאה-פינוי-הפשרה זה עוד פעמיים. ודא שכל חומרים כימיים מומסים לאחר ההפשרה האחרונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינור Schlenk לתואר ראשון פלסטיק סגרg, לפנות האוויר של התיק, ולאחר מכן לאטום אותו. העבר את התיק המכיל את צינור Schlenk לאמבטית מים שחומם מראש ב 70 מעלות צלזיוס ודגירה של 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות את הפתרון בצינור Schlenk לשקית מוכנה דיאליזה (MWCO = 3,500), ודיאליזה נגד DH 2 O (10 x 2 L) למשך 24 שעות, שינוי DH 2 O בכל שעה לשעה 8 הראשונה. בעקבות דיאליזה, להעביר את המדגם מצינורות הדיאליזה למבחנה, להקפיא את המדגם ב -80 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן Lyophilize זה. </li></ol> הערה: פולי-methacrylamide / acrylamide הסטטיסטית התוצאה (PMA) קופולימרים המכילים תליון -β-D-galactopyranosyl-D-gluconamide 4 O (lactobionamide) (משלב 3.2) או D-gluconamide (משלב 3.3), בהתאמה, הם הושג. לנוחיות דיון, שתי glycopolymers אלה מקוצרים כמו PMA-LAEMA וPMA-GAEMA, בהתאמה. 4. לאחר שינוי של Glycopolymers עם fluorophores </p&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 5.0 מ&quot;ג של glycopolymer-LAEMA PMA או PMA-GAEMA מכיל ~ 0.9 μmole של קבוצות פונקציונליות האמינים ראשוני ב0.9 מיליליטר של בופר פוספט (PBS, 0.1 מ &#39;פוספט נתרן, 0.15 מ&#39; NaCl, pH 7.5), בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להוסיף 0.6 מ&quot;ג של succinimidyl אסתר carboxyfluorescein בDMF של 100 μl לפתרונות מהיר עם ערבוב. בעדינות מערבב את התגובות במשך 16 שעות בחושך ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד מוגן מפני אור, טען את המדגם לתוך צינור מוכן דיאליזה (MWCO = 3,500) ודיאליזה נגד DH 2 O (2 ליטר) במשך 16 שעות, לשנות את פתרון הדיאליזה בכל שעה לשעה 8 הראשונה. בעקבות דיאליזה, להעביר את המדגם מצינורות הדיאליזה למבחנה, להקפיא את המדגם ב -80 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן Lyophilize זה. </li></ol> שים לב: בעקבות lyophilization, glycopolymers ניאון PMA-LAEMA-העמסה וPMA-GAEMA-והעמסת, בהתאמה, מתקבל. 5. אפיון של גלאיקופולימרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את מספר משקל המולקולרי (n M) הממוצע, המשקל מולקולרי (w M) הממוצע במשקל וdispersity (M w / n M) של glycopolymers על מערכת HPLC מסחרית מצוידות בכרומטוגרפיה חלחול ג&#39;ל תוכנה (GPC), GPC טור מתאים למשקל המולקולרי של עניין, וגלאי שבירה, באמצעות 0.1 M טריס / מאגר M 0.1 נתרן כלורי (pH 7) כeluent בקצב זרימה של 0.6 מיליליטר / דקה 14. השתמש סטנדרטים פוליאתילן גליקול כסטנדרטי משקל מולקולריים (MW: 200-1,200,000 g / mol). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את הריכוזים בפועל של קבוצות פונקציונליות האמינים הראשוני בתוך glycopolymers 16. לנתח את תוכן פחמימות הכולל של glycopolymers המסונתזת על פי שיטה שפורסמה 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע בדיקות של הרכב וטוהר LAEMA glycomonomers מבניים, GAEMA וglycopolymers PMA-LAEMA, PMA-GAEMA בD 2 O על ידי ספקטרוסקופיה NMR 14. </li></ol> 6. בדיקות עקידת Glycopolymers סינטטי עם קטינים מצופים חרוזים agarose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1.5 מיליליטר של PBS 50 μl של השעיה של חרוזים Erythrina Crista-גאלי קטינים (ECL) -coated agarose, צנטריפוגה XG ב 300 דקות 1, ולהסיר בזהירות ולהשליך את supernatant. חזור על פעולה זו פעמיים, ולאחר מכן resuspend את החרוזים ב 0.5 מיליליטר של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מיקרוגרם של PMA-LAEMA-העמסה או PMA-GAEMA-והעמסת (שליטה שלילית) ב 6 μl של PBS להשעית חרוזים, דגירה התערובות, בחושך, בRT עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את התערובות עם 1.5 מיליליטר פעמים PBS שלוש, וחרוזים גלולים ב0.2 מיליליטר של PBS. לטעון aliquot (4 μl) לתוך באר בשקופיות מיקרוסקופ immunofluorescence (מצופה טפלון), מכסה בתלוש לכסות, ולהתבונן על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות מסנן FITC (אורך גל עירור: 467-498 ננומטר, אורך גל פליטה: 513- 566 ננומטר) ואובייקטיבי 10X לבחון את הכריכה של tהוא פלורסנט glycopolymers עם חרוזים 14. </li></ol>

<ol><li>Scharfman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+binds+to+neoglycoconjugates+bearing+mucin+carbohydrate+determinants+and+predominantly+to+sialyl-Lewis+x+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa binds to neoglycoconjugates bearing mucin carbohydrate determinants and predominantly to sialyl-Lewis x conjugates.</a> Glycobiology. 9 (8), 757-764 (1999).</li>
<li>Song, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+targeting+of+alveolar+macrophages+via+RAFT-based+glycopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In vivo targeting of alveolar macrophages via RAFT-based glycopolymers.</a> Biomaterials. 33 (28), 6889-6897 (2012).</li>
<li>Wolfenden, M. L., Cloninger, M. J. Chapter 14. Multivalency in carbohydrate binding. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWolfenden%2C+ML+%22Carbohydrate+Recognition%3A+Biological+Problems%2C+Methods%2C+and+Applications%22">Carbohydrate Recognition: Biological Problems, Methods, and Applications</a>. Wang, B., Boons, G. .-J. , John Wiley, & Sons, Inc., Chapter. 349-370 (2011).</li>
<li>Moad, G., Rizzardo, E., Thang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radical+addition-fragmentation+chemistry+in+polymer+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Radical addition-fragmentation chemistry in polymer synthesis.</a> Polymer. 49 (5), 1079-1131 (2007).</li>
<li>Spain, S. G., Gibson, M. I., Cameron, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+synthesis+of+well-defined+glycopolymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Polym.+Sci.%2C+Part+A%3A+Polym.+Chem%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the synthesis of well-defined glycopolymers.</a> J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. 45 (11), 2059-2072 (2007).</li>
<li>Bernard, J., Hao, X., Davis, T. P., Barner-Kowollik, C., Stenzel, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+various+glycopolymer+architectures+via+RAFT+polymerization%3A+From+block+copolymers+to+stars%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Synthesis of various glycopolymer architectures via RAFT polymerization: From block copolymers to stars.</a> Biomacromolecules. 7 (1), 232-238 (2006).</li>
<li>Bulmus, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAFT+polymerization+mediated+bioconjugation+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Polym.+Chem%22%5BJournal%5D)">RAFT polymerization mediated bioconjugation strategies.</a> Polym. Chem. 2, 1463-1472 (2011).</li>
<li>Ting, S. R. S., Chen, G., Stenzel, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+glycopolymers+and+their+multivalent+recognitions+with+lectins%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of glycopolymers and their multivalent recognitions with lectins.</a> Polymer Chemistry. 1, 1392-1412 (2010).</li>
<li>Vazquez-Dorbatt, V., Lee, J., Lin, E. W., Maynard, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+glycopolymers+by+controlled+radical+polymerization+techniques+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Synthesis of glycopolymers by controlled radical polymerization techniques and their applications.</a> Chembiochem. 13, 2478-2487 (2012).</li>
<li>Jiang, X., Ahmed, M., Deng, Z., Narain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylated+glyco-functionalized+quantum+dots%3A+Synthesis%2C+characterization%2C+and+cytotoxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Biotinylated glyco-functionalized quantum dots: Synthesis, characterization, and cytotoxicity studies.</a> Bioconjugate Chem. 20 (5), 994-1001 (2009).</li>
<li>Deng, Z., Li, S., Jiang, X., Narain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Well-defined+galactose-containing+multi-functional+copolymers+and+glyconanoparticles+for+biomolecular+recognition+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Well-defined galactose-containing multi-functional copolymers and glyconanoparticles for biomolecular recognition processes.</a> Macromolecules. 42 (17), 6393-6405 (2009).</li>
<li>Qin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galactosylated+N-2-hydroxypropyl+methacrylamide-b-N-3-guanidinopropyl+methacrylamide+block+copolymers+as+hepatocyte-targeting+gene+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Galactosylated N-2-hydroxypropyl methacrylamide-b-N-3-guanidinopropyl methacrylamide block copolymers as hepatocyte-targeting gene carriers.</a> Bioconjugate Chem. 22 (8), 1503-1512 (2011).</li>
<li>Albertin, L., Wolnik, A., Ghadban, A., Dubreuil, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+RAFT+polymerization+of+N-acryloylmorpholine%2C+synthesis+of+an+ABA+triblock+glycopolymer+and+study+of+its+self-association+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Aqueous RAFT polymerization of N-acryloylmorpholine, synthesis of an ABA triblock glycopolymer and study of its self-association behavior.</a> Macromol. Chem. Phys. 213 (17), 1768-1782 (2012).</li>
<li>Wang, W., Chance, D. L., Mossine, V. V., Mawhinney, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAFT-based+tri-component+fluorescent+glycopolymers%3A+synthesis%2C+characterization+and+application+in+lectin-mediated+bacterial+binding+study%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj.+J%22%5BJournal%5D)">RAFT-based tri-component fluorescent glycopolymers: synthesis, characterization and application in lectin-mediated bacterial binding study.</a> Glycoconj. J. 31 (2), 133-143 (2014).</li>
<li>Deng, Z., Ahmed, M., Narain, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+well-defined+glycopolymers+synthesized+via+the+reversible+addition+fragmentation+chain+transfer+process+in+aqueous+media%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Polymer+Sci.+Part+A%3A+Polym.+Chem%22%5BJournal%5D)">Novel well-defined glycopolymers synthesized via the reversible addition fragmentation chain transfer process in aqueous media.</a> J. Polymer Sci. Part A: Polym. Chem. 47 (2), 614-627 (2009).</li>
<li>Noel, S., Liberelle, B., Robitaille, L., De Crescenzo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+primary+amine+groups+available+for+subsequent+biofunctionalization+of+polymer+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantification of primary amine groups available for subsequent biofunctionalization of polymer surfaces.</a> Bioconjugate Chem. 22 (8), 1690-1699 (2011).</li>
<li>Biermann, C. J., McGinnis, G. D. Preparation of alditol acetates and their analysis by gas chromatography (GC) and mass spectrometry (MS). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFox%2C+A+%22Analysis+of+Carbohydrates+by+GLC+and+MS%22">Analysis of Carbohydrates by GLC and MS</a>. , CRC Press. 87-170 (1989).</li>
<li>Thomas, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+molecular+weight+control+of+the+polymerization+of+acrylamide+via+RAFT%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Kinetics and molecular weight control of the polymerization of acrylamide via RAFT.</a> Macromolecules. 37 (24), 8941-8950 (2004).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול קליל ויעיל לglycopolymers מבוסס רפסודה תלת-רכיב ניאון, עם ובלי פחמימות תליון, והשימוש בם במבחן מחייב קטינים, באו לידי הביטוי בדוח זה. הפרוטוקול מתחיל עם הכנת LAEMA glycomonomers וGAEMA. דרך copolymerization שליטת רפסודת צעד אחד, glycopolymers עם תשואה לשחזור, הרכב מונומר צפוי וdispersity הנמוך, מתקבל. בעקבות פוסט-שינוי של glycopolymers עם succinimidyl אסתר carboxyfluorescein, המחייב של glycopolymer שכותרתו הניאון המתאים וכתוצאה מכך הוא קושי הניתן לבדיקה לסגולית מחייב קטיניה. בשלבים הראשוניים של preparative glycomonomers שיועסקו בסינתזות glycopolymer לאחר מכן, חומצת lactobionic זמינה וgluconolactone נוצלו. בתאוריה, כל פחמימות של עניין, מmonosaccharides לאוליגוסכרידים המורכבים, יכולות להיות converteד לglycomonomers ידי conjugating סוכר היעד על קבוצת הידרוקסיל העיקרית על C6 של גלוקוז. בעקבות חמצון של שאריות גלוקוז צמצום, וההתייבשות הבאה שלה ללקטון, המוצר יכול להיות בקלות אז הגיב באמין הראשוני על AEMA כדי ליצור את glycomonomer המקביל. דוגמאות נוספות של מסלול זה ניתן לראות בדו&quot;ח האחרון 14. יש לציין כי לפני ביצוע כל צעד פילמור, MEHQ, מעכב פילמור חזק, יש להסיר מכל הכנות מונומר וglycomonomer רק לפני השימוש. המטרה זו מושגת בקלות על ידי שימוש בכמות המינימלית של מתנול לפזר glycomonomer שבעל MEHQ לאחר מכן לטפל באופן מיידי את זה עם אצטון ב -20 ° C כדי לזרז את המוצר ללא מעכב בתשואה גבוהה. חיוני בכל תכנית פילמור רדיקלית, תשומת לב לפרטים וpurities מונומר הם הדגישו. כאופייני למערכת פילמור רפסודה, זה מורכב ממקור קיצוני, מגיב רפסודה, מונומר וממס. במצגת דמיין זו, מערכת פילמור הרפסודה בשלב יחיד מתוארת המתמקדת בייצור של קופולימרים סטטיסטיים שנוצרו מתערובת תגובה בעל שלושה מונומרים שונים בתמיסה מימית. שתי תגובות בתיווך רפסודה נפרדות מוצגות בי אחד מנצלת glycomonomer שבעל תליון, שאינה תחנה סופית הפחתת פחמימות (כלומר, β-D-גלקטוז), והשני, בעל polyol עם שאריות לא פחמימות קשורות. משותף לשתי תגובות בתיווך הרפסודה היו מונומרים בעל קבוצת הידרוקסיל ייחודי המשמשת כמולקולת spacer, ועוד בעלי אמין בחינם לפוסט-שינוי עם fluorophore אמינו-reactive. מאז הנוכחות של חמצן בתערובת התגובה והסביבה פוגעת בפילמור תיווך רפסודה, הסרתה כדי לעקוב אחר הרמות מושגת בקלות באמצעות כמה הקפאה-אווהמחזורים אחר כך לידיד-הפשרה תוך שמירה על כלי תגובת צינור Schlenk תחת ואקום גבוה. יש לציין כי היחס טוחנת של מונומרים שונים בתגובה יכול להיות מותאם לפי צורך. כמו כן, על ידי שינוי כמות סוכן הרפסודה משמשת, אורכו של הפולימרים וכתוצאה מכך יכול להיות נשלט על 18. עם זאת, היחס טוחנת סוכן הרפסודה ליוזם תמיד צריך להיות גדול יותר משני להבטיח dispersity הנמוך של המוצר. בתנאים אלה, את האבולוציה של copolymerization היא יציבה, והשחזור של התגובה הוא גבוה מאוד. עם זאת, אין זה סביר שמתקבל התפלגות אחידה לחלוטין של כל מונומרים המשתתפים בקופולימר סטטיסטי, בשל מהירויות פילמור השונות שלהם. אפיון ההפצה של מונומרים שונים בתוך הפולימר הוא עדיין מאוד מאתגר. שיטת פוסט-השינוי, שהוצג כאן, היא שני amenabl הפשוט ויותרדואר לשימוש במגוון רחב יותר של תוויות ניאון, בהשוואה לפרוטוקולים אחרים להחיל glycopolymers תווית 2,11. אלה יכללו רבים של fluorophores האמין-reactive מסיס במים, נקודות קוונטיות, biotins, ואחרים. הם ספציפיות המחייבות של glycopolymers המסונתזת, שכותרתו לאימות בקלות באמצעות קטינים עם זיקות מחייבות ידועות. PMA-GAEMA בעל ללא סוכר תליון הוא שליטה שלילית מתאימה. Glycopolymers עם תוויות ניאון שונות שהוכנו באמצעות מסלול זה שימש בהצלחה בחקירות של קטינים בתיווך חיידקים מחייבים 14. כפי שהוצג, הכנה קלילה ויעילה זו של glycopolymers ניאון הסטטיסטי אמורה לספק פוטנציאל גדול למגוון רחב של מחקר glycobiological.

בשני העשורים האחרונים, חקירות עם glycopolymers הסינתטי עברו התפתחות איטית אך מתמשכת, מפגינות פוטנציאל משמעותי לבחינת מנגנוני זיהומיות הכוללים מחקר המתמקד בקטיני הכרת תהליכי 1-3. מאז glycopolymers הסינתטי בעל moieties סוכר multivalent תערוכה efficacies קטינים מחייבים הרבה יותר גבוה, בהשוואה לפחמימות חד ערכי, הם ביקוש גדול בתחום glycobiology 3. עניין מיוחד במחקר קליני הוא השימוש בglycopolymers ניאון כדי לאפיין את החיידקים בתיווך הקטינים מחייבים עם פחמימות זמינות על משטחים אנושיים נשימה תא וגליקופרוטאין הרירי. בתחילת לימודים חוץ גופית מועסק glycopolymers מבוסס polyacrylamide זמין מסחרי בבדיקות מחייבות חיידקים. כמה מבדיקות אלה הראו תוצאות מבטיחות, אך העלה חששות בנוגע ל, סטיות obtainability, והרבה-הרבה-בשני polמשקל מולקולרי Ymer ותוכן glycoepitope. פרוטוקול ובמעבדה חסכוני פותח אשר יספק לשליטה מספקת של תוכן מבנה, גודל, וטוהר glycopolymers הסינתטי מיקוד קטיני חיידקים. בחיפוש אחר גישה סינתטית מתאימה לglycopolymers, טכניקת פילמור חדשה יחסית נבדקה באמצעות סוג של פילמור הרדיקלי המבוקר שהעסיק בשרשרת העברה בנוסף פיצול הפיכה סוכנים (רפסודה) 4. לאחרונה ריאגנטים רפסודה כגון כבר בשימוש בכמה הכנות glycopolymer 5-7. בהשוואה לפרוטוקולי הכנת glycopolymer אחרים, polymerizations תיווך הרפסודה להפגין כמה יתרונות, כולל הסובלנות למגוון של מבני מונומר ותנאי תגובה, תאימות פוטנציאלית עם תמיסות מימיות, וdispersity גודל הנמוך של המוצרים פולימריים הרצויים 8,9. עניין בולט הם פרוטוקולים להכנת הרפסודה-baglycopolymers SED תלת-רכיב, המאפשר שליטה על יצירות של מונומרים שונים, כל אחד מהם עשוי להיות פונקציות שונות 10-13. עם זאת, רוב מאמצי מחקר הקודמים או חסר anomeric פחמימות תליון 10, או מועסק על צעד polymerizations וכתוצאה מכך קופולימרים תלת-בלוק, שמורכב מhomopolymers קשור קוולנטית, לעתים קרובות המשמשים למטרות שונות מפולימרים סטטיסטיים שקופולימרים בי הרצף של מונומר שאריות אחרי שלטון 9-13 סטטיסטי. לאחרונה, (חומצת 4-cyanopentanoic) העסקת מתחם רפסודת thiocarbonylthio -4-dithiobenzoate בסביבה מימית, ההכנה של קבוצת רפסודה מבוססת glycopolymers תלת-רכיב ליניארי הסטטיסטי המכיל סוכרים תליון ספציפיים ויישומם בחיידקים מחייבים בתיווך קטינים בדיקות דווחו 14. המטרה הכוללת של שיטה זו, שהוצגה באופן חזותי, היא להכין תלת-רכיבglycopolymers ניאון סטטיסטי באמצעות copolymerization שליטת רפסודה. בגלל הקלות של פרוטוקול פילמור צעד אחד, הבקרה הטובה על אורך הפולימר ויצירות, והשחזור הגבוה של התגובה, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם בקלות לסינתזות מבוססת רפסודה אחרות של glycopolymers עם מבנים המבוקשים.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><חזק>ריאגנט</חזק></td></tr><tr><td>חומצה לקטוביונית</td>, <td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>153516-D-גלוקונולקטון</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G2164</td><td></td></tr><tr><td>N-(2-הידרוקסיאתיל) אקרילאמיד (HEAA)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>697931</td><td></td></tr><tr><td>תפוז II מלח נתרן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>O8126</td><td></td></tr><tr><td>הידרוקינון מונומתיל אתר (MEHQ)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>54050</td><td>מעכב פילמור</td></tr><tr><td>N-(2-אמינואתיל) מתקרילאמיד הידרוכלוריד (AEMA)</td><td>Polysciences, Inc</td><td>24833-5</td><td></td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-616</td><td></td></tr><tr><td>שרף חילופי אניונים IRN-78 בצורת הידרוקסיד, 80 רשת</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10343-U</td><td></td></tr><tr><td>שרף חילופי קטיון 50Wx8, 200 רשת</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>217514</td><td></td></tr><tr><td>תחמוצת אלומיניום, ~150 רשת&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A1522</td><td>סוג WN-6, ניטרלי, דרגת פעילות סופר I</td></tr><tr><td>נינהידרין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>N4876</td><td>תמיסת אתנול של 0.2% נינהידרין שימשה בבדיקה</td></tr><tr><td>4-ציאנו-4-(פנילקרבונוטיואילתיו)חומצה פנטנואית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>722995</td><td>סוכן רפסודיה</td></tr><tr><td>4,4&פריים;-אזוביס (4-חומצה ציאנובלרית)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>11588</td><td>יוזם פילמור</td></tr><tr><td>קרבוקסיפלואורסצאין סוקסינימידיל אסטר&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Erythrina Cristagalli לקטין מצופה חרוז אגרוז</td><td>מעבדות וקטור</td><td>AL-1143&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Solvent</</td></tr><tr><td>strong>dH2O</td><td></td><td></td><td>מיוצר על ידי מערכת טיהור המים Barnstead, 18 megOhm-cm</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A461-4</td><td>ACS דרגה או טובה יותר</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td>ACS דרגה או טוב יותר</td></tr><tr><td>אתנול מוחלט</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-100</td><td>ACS דרגה או טובה יותר</td></tr><tr><td>Dimethylformamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22705</td><td>ACS דרגה או טובה יותר</td></tr><tr><td>אצטון</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A929-4</td><td>ACS דרגה או טוב יותר</td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>ציוד</חזק></td></tr><tr><td>ממברנת דיאליזה (MWCO: 3,500)</td> <td>Spectrum Labs</td><td>132720</td><td></td></tr><tr><td>פוליאתילן גליקול תקן אנליטי</td><td>סטנדרטי Sigma-Aldrich</td>צינור <td>O2393</td><td></td></tr><tr><td>שלנק, 1 מ"ל</td> זכוכית <td></td><td>קווארק</td><td>מותאם אישית</td></tr><tr><td>TSK-GEL G4000 PWxl&nbsp;</td><td>טוסו ביוסיינס&nbsp;</td><td>8022</td><td>משמש לניתוח GPC של הגליקופולימרים</td></tr><tr><td>Empower 3 עם חבילת GPC/SEC</td> מערכת <td>HPLC של Waters Corporation</td> Waters Alliance<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>תאגיד</td><td></td> ווטרס <td>מצויד בגלאי מקדם שבירה (ווטרס 2414) וגלאי פלואורסצנטי (ווטרס 2475)</td></tr><tr><td>Avance III ספקטרומטר NMR 800 מגה-הרץ</td><td>מיקרוסקופ</td> פלואורסצנטי Bruker Corporation <td></td><td></td></tr><tr><td>BX43</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>משמש עם מסנן FITC במבחן קשירת הגליקופולימר</td></tr><tr><td>Rotavap / Rotoevaporator</td><td>Heidolph</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fritted משפך דיסק</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>10-310-109</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer</td><td>Labconco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שקופית מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי</td><td>Polysciences</td><td>18357-1</td><td></td></tr><tr><td>Revco Ultima Plus -80&nbsp; &#176; C מקפיא</td> שקית ואקום <td>מפלסטיק תרמו סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ומשאבת יד</td><td>משאבת</td> ואקום ziploc<td></td><td></td></tr><tr><td>, כונן ישיר, מקסימה C פלוס</td><td>פישר מד</td> ואקום מדעי <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>סרג'נט-וולש</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הכנה קלילה ויעילה של glycopolymers פלורסנט tri-רכיב באמצעות פלמור שליטת רפסודה

Facile and Efficient Preparation of Tri-component Fluorescent Glycopolymers via RAFT-controlled Polymerization

glycopolymers סינטטי הם כלים אינסטרומנטליים ותכליתיים המשמשים בתחומי מחקר ביו-רפואיים ביוכימי ושונים. דוגמא לסינתזה קלילה ויעילה של glycopolymers הסטטיסטי ניאון מבוקר היטב באמצעות שרשרת העברה בנוסף פיצול הפיכה פילמור מבוסס (הרפסודה) הוא הוכיח. הסינתזה מתחילה בהכנת methacrylamide 2-lactobionamidoethyl מכיל β-גלקטוז-glycomonomer מתקבל על ידי תגובה של lactobionolactone וN - methacrylamide (2-aminoethyl) (AEMA). methacrylamide 2-Gluconamidoethyl (GAEMA) משמש כאנלוגי מבני חסר β-galactoside מסוף. תגובת copolymerization תיווך הרפסודה הבאה כרוכה בשלושה מונומרים שונים: N - acrylamide (2-hydroxyethyl) כspacer, AEMA כיעד לתיוג הקרינה נוסף, וglycomonomers. סובלני של מערכות מימיות, סוכן הרפסודה המשמש בתגובה הוא (חומצת 4-cyanopentanoic) -4-dithiobenzoate.dispersities נמוך (≤1.32), יצירות קופולימר צפויות, ושחזור גבוה של polymerizations נצפו בין המוצרים. פולימרים פלורסנט מתקבלים על ידי שינוי glycopolymers עם succinimidyl אסתר carboxyfluorescein מיקוד הקבוצות הפונקציונליות האמינים הראשוני על AEMA. ספציפיות קטינים מחייבות של glycopolymers כתוצאה מכך הם אומתו על ידי בדיקה עם חרוזים agarose מקביל מצופים בקטיני glycoepitope הכרה ספציפיים. בגלל הקלות של הסינתזה, השליטה ההדוקה של יצירות המוצר והשחזור הטוב של התגובה, פרוטוקול זה יכול להיות מתורגם להכנת glycopolymers מבוססת רפסודה אחרת עם מבנים וקומפוזיציות ספציפיים, כרצונכם.

סינתזה של glycomonomer חומצת Lactobionic שימשה במסמך זה כדוגמא להכנת glycomonomers. תוך שימוש בשיטות בדיווח הראשוני על הסינתזה של LAEMA 11, תשואות מגוונות בהכנה עם טוהר מספק נצפו. שיטת הטיהור שונה באמצעות שרפים קטיון וחילופי אניון להסיר חומר unreacted ההתחלה הציע תשואת מוצר יציבה וטוהר גבוה, אשר אושר על ידי H 1 ו- 13 ספקטרוסקופיה NMR C (איור 1). סינתזת glycopolymer רפסודה ופוסט-שינוי של glycopolymers עם fluorophores בניגוד לגוש-glycopolymers הכין דרך polymerizations הרפסודה יצא, פרוטוקול copolymerization צעד אחד זה מספק הפצת glycomonomer אחידה לאורך עמוד השדרה הפולימר. Glycopolymers מוצג כאן לכלול 20% mol של GLycomonomer, 77% mol של HEAA כspacer, ו -3% mol של AEMA כיעד לפוסט-שינויים (ראה איור 2). 1 H- ו -13 ספקטרוסקופיה C-NMR אישרו את המבנים של PMA-LAEMA וPMA-GAEMA (איורים 3 ו -4). כפי שניתן לראות בתרשים 5, כאשר זממו נגד פרופילי elution GPC של glycopolymer מסונתז ללא רפסודה, שני PMA-LAEMA וPMA-GAEMA יש dispersities נמוך, המוכיחים את יעילותה של גישת הרפסודה. כצפוי, יש PMA-GAEMA M קטן יותר מזה של n PMA-LAEMA בשל החוסר של PMA-GAEMA של סוכר תליון. ניתוח של הפחמימות וקבוצות פונקציונליות אמין ראשוני תוכן של glycopolymers הרפסודה גילה כי היחס של מונומרים בglycopolymers המוצר עולה בקנה אחד עם יחס stoichiometric של החל מונומרים מועסקים בתגובה בתיווך הרפסודה פילמור (טבלת 1). זה מסמל שליטה הדוקה של Compositio מונומרNS בglycopolymers המסונתזת, כפי שתוכנן. תגובה של קבוצות פונקציונליות האמינים ראשוני עם fluorophores מופעלת היא טכניקה בשימוש נרחב בתיוג חלבון. טכניקה זו הועסקה כאן כדי לתייג glycopolymers המטוהר עם carboxyfluorescein. בעקבות הודעה שינוי-, פולימרים ניאון התקבלו (איור 6). אין השפלה של הפולימרים שכותרתו והעמסת בתגובה זוהתה על ידי ניתוח GPC (מידע לא מוצג). כריכת בדיקות של glycopolymers הסינתטי עם חרוזים agarose מצופה קטינים כדי להעריך את הספציפיות מחייבים קטינים של glycopolymers המסונתזת, חרוזים agarose קטינים מצופה עם סגוליות מחייבות פחמימות ידועות היה בשימוש קטינים. Erythrina Crista-גאלי (ECL), שהועסקו בניסויים, יש סגוליות מחייב כלפי β-D-galactoside. איור 7 א ממחיש באופן ברור כי PMA-LAEMA-פלורידהuorescein, המכיל β-D galactoside-כפחמימות תליון, הציג חזק מחייב עם קטיני ECL. לעומת זאת, השלילי מחייב ECL של PMA-GAEMA-העמסת glycopolymer, שאינו בעלי סוכר תליון, מוצג באיור 7. תוצאה זו מדגימה את היעילות וזיקה המחייבות של glycopolymer הניאון המסונתזת. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52922/52922fig1.jpg" /> איור 1. מוקצה 1 H- (א) ו- 13 C-NMR (ב) ספקטרום (D 2 O) לLAEMA. (נתון זה שונה מואנג et al. 14) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דמות.</a> &lt;p class = &quot;jove_content&quot; FO: לשמור-together.within עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52922/52922fig2.jpg" /> איור 2. איור סכמטי של הסינתזה של glycopolymer ניאון PMA-LAEMA מכיל β-galactoside כסוכר התליון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52922/52922fig3.jpg" /> איור 3. מוקצה H- () ו -13 C-NMR ספקטרום (ב) (ד 2 O) לglycopolymer PMA-LAEMA. 1 (נתון זה שונה מואנג et al. 14) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig3large.jpg" target="_blank">טיעון</a>se לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52922/52922fig4.jpg" /> איור 4. מוקצה 1 H- () ו -13 C-NMR ספקטרום (ב) (ד 2 O) לPMA-GAEMA. (נתון זה שונה מואנג et al. 14) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52922/52922fig5.jpg" /> 5. עקבות כרומטוגרפיה חלחול ג&#39;ל איור של PMA-GAEMA וPMA-LAEMA מבוססי רפסודה מוכנה עם וללא שימוש בסוכן רפסודה. בניגוד לPMA-LAEMA הוכן ללא רפסודת סוכן (כחול), RAFT-<html> PMA-LAEMA מבוסס (ירוקה) יש dispersity נמוך בהרבה (M w / n M). מבוסס רפסודת PMA-GAEMA (אדום) וPMA-LAEMA יש פרופילי GPC דומים, אבל יש לי לשעבר n M קטן יותר בשל העדר סוכרים תליון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52922/52922fig6.jpg" /> איור 6. PMA-LAEMA לפני ואחרי פוסט-שינוי עם fluorophore. (א) בהשוואה לglycopolymer הלבן שכותרתו אינו (צינור שמאלי), שכותרתו והעמסת PMA-LAEMA תערוכות צבע חזק צהוב (צינור מימין). (ב) תחת UV, PMA-LAEMA שאינו מסומן (צינור שמאלי, 1 מ&quot;ג / מיליליטר PBS) הוא כהה ומציג ללא הקרינה, ואילו PMA-LAEMA כותרת והעמסת (צינור תקין, 1 מ&quot;ג / מיליליטר PBS) מופעים הקרינה ירוקה חזקה.: &quot;Target =&quot; _ //www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/52922/52922fig7.jpg" /> איור 7. קטיני Crista-גאלי Erythrina חרוזים agarose (ECL) -coated לאגד β-D-galactoside מכיל glycopolymers, ולא אלה לא בעל סוכר תליון. () PMA-LAEMA-והעמסת (3 מיקרוגרם) הפגינה חזקה מחייבת עם ECL , ואילו ב( ב) PMA-GAEMA-והעמסת, אשר ברשותה שום שאריות התליון β-D-galactoside, לא הראה שום מחייב עם חרוזים מצופים קטינים. בר סולם = 100 מיקרומטר. טבלת 1. ערכי מיקוד של פרמטרים סינטטיים ויצירות בפועל של glycopolymers.) מיקוד ערכים, ערכים שהם רצויים של המוצרים; ב) DP, תואר של פילמור; ג) NA, אינו זמין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52922/52922fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody style="vertical-align:middle;text-align:center"><tr><td style="width:120px"></td><td style="width:40px"> DP ב </td><td style="width:70px"> Dispersity </td><td style="width:120px"> תוכן ממשי של glycomonomers % Mol </td><td> תוכן ממשי של אמין ראשוני % Mol </td></tr><tr><td> מיקוד ערכים </td><td> 100 </td><td> &lt;1.3 </td><td> 20 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> PMA-LAEMA </td><td> 99 </td><td> 1.26 </td><td> 19 </td><td> 3.2 </td></tr><tr><td> PMA-GAEMA </td><td> 89 </td><td> 1.32 </td><td> NA ג </td><td> 2.7 </td></tr></tbody></table>

מודגמת סינתזה יעילה בת שלושה שלבים של גליקופולימרים פלואורסצנטיים מבוססי RAFT, המורכבת מהכנת גליקומונומר, קופולימריזציה ופוסט-שינוי. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה להכנת גליקופולימרים סטטיסטיים מבוססי RAFT עם מבנים רצויים.

הכנה קלילה ויעילה של Glycopolymers פלורסנט Tri-רכיב באמצעות פלמור שליטת רפסודה

Synthetic glycopolymers are instrumental and versatile tools used in various biochemical and biomedical research fields. An example of a facile and ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא סינתזה מבוקרת היטב של פולימרים גליקואים לינאריים סטטיסטיים פלואורסצנטיים באמצעות פולימריזציה מסוג RAFT (reversible addition fragmentation chain transfer). דבר זה מושג תחילה על ידי סינתזה של הגליקו-מונומר 2-lactobioethyl methacrylamide, או L-A-E-M-A. השלב השני הוא שימוש בפולימריזציית RAFT של L-A-E-M-A, N-(2-aminoethyl) methacrylamide, או AEMA, ו-N-(2-hydroxyethyl) acrylamide, או HEAA, כדי לסנתז את הפולימר הגליקואי בעל הדיספרסיות הנמוכה המתאימה.בשלב הבא, הפולימר הגליקני עובר מודיפיקציה באחד מאמיני הראשוניים שלו על ידי תגובה עם carboxy fluorescein xito middle ester כדי להפיק פולימר גליקני מסומן ב-fluorescein. השלב הסופי הוא קישור הפולימר הגליקני המסומן ב-fluorescein לחרוזי agarose מצופים בלקטין בעל ספיציפיות ידועה לקישור פחמימות. לבסוף, נעשה שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לנתח את קישור הפולימרים הגליקניים לחרוזי ה-agarose, ובכך לאשר שהפולימר הגליקני מכיל את הפחמימה המבוקשת ומסומן בתג פלואורסצנטי.היתרון של פולימריזציית RAF על פני שיטות קיימות המשתמשות בפולימריזציות רדיקליות חופשיות קונבנציונליות הוא שתהליך זה הוא טכניקת פולימריזציה מבוקרת הממזערת את מספר השרשראות הגזורות מהיוזם. התוצאה היא פולימרים בעלי משקלים מולקולריים שנקבעו מראש ומדד פולי-דיספרסיביות צר מאוד. ניתן להחיל פולימריזציות אלו על תערובת מוגדרת של מונומרים להכנת גליקו-פולימרים פלואורסצנטיים ספציפיים.לפולימרים גליקואים אלו יש יכולות קישור מוגדרות שניתן לאמת באמצעות חרוצים מצופים בלקטין. הכנה יעילה של פולימרים גליקואים פלואורסצנטיים צפויה להיות בעלת ערך רב למחקרי גליקו-ביולוגיה בעתיד. כדי להתחיל, המסס שני גרם של lactobionic acid ב-3 ml של methanol ללא מים (anhydrous methanol).בשלב הבא, הוסיפו באיטיות ובטיפות אתנול מוחלט לתמיסה עד שזו תהפוך לעכורה. השתמשו במאדה סיבובי (rotary evaporator) כדי להסיר את כל הממסים. חזרו על תהליך זה שלוש פעמים כדי להפיק 1.94 גרם של lacto bioo one five lactone בנצילות של 98%.הוסף תמיסה של גרם אחד של lacto bio lactone בשלושה מיליליטרים של methanol לתמיסה של A EMA ו-MEHQ בשני מיליליטרים של methanol. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של triethylamine וערבב את התערובת בטמפרטורת החדר. לאחר 48 שעות, הוסף 20 מיליליטרים של מים דה-יוניים לתערובת והעבר אותה למאדה סיבוב (rotary evaporator).אדו את הנוזל עד לייבוש מלא. המיס את השארית ב-20 milliliters של מים דה-יוניים והעבר את התמיסה לחלקו העליון של עמודת חילוף אניונים בגודל 10 על 20 millimeter. הנח ביקר המכיל מיליגרם אחד של MEHQ מתחת לפתח היציאה ובצע אלוציה מהעמודה אל תוך הביקר.לאחר סחיטת התמיסה במאיד סיבובי (rotary evaporator), המיסו את השארית ב-20 מיליליטר של מים דה-יוניים והוסיפו מנות של מיליגרם אחד של שרף חילופי יונים. המשיכו כך עד לבדיקה שלילית לנוכחות מים, המבוצעת על ידי הסרת מיקרוליטר אחד של התמיסה והחלתה על פלטת כרומטוגרפיה בשכבה דקה. רססו את הפלטה בתמיסת 2% anhy באתנול וחממו בטמפרטורה של 90 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת על פלטה מחממת.נקודת הסיום הושגה כאשר לא נוצר צבע כחול. לאחר מכן, סננו את התמיסה דרך משפך זכוכית נקבובית לתוך מבחנה. הקפיאו את התמיסה בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס ולאחר מכן העבירו אותה לליופיליזר לייבוש בהקפאה.המס את השארית בכמות מינימלית של methanol ושקיע את המוצר על ידי הוספה בטמפרטורה של 20- degrees Celsius ו-anhydrous acetone. אסוף את ה-L-A-E-M-A המשקע באמצעות סינון דרך משפך זכוכית פריט. העבר את המשפך ואת המשקע למייבש בוואקום לייבוש, תחילה ב-0.5 grams של nanopaticles של aluminum oxide בריכוז של כ-150 mesh לכל one milliliter של HEAA בדרגת מסחר בתוך מבחנה של two milliliters.סבב את המבחנה בצנטריפוגה ב-300 ×g למשך 30 שניות והשתמש בשכבה העליונה כ-HEAA נקי ממעכבים. המס בזהירות 32.8 milligrams של L-A-E-M-A, 1.7 milligrams של a EMA, 27.5 µL של HEAA נקי ממעכבים ו-0.4 mL של מים דאיוניים, והעבר את התמיסה למבחנת פלאנק של 1 mL שנוקתה היטב. לאחר מכן, הוסף למבחנה 50 µL של ריאגנט RAFT ו-50 µL של ריאגנט יוזם (initiator), וערבב על ידי תיפוף עדין של דופן המבחנה כאשר השסתום סגור. חבר את המבחנה לקו ואקום והקפא את התכולה באמצעות אמבט של אתנול וקרח יבש.לאחר מכן, הפחית את הלחץ במבחנה לשאיפה של 50 millitorr באמצעות משאבה וסגור את השסתום. הסר את אמבט הקרח היבש ואפשר לתכולה להפשיר. חזור על מחזור ההקפאה, הריקון וההפשרה פעמיים נוספות בזהירות.בדקו את המבחנה כדי לוודא שהתכנים מומסים לחלוטין, ובצעו וורטקס עדין במידת הצורך. לפני ההנחה, הוציאו את המבחנה הסגורה מקו הוואקום והכניסו אותה לתוך שקית ואקום שקופה מפלסטיק. שאבו את האוויר מהשקית באמצעות משאבה ידנית מפלסטיק.לאחר מכן, הניחו את השקית במקלחית מים מכוסה בטמפרטורה של 70 °C למשך 24 שעות. בשלב הבא, הוציאו את המבחנה מהשקית והעבירו את תכולתה לשקית דיאליזה עם סף משקל מולקולרי של 3,500 Daltons. הניחו את שקית הדיאליזה בכלי ביקר ובצעו דיאליזה כנגד שני ליטרים של מים דאיוניים למשך 24 שעות.העבירו את תכולת שקית הדיאליזה למבחנה והניחו אותה במקפיא בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. לאחר ההקפאה, העבירו לליופיליזר ובצעו ייבוש בהקפאה. כדי לקבל את פולימר הגליקו PMA LA EMA הלבן והפרויי, הכינו תחילה תמיסה של 5 mg של PMA LA EMA ב-0.9 mL של PBS.בשלב הבא, הוסיפו באיטיות 0.6 milligrams של carboxy fluorescein cin, middle eter ב-100 µL של dimethylformamide לתמיסה הנערבבת במהירות, סגרו את המיקרו-מבחנה בנייר אלומיניום, וערבבו באיטיות במשך 16 שעות בטמפרטורת החדר. העבירו את התמיסה לשק דיאליזה עם סף משקל מולקולרי של 3,500 Daltons. הניחו את השק בתוך כלי כימי ובצעו דיאליזה כנגד שני ליטרים של מים דה-יוניים במשך 16 שעות, תוך שמירה על הגנה מהאור. העבירו את תכולת שק הדיאליזה למבחנה.לאחר הקפאת התמיסה בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס, בצעו lyophilization. כדי לקבל את ה-P-M-A-L-A-E-M-A, פולימר גליקו מסומן פלואורסצנטי בצבע צהוב ובעל מרקם פתוח, קבעו את המשקל המולקולרי הממוצע המספרי, המשקל המולקולרי הממוצע המשקלי ואת הדיספרסיות של פולימרי הגליקו באמצעות מערכת HPLC. ראשית, הוסיפו 1.5 milliliters של PBS לסוספנזיה של 50 microliter של aro beads מצופים ב-ery Krista galley lectin בתוך מבחנה לצנטריפוגה.לאחר מכן, סבבו את המבחנה בצנטריפוגה ב-300 ×g למשך דקה אחת. לאחר מכן, השליכו את הנוזל העליון וחזרו על השטיפה פעמיים נוספות, לפני שתוסיפו לבסוף 0.5 milliliters של PBS. הוסיפו למבחנה המכילה את החרוזיים המצופים בלקטין תמיסה של שלושה micrograms של PMA LA EMA המסומן בפלואורסצאין בתוך 6 µL של PBS.השתמש ב-P-M-A-G-A-E-M-A המסומן בفلואורסצאין כביקורת שלילית. לאחר מכן, עטוף את המבחנות בנייר אלומיניום והדגס אותן בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. סבב את המבחנה בצנטריפוגה למשך דקה אחת והסר את הנוזל העליון.לאחר מכן, השהו שוב את החרוזיים ב-1.5 milliliters של PBS טרי וחזרו על השטיפה שלוש פעמים. לבסוף, השהו שוב את החרוזיים ב-0.2 milliliters של PBS. העבירו ארבעה µL מהחרוזיים המושהים לבאר של מיקרוסקופ פלואורסצנציה עקיפה. השתמשו בזהירה ובכיסוי זכוכית לצורך רישום.תמונות של הפיתח באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד בעדשה אובייקטיבית 10x, מסנן FITC ומצלמה. הפולימרים הגליקניים נותחו באמצעות כרומטוגרפיה של חדירה בגל (gel permeation chromatography). פולימרים שסונתזו ללא שימוש ב-raft הם בעלי דספרסיות גבוהה בהרבה מאלה שהוכנו באמצעות raft.כאשר מסומן בפלואורסצאין, המראה הפיזי של הגליקו-פולימר משתנה מלבן לצבע צהוב עז הנראה תחת תאורת UV. תמיסה של פולימר שאינו מסומן נשארת כהה, בעוד שהפולימר המסומן בפלואורסצאין זוהר בירוק בהיר, מה שמאשר את נוכחות הסימון. קישור ספציפי לחרוזיים מצופים בלקטין מתרחש רק עם פולימרים הנושאים שאריות סוכר תלויות; החרוזיים זוהרים בירוק כאשר הם קשורים, בעוד שהם נשארים כהים כאשר הם מטופלים בפולימרים חסרי שאריות סוכר תלויות. טכניקת פולימריזציה זו, המבוססת על רפטים (raft), מאפשרת גמישות רבה בסוג הגליקו-פולימרים שניתן לסנתז.ניתן לבצע סימון מאוחר של הגליקו-פולימרים גם באמצעות מגוון רחב של ריאגנטים פלואורסצנטיים, המסוגלים להגיב עם קבוצות ראשוניות בסביבה מימית. חוקרים בתחום הגליקו-ביולוגיה יכולים להשתמש בטכניקה זו כדי להפיק בקלות גליקו-פולימרים מוגדרים ורב-גוניים ביותר. גליקו-פולימרים אלה יכולים לשמש ככלים לבחינת ספציפיות של קישור פחמימות, כגון אלו שנצפו בדרכי הנשימה של חולי סיסטיק פיברוזיס או אלו המעורבים בסוגים רבים של סרטני בני אדם.

facile-efficient-preparation-tri-component-fluorescent-glycopolymers

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

כאן אנו מתארים אסטרטגיה ייחודית ליצירת מטריצות ביולוגיות, שכבתיות עם ממשקים רציפים בין שכבות שונות להנדסת רקמות. כגון פיגום יכול לספק סביבה להתאמה אידיאלית לתא לווסת את התנהגות על ידי רמזים ביולוגיים, כימי או מכאניים...

שיפוע צפיפות רבה שכבתי פלמור (DGMP): שיטה חדשנית ליצירת תא בעל מספר, פיגומים להנדסת רקמות להתאמה אישית

המעבדה שלנו פיתחה הידרוג-crosslinked DNA polyacrylamide, מערכת הידרוג'ל דינמית, כדי להבין טוב יותר את ההשפעות של ויסות רקמות נוקשות על תפקוד תא. כאן, אנו מספקים שרטוטים, תיאור, ופרוטוקולים להכנת הידרוג אלה.

הכנת-crosslinked DNA polyacrylamide הידרוג

אנו מציגים פרוטוקול ליצירה מהירה של שלפוחיות פולימר ענקיות (pGVs). בקצרה, תמיסות פולימריות מיובשות על סרטי אגרוז מיובשים המודבקים לכיסויים. התייבשות מחדש של סרטי הפולימר גורמת להיווצרות מהירה של pGVs. שיטה זו מקדמת מאוד את הכנת שלפוחיות ענק סינתטיות ליישומים ישירים במחקרים ביומימטיים.

פורמינג Polymersomes ענק בגודל שימוש Rehydration ג&#39;ל בסיוע

מאמר זה מתאר תהליך לייצור ננו-חלקיקים פולימריים בהרכבה עצמית באמצעות פילמור פיזור בתיווך אור נראה. שימוש באור נראה באנרגיה נמוכה לשליטה בפילמור מאפשר היווצרות ניתנת לשחזור של מיצלות דמויות תולעת בהרכבה עצמית בתכולת מוצקים גבוהה.

סינתזה קלילה של Micelles תולעת דמוית ידי גלוי אור מתווכת פילמור נפיצה שימוש Photoredox Catalyst

פילמור ממטרים ללא עוררה מספק גישה אבי טיפוס ודגמים, לשחזור לסינתזה של פולי גירויים רגיש (-isopropylacrylamide N) microgels של התפלגות גודל הצרה. בסינתזה בפרוטוקול זה, אפיון פיזור אור ומעקב קרינת חלקיק בודד של microgels אלה או בהתקנה של מיקרוסקופיה רחב בתחום הם הפגינו.

סינתזה מבוקרת מעקב הקרינה של פולי אחיד מאוד (<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide) Microgels

אנו מציגים פרוטוקול לסינתזה של הידרוג'לים מתפקדים RGD כמכשירים להעברת תאים ותרופות. ההליך כולל תוספת ציקלו-אזיד אלקין-אזיד מזורזת נחושת (CuAAC) בין חומצה פוליאקרילית ששונה באלקין (PAA) ונגזרת RGD-אזיד. ההידרוג'לים נוצרים באמצעות עיבוי בסיוע מיקרוגל ונחקרים תכונותיהם הפיזיקוכימיות.

הסינתזה של RGD פונקציונלית הידרוג ככלי יישומים טיפוליים

פרוטוקולים מתוארים להרכבת מתכלה thermoresponsive hydrogels מבוסס על hydrazone cross-linking של oligomers פולימריים על הסולם בתפזורת, microscale, ו ננו, והשני עבור הכנת ג'ל חלקיקים והן nanofibers.

בדיית Thermoresponsive Hydrogels מתכלה-פיסיקליות מרובים באמצעות שחול תגובתי, מיקרופלואידיקה, הרכבה עצמית, Electrospinning

פרוטוקול עבור הסינתזה והאפיון של תנועת diffusive של פולימרים מחזוריים ברמת המולקולה הבודדה מוצג.

סינתזה של מחזורי פולימרי אפיון Motion הפעפוע שלהם במדינת הממסים ברמת המולקולה הבודדה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכין ולדמיין מבנים משניים (כגון סיבים, ארכיטקטורות טבעתיות, ו-תחומי ננו) נגזרים polycarbodiimides סליל. מורפולוגיה מאופיין הן במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) הוצגה תלוי המבנה המולקולרי, ריכוז, ואת ממס של בחירה.

מורפולוגיה הרכבה עצמיות המתקבלות סליל Polycarbodiimide קופולימרים ונגזר triazole שלהם

מוטות מיקרוג'ל עם קבוצות תגובתיות משלימות מיוצרים באמצעות מיקרופלואידיקה עם היכולת להתחבר בתמיסה מימית. המיקרוג'לים האניזומטריים נתקעים ומתחברים למבנים יציבים עם נקבוביות גדולות יותר בהשוואה למערכות מבוססות כדוריות. מיקרו-ג'לים שעברו שינוי עם GRGDS-PC יוצרים מבנים תלת-ממדיים מקרו-נקבוביים שיכולים לשמש לתרבית תאים.

פיגומים תלת-ממדיים מקרו-נקבוביים משולבים ממוטות מיקרוג'ל

למד סינתזה של גליקופולימרים פלואורסצנטיים בשליטת RAFT לחקר גליקוביולוגיה. שיטה זו מייצרת פולימרים עם פיזור נמוך ותכונות קשירה ספציפיות ללקטינים.

הכנה קלילה ויעילה של Glycopolymers פלורסנט Tri-רכיב באמצעות פלמור שליטת רפסודה

גלה סרטונים נוספים