הכנת תיאום מאוד נקבובי פולימר ציפויים על מונוליתים פולימר Macroporous להעשרה משופרת של Phosphopeptides

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להכין חומר תומך חדשני עם ביצועים משופרים במיצוי סלקטיבי של פפטידי פוספו. זה מושג על ידי הכנה נכונה של מונוליט נימי פולימרי נקבובי עם קבוצות פונקציונליות מתאימות. ראשית, מין מתכת משותק על הקבוצות הפונקציונליות של מונוליט פולימרי, מה שהופך את התמיכה לסלקטיבית למיצוי של פפטידים פוספו.

בשלב הבא מתבצעת צמיחה שלב אחר שלב של שכבות מרובות של המסגרת האורגנית המתכתית על מנת להגדיל את כמות אתרי המתכת, ובכך להגדיל את הסלקטיביות עבור פפטידי פוספו. התוצאות מראות סלקטיביות משופרת למיצוי פפטידי פוספו מעכלי חלבון המבוססים על יינון ספיגה בלייזר בעזרת מטריצה, ספקטרומטריית מסה של זמן טיסה. העשרת פפטיד O נעשית בדרך כלל על ידי כרומטוגרפיה של זיקה של אריה מתכת, המבוצעת על חלקיקי סיליקה קונבנציונליים או חלקיקי פולימר, הארוזים בעמודה כרומטוגרפית.

החומר שלנו משלב את היתרונות של מונוליט פולימרי מקרופורוסי, בעל תכונות הובלת מסה טובות עם יכולת קשירה גבוהה של מסגרת אורגנית מתכתית. הדרך בה אנו משיגים זאת היא על ידי גידול רציף של המסגרת האורגנית המתכתית מפני השטח של המונוליט כך שבסופו של דבר יש לנו שכבות מרובות של קווי מתכת הזמינים לאינטראקציה עם האנליט הדגמה חזותית של הכנת המונוליט הפולימרי וצמיחת המסגרת האורגנית המתכתית חשובים שניהם מכיוון שקשה מאוד ללמוד אותם. ישנם מספר שלבים חשובים שצריך לשים לב אליהם על מנת להשיג מונוליט בעל תכונות משטח טובות ונקבוביות.

כדי להתחיל, חותכים שני מטרים של נימי סיליקה התמזגו המצופים פוליאמיד ובקוטר פנימי של 100 מיקרון המחוברים למזרק זכוכית נקודתי של 25 מיליליטר ושוטפים את הנימים באצטון. לאחר מכן הסר את האצטון על ידי שטיפת הנימים במים. לאחר מכן, הניחו מזרק זכוכית של 250 מיקרוליטר מלא בנתרן הידרוקסיד מימי של 0.2 מולארי על משאבת המזרק והזרימו את התמיסה בנקודה של 25 מיקרוליטר לדקה דרך הנימים למשך 30 דקות על מנת להפעיל את ציפוי הסיליקה הפנימי.

לאחר 30 דקות יש לשטוף את הנימים במים עד שהקולחין ניטרלי. השתמש ברצועות pH מנייר כדי לאמת את זרימת ה-pH הנייטרלית. לאחר מכן העמיס למזרק עם 0.2 מימן כלורי מימי מולרי ושאב את התמיסה דרך הנימים בנקודה 25 מיקרוליטר לדקה כדי לפרוטונציה של קבוצות הסיול לאחר 30 דקות של זרימה, שוב, שטפו את הנימים במים עד שהזרימה ניטרלית.

לאחר שה-pH ניטרלי, שטפו את הנימים במזרק של 250 מיקרוליטר מלא באתנול 100%. לאחר מכן שאבו תמיסה של 20% של שלושה טרימתיל פרופיל מתאקרילט באתנול בנקודה של 25 מיקרוליטר לדקה למשך שעה כדי לתפקד את פני השטח עם קבוצות ויניל. לאחר מכן, שטפו את הנימים באצטון ואז יבשו אותם בזרם חנקן.

הניחו לדגימות לנוח בטמפרטורת החדר למשך הלילה, ולאחר מכן חתכו אותן לחלקים באורך 20 סנטימטר. הכן את תערובת הפילמור בבקבוקון זכוכית של מיליליטר אחד עם מחיצת גומי כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. הוסף 1%A IBN ביחס למונומרים כיוזם וסוניקציה של התערובת למשך 10 דקות.

לאחר מכן, חבר נימי סיליקה לא פונקציונליים לזרם חנקן והכניסו אותו דרך מחיצת הגומי לתערובת הפילמור. שחררו מעט את מכסה הבקבוקון ובעבעו לאט חנקן דרך התערובת למשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, הרם את נימי זרם החנקן מתערובת הפילמור לחלל הראש של הבקבוקון וסגור את המכסה בחוזקה.

הכנס את אחד הנימים הפונקציונליים דרך המחיצה לתערובת הפילמור. השתמש בעודף הלחץ שנוצר על ידי החנקן כדי לשאוב את תערובת הפילמור למעלה לתוך הנימים הפונקציונליים. אפשר לכמה טיפות מתערובת הפילמור לזרום משפכי הנימים כדי להבטיח שהיא מתמלאת לחלוטין, ואז לסגור אותה עם מחיצת גומי.

הוציאו את הנימים מהבקבוקון בזהירות רבה וסגרו את הכניסה בעזרת מחיצת גומי, הניחו תערובת הכלולה בנימים באמבט מים מחומם בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך שש שעות לפילמור. בסיום, מצננים את הנימים לטמפרטורת החדר ואז חותכים כמה מילימטרים משני קצוות הנימים. לאחר מכן, השתמש במשאבת HPLC כדי לשטוף את העמוד באצטוניטריל בארבעה מיקרוליטר לדקה למשך 30 דקות.

זה יסיר כל מונומרים לא מגיבים וחומרי יצירה גרועים. בדוק את הלחץ האחורי של עמוד הנימים. לאחר מכן, שטפו את המונוליט הנימי במחזורים עם הריאגנטים המוצגים כאן כדי לגדל את הציפוי האורגני המתכתי הסופי.

עובי הציפוי נקבע על פי מספר המחזורים שבוצעו. שטפו את הנימים בציפוי המתכת האורגני המוכן באמצעות 100 מיקרוליטר של תערובת של ארבעה לאחד של ניסוי אצטוניד וחומצה אצטית טריור מימית 0.1%. לאחר מכן יש לשאוב עיכול חלבון דרך העמודה במהירות של שני מיקרוליטר לדקה.

במשך 30 דקות, שטפו שוב את הפפטידים הלא זרחניים עם תערובת של ארבעה לאחד של ניסוי אצטיל NI וחומצה אצטית Tri Fluor מימית 0.1% למשך 10 דקות בקצב זרימה של מיקרוליטר אחד לדקה. שוטפים במים למשך 10 דקות בקצב זרימה של מיקרוליטר אחד לדקה. יש לסלק את פפטידי הפוספו באמצעות תמיסת חיץ פוספט של 250 מיקרו-מולרית ב-pH 7 על ידי שאיבתה דרך הנימים במיקרוליטר אחד לדקה למשך 15 דקות, לאסוף את ה-ellu בבקבוקון ולהמליח את התמיסה באמצעות פרוטוקול סטנדרטי.

לאחר מכן, הכינו תמיסה של שני מיליגרם למיליליטר של שתי חומצה בנזואית דיהידרוקסית במתנול, וערבבו שני מיקרוליטר של תמיסה זו עם שני מיקרוליטרים של תמיסת פפטיד הפוספו הנרמזת. בתוך קצה פיפט אתר את התערובת הזו ישירות על צלחת יינון הספיגה בלייזר בעזרת מטריצה, ואפשר למקום להתייבש לחלוטין. נתח את הכתמים על ידי יינון לייזר בסיוע מטריצה זמן יינון של ספקטרומטריית מסה טיסה לבסוף מחדש את העמודה על ידי שטיפה יסודית במים, ואחריה נימי מתנול ששונו בשכבות מרובות של ברזל זמין.

שלוש קבוצות אידיאליות לשימוש בכרומטוגרפיה של זיקה ליוני מתכת משותקים המוצגות כאן הן ספקטרום המתקבל מחלבונים מעוכלים לפני ואחרי העשרה, המראה סלקטיביות יוצאת דופן עבור 12 פפטידים שונים של פוספו. ניסויי אפיון מייצגים מספקים מידע רב ערך על הופעתן של נקבוביות חדשות. הנה תמונה של מונוליט אבקה בתפזורת לאחר 30 מחזורי פולימר קואורדינציה נקבוביים המכונים מחזורי PCP באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

לאחר 30 מחזורי PCP, גודל רוחב הנקבוביות בחומר נמצא בקוטר של פחות משלושה ננומטר בהשוואה לפולימר בתפזורת. להכלאה יש כמות גדולה של שטח מצטבר עם נקבוביות קטנות. זה מוביל לעלייה בספיגת החנקן באמצעות מגוון לחצים באמצעות ספקטרוסקופיה אינפרא אדום של טרנספורמציה פורייה.

השילוב הראשוני של הקבוצות הפונקציונליות הקרבוקסיליות נראה לעין, כמו גם צמיחת הציפוי לאחר 10, 20 ו -30 מחזורי PCP. לבסוף, נעשה שימוש בניתוח תרמו-גרבימטרי כדי למדוד את כמות אתרי המתכת הנוספים שהצטברו בכל מחזור. מוצג כאן ניתוח גרבימטרי באמצעות טווח טמפרטורות, המאשר את נוכחותם של מספר מוגבר של אתרי מתכת עם מספר מחזור מוגבר.

בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לפתח הליך דומה עבור מרכזי מתכת שונים בליגנדים אורגניים על מנת למקד הפרדות יעילות של אנליטים שונים על סמך זיקתם למסגרת מסוימת. אני מאמין שחומרים מרוכבים כמו שלנו המשלבים פולימרים מקרו-נקבוביים עם מסגרות אורגניות מתכתיות טומנים בחובם הבטחה גדולה בתחום מדע ההפרדה מכיוון שהם יכולים לשפר במידה ניכרת את יכולת קשירת הסלקטיביות ואת היעילות הכוללת של הפרידות, הן בקנה מידה אנליטי והן בקנה מידה מכין.