Name: בידוד ואפיון של נויטרופילים עם תכונות אנטי-סרטניים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: למדו לבודד נויטרופילים עם תכונות אנטי-סרטניות מדם פריפרי באמצעות מדרג צפיפות ושתרבות עם תאי גידול מתויגים בלוציפראז. שיטה זו מאפשרת הערכת פעילות ציטוטוקסית ללא שימוש ברדיואיזוטופים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ZG נתמך על ידי מענקים מתכנית I-CORE של הקרן הלאומית למדע (מס &#39;41/11 גרנט), הקרן אביש-פרנקל, נאמנות Rosetrees, למלחמה בסרטן קרן המחקר (ICRF - מחקר פיתוח קריירה פרס) ו בסיס לדאגה. ZGF נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית לחקר הסרטן (ICRF - מחקר פיתוח קריירה פרס), מדען הראשי של משרד בריאות הישראלי וישראל איגוד הריאות.

<ol><li>Tangye, S. G., Brink, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+helping+hand+from+neutrophils+in+T+cell-independent+antibody+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A helping hand from neutrophils in T cell-independent antibody responses.</a> Nat Immunol. 13, 111-113 (2012).</li>
<li>Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+the+activation+and+regulation+of+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity.</a> Nat Rev Immunol. 11, 519-531 (2011).</li>
<li>Pruijt, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+are+indispensable+for+hematopoietic+stem+cell+mobilization+induced+by+interleukin-8+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 6228-6233 (2002).</li>
<li>Tecchio, C., Cassatella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-derived+cytokines+involved+in+physiological+and+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Immunol+Allergy%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-derived cytokines involved in physiological and pathological angiogenesis.</a> Chem Immunol Allergy. 99, 123-137 (2014).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formylpeptide+receptors+mediate+rapid+neutrophil+mobilization+to+accelerate+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Formylpeptide receptors mediate rapid neutrophil mobilization to accelerate wound healing.</a> PloS one. 9, e90613(2014).</li>
<li>Granot, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+entrained+neutrophils+inhibit+seeding+in+the+premetastatic+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung.</a> Cancer Cell. 20, 300-314 (2011).</li>
<li>Sionov, R. V., Fridlender, Z. G., Granot, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Multifaceted+Roles+Neutrophils+Play+in+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenviron%22%5BJournal%5D)">The Multifaceted Roles Neutrophils Play in the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Microenviron. , (2014).</li>
<li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%2C+from+marrow+to+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33, 657-670 (2010).</li>
<li>Yamashiro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+change+of+cytokine-activated+neutrophils%3A+inflammatory+neutrophils+are+heterogeneous+and+enhance+adaptive+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses.</a> J Leukoc Biol. 69, 698-704 (2001).</li>
<li>Futosi, K., Fodor, S., Mocsai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+cell+surface+receptors+and+their+intracellular+signal+transduction+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil cell surface receptors and their intracellular signal transduction pathways.</a> Int Immunopharmacol. 17, 638-650 (2013).</li>
<li>Scapini, P., Cassatella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+networking+of+human+neutrophils+within+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Social networking of human neutrophils within the immune system.</a> Blood. 124, 710-719 (2014).</li>
<li>Fridlender, Z. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+comparing+tumor-associated+neutrophils+with+granulocytic+myeloid-derived+suppressor+cells+and+normal+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis comparing tumor-associated neutrophils with granulocytic myeloid-derived suppressor cells and normal neutrophils.</a> PloS one. 7, e31524(2012).</li>
<li>Fridlender, Z. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+of+tumor-associated+neutrophil+phenotype+by+TGF-beta%3A+%27N1%27+versus+%27N2%5BTitle%5D)+AND+%22TAN.+Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2.</a> TAN. Cancer Cell. 16, 183-194 (2009).</li>
<li>Talmadge, J. E., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+myeloid-derived+suppressor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">History of myeloid-derived suppressor cells.</a> Nat Rev Cancer. 13, 739-752 (2013).</li>
<li>Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsets+of+myeloid-derived+suppressor+cells+in+tumor-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice.</a> J Immunol. 181, 5791-5802 (2008).</li>
<li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD15%2B%2FCD16low+human+granulocytes+from+terminal+cancer+patients%3A+granulocytic+myeloid-derived+suppressor+cells+that+have+suppressive+function%5BTitle%5D)+AND+%22Tumour+Biol%22%5BJournal%5D)">CD15+/CD16low human granulocytes from terminal cancer patients: granulocytic myeloid-derived suppressor cells that have suppressive function.</a> Tumour Biol. 33, 121-129 (2012).</li>
<li>Brandau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+in+the+peripheral+blood+of+cancer+patients+contain+a+subset+of+immature+neutrophils+with+impaired+migratory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties.</a> J Leukoc Biol. 89, 311-317 (2011).</li>
<li>Pillay, J., Tak, T., Kamp, V. M., Koenderman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+suppression+by+neutrophils+and+granulocytic+myeloid-derived+suppressor+cells%3A+similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Immune suppression by neutrophils and granulocytic myeloid-derived suppressor cells: similarities and differences.</a> Cell Mol Life Sci. 70, 3813-3827 (2013).</li>
<li>Lopez-Lago, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+chemokines+secreted+by+tumor+cells+mount+a+lung+antimetastatic+response+during+renal+cell+carcinoma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Neutrophil chemokines secreted by tumor cells mount a lung antimetastatic response during renal cell carcinoma progression.</a> Oncogene. 32, 1752-1760 (2013).</li>
<li>Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+bone+marrow+contains+large+numbers+of+functionally+competent+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils.</a> J Leukoc Biol. 75, 604-611 (2004).</li>
<li>Sagiv, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+Diversity+and+Plasticity+in+Circulating+Neutrophil+Subpopulations+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Phenotypic Diversity and Plasticity in Circulating Neutrophil Subpopulations in Cancer.</a> Cell Reports. , (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

נויטרופילים הם הנפוצים ביותר של כל תאי הדם הלבנים ומגישי העזרה הראשונות במקרים של זיהום ודלקת. ככזה, הם רגישים מאוד לרמזים חיצוניים ומופעלים בקלות. בנוסף, יש לי נויטרופילים מחצית חיים קצרים מאוד ותחלופה מהירה. יחד, מאפיינים אלה מעלים מספר קשיים בעבודה עם נויטרופילים, כך שאסטרטגיות ניסיוניות ייחודיות נדרשות. לדוגמא, יש כמה אסטרטגיות טיהור נויטרופילים, כל אחד עם יתרונות וחסרונות. שלב קריטי בעבודה עם נויטרופילים הוא...

נויטרופילים תחילה התאפיינו כתאים חיסוניים המולדים המשמשים כהגנה שורה הראשונה נגד מיקרואורגניזמים פולשים. היום ידוע שנויטרופילים יש יותר מרחיק לכת פונקציות, שהיה מעורב בהרכבת מערכת חיסונית אדפטיבית נגד אנטיגנים זרים 1,2, המסדיר hematopoiesis 3, אנגיוגנזה 4 וריפוי פצעי 5. בנוסף, נויטרופילים עשויים להשפיע גידול והתקדמות גרורתי מכוח הפעילות פרו ואנטי-סרטנית שלהם 6,7. נויטרופילים מתאפיינים בגרעין מפולח צורות (ומכאן נקרא polymorphonuclear (לויקוציטים PMN)) ומכיל לפחות שלושה subclasses השונה של גרגירים כמו גם שלפוחית ​​הפרשה 8 (1A-C איור). נויטרופילים יש יכולת phagocytic גבוהה ופעילות מונואמין הגבוה NADPH קריטי לחיסול חיידקים, ומפרישים מגוון רחב של כמוקינים חשובים במתיחה של נויטרופילים נוספים ותאים אחרים של מערכת חיסון לאתר של דלקת 8,9. נויטרופילים מאופיינים בביטוי של כמות גדולה של קולטני משטח כולל קולטני-כמו אגרה (TLRs), C-סוג הקטינים רצפטורים (CLRs), משלימים קולט 3 (CD11b / CD18) ומולקולות דבקות אחרות (למשל, L-selectin, LFA-1, VLA-4 ומולקולת carcinoembryonic הקשורים לאנטיגן הידבקות תא 3 (CEACAM3 / CD66b)), קולטני chemokine (למשל, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), קולטני chemoattractant (למשל, PAFR, LTB 4 R וC5aR) , קולטני ציטוקינים (למשל, G-CSFR, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18r, TNFR), formyl-פפטיד קולטנים (למשל, FPR1-3), וקולטני Fc (למשל, CD16 (FcγRIII ), CD32 (FcγRII), וCD64 (FcγRI) 10. בעכברים, נויטרופילים בדרך כלל מזוהים כCD11b + Ly6G +, ואילו נויטרופילים אדם מזוהים באמצעות סמני יקוציט CD11b, CD15, CD16 וCD66b. הוא גם מקובל להכתים לMyeloperoxidase חלבוני גרגיר (MPO) ואלסטט נויטרופילים (NE) לגילוי של נויטרופילים ברקמות. זה עדיין לא ברור אם הפונקציות המגוונות של נויטרופילים מתווכות על ידי אותו התא או על ידי תת-אוכלוסיות תאים שונות. נתוני צבירה מציעים לנוכחותה של אוכלוסייה הטרוגנית נויטרופילים שמציגה רמה גבוהה של הגמישות מושפעת גירויים פרו-דלקתיים ומייקרו-הסביבה 11,12. Fridlender et al. 13 חילקו באופן בוטה את הנויטרופילים בסרטן לשתי תת-אוכלוסיות גדולות כינו N1 עם תכונות אנטי-סרטניים וN2 עם תכונות פרו-סרטנית. בסרטן, כמו גם בדלקת כרונית, יש תת-אוכלוסייה נוספת מורכבת מתאי granulocytic נגזר מיאלואידית מדכאת (G-MDSCs) המדכאים תגובות תא T 14. G-MDSCs נחשב לתאים בוגרים מיאלואידית מתאפיינים CD11b + Ly6Cפנוטיפ הנמוך Ly6G היי בעכברים 15, בזמן שיש CD15 + / CD16 פנוטיפ הנמוך ב -16 בני אדם. G-MDSCs להביע רמות גבוהות יותר של arginase וMyeloperoxidase, רמות נמוכות יותר של ציטוקינים בזמן וכמוקינים מ נויטרופילים במחזור נורמלים. הם פחות phagocytic ונודד, אך מייצרים רמות גבוהות יותר של ROS 15,17,18. בעבודה הנוכחית נתאר כמה שיטות בסיסיות לבידוד ואפיון של נויטרופילים עם תכונות אנטי-סרטנית. בעוד נויטרופילים מהווים את האוכלוסייה הגדולה ביותר של כל תאי הדם הלבנים במחזור האדם (45 - 70%; 1800 - 6000 / μl), בעכברים, בתנאים רגילים, הם די דלילים (10 - 15%; 300-500 / μl ). עליות ספירת נויטרופילים בעקביות על דלקת ולעתים בסרטן, המייצג את המדינה של דלקת כרונית 7. נויטרופילים לפתח ממבשר מיאלואידית הנפוצה multipotent לסה&quot;נ (CMP)LLS במח העצם, בתהליך בידול עובר שלבי myeloblasts (MB), promyelocytes (PM), myelocytes (MC), metamyelocytes (MM) ותאי להקה (BC) 8. נויטרופילים הבוגרים, לאחר mitotic עשויים להישאר בתוך מח העצם עבור 4-7 ימים לפני שהם שוחררו למחזור 8. מחזור נויטרופילים בדם הוא בדרך כלל מהיר עם מחצית חיים ממוצע של 6 - 12 שעות, אשר עשוי להיות ממושכת בתנאים דלקתיים. נויטרופילים unstimulated מוגבלים פעילות אנטי-סרטנית, תכונה שניתן לרכוש על ידי חשיפת נויטרופילים הנאיביים כמוקינים IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 וCXCL5 6,19 או באופן מלאכותי, על ידי חשיפתם לphorbol אסתר phorbol 12 13-אצטט -myristate (PMA) 6. זמן מחצית החיים הקצרים של נויטרופילים יחד דם עם המספר הנמוך של נויטרופילים (~ 3-5 x 10 5) השיגו מ1 מיליליטר דם של 6 נאיבי - עכבר בן 8 שבוע, הפכו אותוקשה לחקור את הפונקציה של מחזורי נויטרופילים עכבר במבחנה. כדי להתגבר על קושי זה, מקורות אחרים כבר בשימוש. לדוגמא, ניתן לקבל מספר גדול של נויטרופילים ממח עצם 20 או הצפק הבא האינדוקציה של דלקת סטרילית (למשל, לאחר הזרקת intraperitoneal של thioglycollate מרק או Zymosan). יש לציין כי נויטרופילים מתקבלים מחלל הצפק לא להפעיל כל פעילות אנטי-סרטנית (תצפית לא פורסם). . גרנות ואח &#39;6 ציינו כי עכברי BALB / ג מחוסן orthotopically עם קו תא קרצינומה 4T1 שד העכבר לפתח neutrophilia שמחריף עם התקדמות גידול 6 (איור 2 א), כך ש-20 - ניתן לבודד 40 מיליון נויטרופילים דם בקלות מהדם 1 מיליליטר 3 - 4 שבועות חיסון לאחר גידול. נויטרופילים אלה שרכשו את פעילות אנטי-סרטנית, והיה בהתאם coiנויטרופילים נד-entrained גידול (עשר), כדי להבדיל אותם מנויטרופילים נאיביים 6 (איור 2). בעוד נויטרופילים בצפיפות גבוהה (HDN, איור 1 א) הם מאוד אנטי-סרטניים, נויטרופילים בצפיפות נמוכה (LDN, איור 1) שנוצרו בהקשר של הסרטן הם לא 21. כמו כן, יש לי נויטרופילים בצפיפות גבוהה ממח העצם והטחול של עכברי נושאי גידול פעילות אנטי-סרטני (נתונים שלא פורסמו). יש לציין כי עם התקדמות גידול הטחול המוגדל הופך בהדרגה (splenomegaly), עם הגדלת כמויות של נויטרופילים. יש לציין כי עשר נוצרים גם בדגמים אחרים של סרטן, כולל שני (גידולי MMTV-PyMT וMMTV-Wnt1 החלב וגידולי ריאה מונעים k-ראס) ספונטניים ומוזרקים (AT-3 (MMTV-PyMT) וסרטן שד E0771 תאים, תאי LLC לואיס סרטן הריאות ותאים מלנומה B16-F10). עם זאת, היקף הגיוס נויטרופילים בקיבה אלהאו מודלים הוא הרבה פחות מעכברים מחוסן-4T1, הגיעו 5 - 10 x 10 6 נויטרופילים בדם מיליליטר 1 לאחר 3 שבועות.

<table><tbody><tr><td>קווי</td><td></td><td></td><td></td>תאים</tr><tr><td>עכבר 4T1 תאי קרצינומה של השד</td><td>ADCC</td><td>CRL-2539</td><td>מדיום גידול: DMEM + 10% מומת חום FBS</td></tr><tr><td>PLASTIC WARES AND</td><td></td><td></td><td></td>EQUIPMENT</tr><tr><td>24 בארות צלחת תרבית רקמות&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td>צלחת</td></tr><tr><td>תרבית רקמה סטרילית 100 מ"מ&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>430167</td><td>סטרילי</td></tr><tr><td>25 ס"מ2 בקבוק תרבית רקמות</td><td>Nunc</td><td>156340</td><td>צלחת</td></tr><tr><td>תרבית סטרילית 90 מ"מ בדרגת חיידקים&nbsp;</td><td>מיניפלסט, עין שמר, ישראל</td><td>20090-01-017</td><td></td></tr><tr><td>שפופרת צנטריפוגה חרוטית סטרילית 15 מ"ל&nbsp;</td><td>מיניפלסט, עין שמר</td><td>835015-40-111</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי 50 מ"ל&nbsp;</td><td>מיניפלסט, עין שמר, ישראל</td><td>835050-21-111</td> בז <td>סטרילי</td></tr><tr><td>12 x 75 מ"מ צינור פוליסטירן עגול תחתון&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>צלחת נדידה סטרילית Millicell 24 בגודל נקבוביות של 5&mu; מ&nbsp;</td><td>Merck Millipore</td><td>PSMT010R1</td><td></td></tr><tr><td>צלחת באר לבנה סטרילית 96 עם תחתית שטוחה&nbsp;</td>מסננת תאים <td>סטריליים</td> <td>Costar</td><td>3917</td></tr><tr><td>(40 מ"מ)&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>סטרילי</td></tr><tr><td>20 גרם x 1.5 אינץ' מחט</td><td>BD Microlance 3&nbsp;</td><td>301300</td> מחט <td>סטרילית</td></tr><tr><td>23G x 1 אינץ'&nbsp;</td><td>BD Microlance 4</td><td>300800</td><td>מחט סטרילית</td></tr><tr><td>25 גרם x 5/8 אינץ'&nbsp;</td><td>BD Microlance 5</td><td>300600</td> מזרק <td>סטרילי</td></tr><tr><td>0.3 מ"ל עם מחט 30 גרם x 8 מ"מ</td><td>BD Micro-Fine Plus Demi</td><td>320829</td><td></td></tr><tr><td>סטרילי 9 מ"מ קליפס&nbsp;</td><td>BD, AutoClip&nbsp;</td><td>427631</td><td></td></tr><tr><td>מגנט סטרילי EasySep&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>MACS עמודת הפרדה LS&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>מגנט מפריד MidiMACS</td> סטרילי <td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>שקופית זכוכית מיקרוסקופ&nbsp;</td><td>מנזל-גל&אומל; סר סופרפרוסט&nbsp; בתוספת שייקר אורביטלי</td><td>J1800AMNZ</td><td></td>תרמו</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>סקיי ליין, קורא צלחות ELMI</td><td>S-3.02.10L</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>TECAN</td><td>InfiniteF200Pro</td><td></td></tr><tr><td>אבקת</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA), שבר V</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Bromodeoxyuridine (BrdU)&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>550891</td> CFSE <td>סטרילי</td></tr><tr><td>(5-(ו-6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester)</td> <td>בדיקות מולקולריות</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Dextran T500</td><td>Sigma</td><td>31392</td><td></td></tr><tr><td>מלח נתרן הפרין מרירית המעי של חזיר&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד (NaN3)</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td>רעיל במיוחד, יש לטפל בזהירות</td></tr><tr><td>באבקת תיוגליקולאט&nbsp;</td><td>Difco</td><td>225650</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan A</td><td>Sigma</td><td>Z4250</td><td></td></tr><tr><td>מדיה ותוספי מזון</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדיום הנשר המותאם (DMEM)</td> <td>Sigma</td><td>D5796</td><td>Opti-MEM</td>&reg סטרילי של Dulbecco</tr><tr><td>; הפחתתי את מדיום הסרום&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>מכון הזיכרון הסטרילי רוזוול פארק (RPMI) -1640 בינוני</td><td>סיגמא</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי סטרילי (FBS),</td><td>סיגמא</td><td>F9665</td><td>תעשיות</td></tr><tr>ביולוגיות סטריליות<td>L-גלוטמין</td> מומת בחום<td>, בית העמק, ישראל</td><td>03-020-1A</td><td></td></tr><tr>תעשיות ביולוגיות<td>סטריליות נתרן פירובאט</td><td>, בית העמק, ישראל</td><td>03-042-1B</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת סטרפטומיצין סטרילית פניצילין x 1000</td><td>תעשיות ביולוגיות, בית העמק, ישראל</td><td>03-031-5</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח סטרילית פוספט בופר (PBS) ללא Mg2+ ו-Ca2+&nbsp;</td><td>תעשיות ביולוגיות, בית העמק, ישראל</td><td>02-023-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS סטרילי x 10 ללא Ca2+ ו-Mg2+&nbsp;</td><td>תעשיות ביולוגיות, בית העמק, ישראל</td><td>02-023-5A</td> מים <td>סטריליים</td></tr><tr><td>בדרגת HPLC&nbsp;</td><td>J.T. Baker</td><td>4218-03</td><td>פתרונות</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> חיטוי <tr><td>ACK &ndash; אמוניום-כלוריד-אשלגן</td><td>טכנולוגיות חיים&nbsp;</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת Bromodeoxyuridine (BrdU) (10 מ"ג/מ"ל) ב-PBS</td><td></td><td></td><td>ממיסים 10 מ"ג של BrdU ב-1 מ"ל PBS ובמסנן סטרילי.</td></tr><tr><td>CFSE, 5 מ"מ ב-DMSO</td><td></td><td></td><td>ממיסים 2.8 מ"ג CFSE ב-1 מ"ל DMSO. יש לחלק ל-10 מ"ל בשפופרות סטריליות של 200 מ"ל ולאחסן בחושך בטמפרטורה של -20oC.</td></tr><tr><td>תמיסת Eosin Y</td><td>Sigma</td><td>HT110-2-32</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של הנקס</td><td>תעשיות ביולוגיות, בית העמק, ישראל</td><td>02-016-1A</td> הפרין <td>סטרילי</td></tr><tr><td>, 20 מ"ג/מ"ל ב-PBS</td><td></td><td></td><td>ממיסים 100 מ"ג הפרין ב-5 מ"ל PBS סטרילי, ומסנן סטרילי דרך מסנן 0.2 מ"מ.</td></tr><tr><td>Histopaque-1119&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>11191</td><td>פילטר סטרילי דרך פילטר 0.2 מ"מ.</td></tr><tr><td>Histopaque-1077&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>10771</td><td>פילטר סטרילי דרך פילטר 0.2 מ"מ.</td></tr><tr><td>מאגר ליזה של תרבית תאי לוציפראז x5</td><td>Promega</td><td>E153A</td><td>יש לדלל 1:5 במים סטריליים ממש לפני השימוש.</td></tr><tr><td>תמיסת בדיקת לוציפראז</td><td>Promega</td><td>E1501</td><td>מכיל אבקת מצע לבדיקת לוציפראז (E151A) ומאגר בדיקת לוציפראז (E152A)</td></tr><tr><td>תמיסת המטוקסילין של מאייר&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>MHS-32</td><td></td></tr><tr><td>PBS + 0.5% BSA</td><td></td><td></td><td>ממיסים 2.5 גרם BSA ב-500 מ"ל PBS, ומסנן סטרילי דרך מסנן 0.2 מ"מ.</td></tr><tr><td>PBS + 1% BSA</td><td></td><td></td><td>ממיסים 1 גרם BSA ב-100 מ"ל PBS, ומסנן סטרילי דרך מסנן 0.2 מ"מ.</td></tr><tr><td>5x PBS עם 2.5% BSA</td><td></td><td></td><td>ממיסים 12.5 גרם BSA בתערובת של 250 מ"ל מים סטריליים בדרגת HPLC ו-250 מ"ל PBSx10, ומסנן סטרילי דרך מסנן 0.2 מ"מ.</td></tr><tr><td>PBS המכיל 0.5% BSA ו-2 מ"מ EDTA</td><td></td><td></td><td>ממיסים 250 מ"ג BSA ב-50 מ"ל PBS סטרילי ומוסיפים 200 מ"ל של 0.5M EDTA pH 8.0, מסנן סטרילי דרך מסנן 0.2 מ"מ.</td></tr><tr><td>מאגר FACS (PBS המכיל 0.5% BSA, 2 מ"מ EDTA ו-0.02% NaN3)</td><td></td><td></td><td>יש להמיס 250 מ"ג BSA ב-50 מ"ל PBS&nbsp; ולהוסיף 200 מ"ל של 0.5M EDTA pH 8.0 ו-500 מ"ל של 2% NaN3, מסנן סטרילי דרך מסנן 0.2 מ"מ.</td></tr><tr><td>תמיסת מלח (0.9% NaCl)</td><td></td><td></td><td>ממיסים 9 גרם NaCl ב-1,000 מ"ל ddw,</td></tr><tr>תמיסת <td></td><td></td><td>NaCl 0.2%</td> אוטוקלאב <td>ממיסים 2 גרם NaCl ב-1,000 מ"ל ddw, תמיסת</td></tr><tr><td></td><td></td><td>NaCl 1.6%</td> אוטוקלאב <td>ממיסים 16 גרם NaCl ב-1,000 מ"ל ddw, אוטוקלאב</td></tr><tr><td>2% נתרן אזיד</td><td></td><td></td><td>ממיסים 1 גרם נתרן אזיד ב-50 מ"ל ddw סטרילי, יש לשמור ב-4oC. רעיל מאוד.</td></tr><tr><td>3% תמיסת</td><td></td><td></td> תיוגליקולאט<td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; ממיסים 3 גרם אבקת תיוגליקולט ב-100 מ"ל ddw.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; מרתיחים עד שהתמיסה הופכת לצהובה וחיטוי.</td></tr><tr><td>תמיסה כחולה טריפאן (0.4%)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>יש לדלל 1:10 ב-PBS כדי לקבל תמיסה של 0.04%.</td></tr><tr><td>תמיסת טריפסין B&nbsp;</td><td>תעשיות ביולוגיות, בית העמק, ישראל</td><td>03-046-1</td><td>סטרילי</td></tr><tr><td>1 מ"ג/מ"ל Zymosan A</td><td></td><td></td><td>Resuspend 1 מ"ג Zymosan A ב-1 מ"ל PBS סטרילי בשפופרת Eppendorf. מערבולת נמרצת ודוגרת על הצינור בטמפרטורה של 37 oC למשך 30 דקות. אין לבצע חיטוי. הכן את התמיסה טרי לפני השימוש.</td></tr><tr><td>ערכות</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת בחירת EasySep PE</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18557</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל בחירת EasySep PE&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18151</td><td></td></tr><tr><td>ננו-חלקיקים מגנטיים EasySep&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18150</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיקרו-חרוזים לעכבר Anti-Ly6G</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-332</td><td></td></tr><tr><td>ערכת העשרת נויטרופילים לעכבר EasySep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>19762</td><td></td></tr><tr><td>ערכת העשרת נויטרופילים אנושיים</td><td>EasySep STEMCELL Technologies</td><td>19257</td><td></td></tr><tr><td>ערכת זרימה FITC BrdU</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת בידוד נויטרופילים 559619 MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-658</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת פגוציטוזיס&nbsp;</td><td>חברת קיימן כימיקלים&nbsp;</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים חוסמי FCR&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>101302</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד Ly6G לחולדות מטוהרות&nbsp;</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>551459</td><td>שיבוט 1A8</td></tr> PE <tr><td>מצומד חולדה נגד עכבר נוגדן Ly6G&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>127608</td><td>שיבוט 1A8</td></tr><tr><td>FITC מצומד חולדה אנטי עכבר Ly6G</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>551460</td><td>שיבוט 1A8</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 חולדה נגד עכבר Ly6G&nbsp;</td><td>TONBO Biosciences</td><td>65-1276</td><td>שיבוט 1A8</td></tr><tr><td>סגולFluor 450-מצומד חולדה נגד עכבר Ly6G&nbsp;</td><td>TONBO Biosciences</td><td>75-1276</td><td>שיבוט 1A8</td></tr><tr><td>FITC מצומד חולדה נגד עכבר CD11b</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>553310</td><td>שיבוט M1/70</td></tr><tr><td>מצומד עכברוש FITC נגד עכבר Ly-6G ו-Ly-6C (GR-1)</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>553127</td><td>שיבוט RB6-8C5</td></tr><tr><td>PE-מצומד חולדה נגד עכבר CD45</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>553081</td><td>שיבוט 30-F11</td></tr><tr><td>מצומד FITC חולדה נגד עכבר F4/80&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab60343</td><td>שיבוט BM8</td></tr><tr><td>FITC מצומד עכבר אנטי אנושי CD66b&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>305103</td><td>Clone G10F5</td></tr><tr><td>נוגדן בקרת איזוטיפ חולדה מטוהר (IgG2a, k)&nbsp;</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>553927</td><td>שיבוט R35-95</td></tr><tr><td>עלה מטוהר אוגר ארמני נגד עכבר CD3e נוגדן</td><td>BioLegend</td><td>100314</td><td>שיבוט 145-2C11</td></tr></tbody></table>

בידוד ואפיון של נויטרופילים עם תכונות אנטי-סרטניים

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

נויטרופילים, הנפוצים ביותר של כל תאי הדם הלבנים במחזור האדם, ממלאים תפקיד חשוב בהגנה המארחת נגד מיקרואורגניזמים פולשים. בנוסף, נויטרופילים לשחק תפקיד מרכזי במעקב חיסוני של תאים סרטניים. יש להם את היכולת לזהות תאים סרטניים ולגרום למוות של תאים סרטניים או באמצעות מנגנון מגע תלוי תא מעורב מי חמצן או באמצעות רעיל נוגדנים תלויים בתיווך תא (ADCC). נויטרופילים עם פעילות אנטי-סרטנית יכולים להיות מבודדים מהדם היקפי של חולי סרטן ושל עכברי נושאות גידולים. נויטרופילים אלה מכונים נויטרופילים-entrained גידול (TEN) כדי להבחין ביניהם הנויטרופילים של נבדקים בריאים או עכברים נאיביים שלא מראים פעילות ציטוטוקסיות גידול משמעותית. בהשוואה לתאי דם לבנים אחרים, נויטרופילים להראות ציפה שונה שהופכים אותו אפשרי על מנת להשיג&gt; 98% מאוכלוסיית נויטרופילים הטהורים כאשר נתון שיפוע צפיפות. עם זאת, בתוספתלאוכלוסיית נויטרופילים בצפיפות גבוהה הנורמלית (HDN), בחולי סרטן, בעכברי נושאי גידול, כמו גם בתנאים דלקתיים כרוניים, אוכלוסיות מובחנות נויטרופילים בצפיפות נמוכה (LDN) מופיעות במחזור הדם. LDN שיתוף לטהר עם חלק mononuclear ויכול להיות מופרד מתאי mononuclear או באמצעות אסטרטגיות בחירה חיוביות או שליליות. ברגע שטוהר נויטרופילים המבודדים נקבע על ידי cytometry זרימה, הם יכולים לשמש במבחנה ובמבחנים פונקציונליים vivo. אנו מתארים טכניקות לניטור הפעילות אנטי-סרטנית של נויטרופילים, היכולת שלהם להעביר ולייצר מיני חמצן מגיבים, כמו גם ניטור קיבולת phagocytic vivo לשעבר. בנוסף, אנו מתארים טכניקות לתייג נויטרופילים למעקב in vivo, וכדי לקבוע את היכולת אנטי-גרורתי שלהם in vivo. כל הטכניקות האלה הן חיוניות להבנה כיצד להשיג ולאפיין נויטרופילים עם אנטי-סרטניפונקציה.

במחקר שנערך לאחרונה זיהינו פונקציה אנטי-גרורתי לנויטרופילים 6. נויטרופילים מעכברי נושאי גידול לרכוש פנוטיפ ציטוטוקסיות ויש לו את היכולת להרוג תאים סרטניים 6. זאת בניגוד לנויטרופילים מעכברים נאיביים שאין להם השפעה אנטי-סרטנית משמעותית 6. כמה מהטכניקות המתוארות בסעיף הפרוטוקול שימש ללימוד פונקצית נויטרופילים אנטי-סרטני במבחנת in vivo 6. ניתן להשיג נויטרופילים ציט...

נויטרופילים ממלאים תפקיד חשוב לא רק בהגנה על המארח מפני מיקרואורגניזמים פולשים, אלא גם מעורבים במעקב חיסוני אחר תאי גידול. כאן, אנו מתארים טכניקות הקשורות לבידוד נויטרופילים בעלי תכונות אנטי-גידוליות ושיטות לניטור תפקוד נויטרופילים נגד גידול במבחנה וב-vivo.

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לחקור את תפקוד הנויטרופילים בסרטן. זאת מושג תחילה על ידי השגת דם פריפריאלי. בשלב השני, הנויטרופילים מופקים באמצעות מדרג צפיפות, ולאחריו ביצוע תרבית משותפת (co-culture) למשך לילה.בעזרת תאי גידול המסומנים בלוקיפראז, נמדדת כעת פעילות הלוקיפראז של התאים. בסופו של דבר, ניתן לקשר באופן הפוך בין כמות הלוקיפראז בכל תרבית משותפת לבין רעילות התאים (cytotoxicity) של הנויטרופילים בתוך כל תרבית משותפת. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הפרדת נויטרופילים מבוססת נוגדנים ושיטות אחרות להערכת חיות תאים, הוא שההליך זה ממזער את ההפעלה הלא-ספציפית של הנויטרופילים ומאפשר מדידה של חיות התאים ללא שימוש בסממנים רדיואקטיביים.את הפרוצדורה הזו ידגימו סטודנט לתואר שני במעבדתי וד"ר סימוני, פוסט-דוקטורנט במעבדתי. כדי לבודד נויטרופילים מעכבר הנושא גידול, התחילו בדילול של 1 mL דם שהושג באמצעות פנקטור של הלב ב-PBS המכיל 0.5% BSA לנפח סופי של 6 mL. לאחר מכן, הוסיפו 3 mL של סוכרוז מסונן סטרילי בריכוז 1.119 g/mL לתחתית של מבחנה קונית מפוליפרופילן בנפח 15 mL. לאחר מכן, הטו את המבחנה באיטיות ובזהירות.שכבו שלושה מיליליטר של סוכרוז מסונן סטרילי בריכוז 1.077 גרם למילו'ליטר מעל שכבת הסוכרוז בריכוז 1.119 גרם למילו'ליטר, ולאחר מכן הוסיפו ששה מיליליטר של דם מדולל. הפרידו את התאים על גבי מדרג הסוכרוז באמצעות סבוב במצנטריפוגה למשך 30 דקות ב-700 Gs בטמפרטורת החדר. עם סיום הבלימה בסוף ההפרדה, רוב האריתרוציטים יימצאו בתחתית המבחנה.הנויטרופילים בצפיפות הגבוהה יימצאו סביב סימון שלושה מיליליטר, בטבעת הלבנה-אדומה בממשק שבין שכבות הסוכרוז. בעוד שתאי הלויקוציטים בצפיפות הנמוכה יימצאו בטבעת הלבנה בממשק שבין השכבה של 1.077 גרם למיליליטר לבין ה-PBS המכיל BSA, סביב סימון שישה מיליליטר, יש לשאוב את שכבת ה-P-B-S-B-S-A עד לגובה של חמישה מילימטרים מעל שכבת התאים בצפיפות הנמוכה. לאחר מכן, באמצעות טיפ של פיפט של מיליליטר אחד, יש להסיר את התאים בצפיפות הנמוכה על ידי שאיבה איטית תוך כדי סיבוב איטי של התאים.חלק את התאים ל-30 milliliters של PBS עם 0.5%BSA. לאחר מכן, העבר את הנויטרופילים בצפיפות גבוהה למבחנה נפרדת עם 30 milliliters של PBS פלוס BSA. באותו אופן, סבב את שתי קבוצות התאים בצנטריפוגה, ולאחר מכן השהה מחדש את המשקעים ב-36 milliliters של מים סטריליים בדרגת HPLC.לאחר 30 שניות, החזירו את האיזוטוניות של התאים באמצעות תשעה מיליליטר של 5×XPBS מועשר ב-2.5%BSA וסובבו את התאים במצנטריפוגה. שוב, השעיו את התאים ב-10 מיליליטר של P-B-S-B-S-A וקבעו את מספר התאים החיים באמצעות הדחה של tripan blue. לאחר מכן, לאחר סבב צנטריפוגה נוסף, השעיו את הנויטרופילים במצע דגירה בריכוז התאים הסופי המתאים.לבידוד נויטרופילים ממחזור הדם של חולה סרטן. התחל בערבוב של 10 milliliters של דם אנושי שעובד עם הפרין עם נפח שווה של 3%DExT strand T 500 בתמיסת סלין, לדגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לשקיע את האריתרוציטים. כאשר תאי הדם האדומים שקעו, העבר באיטיות בשכבה את העלייה העשירה בלוקוציטים מעל 10 milliliters של סוכרוז בריכוז 1.077 grams per milliliter, והפרד את התאים באמצעות סנטריפוגה. כפי שהודגם כעת, הנויטרופילים האנושיים בעלי הצפיפות הגבוהה יופיעו בפתית (pellet), בעוד שהנויטרופילים בעלי הצפיפות הנמוכה יטוהרו יחד עם המונוציטים והלימפוציטים בממשק שבין שכבת הסוכרוז בריכוז 1.077 grams per milliliter לבין הפלזמה.לאחר איסוף הנויטרופילים כפי שהודגם כעת, דללו את התאים ב-10 milliliters של 0.2% sodium chloride למשך 30 שניות כדי להמיס את הכדוריות האדומות המזהמות. לאחר מכן, הוסיפו 10 milliliters של 1.6% sodium chloride כדי להחזיר את התאים למצב איזוטוני, והפכו את המבחנה פעם אחת לערבוב. סובבו את התאים בצנטריפוגה ושטפו את המשקע שלוש פעמים ב-20 milliliters של HBSS.לאחר מכן ספרו את התאים והשעיו אותם מחדש ב-RPMI 1640, בתוספת 2% FBS בצפיפות התאים המתאימה. כדי לבודד נויטרופילים שהודחו על ידי glyco או Xan, השתמשו במזרק טוברקולין עם מחט במידה 23 gauge ובאורך אינץ' אחד להזרקה תוך-peritoneal.הזריקו מיליליטר אחד של התמיסה המתאימה לבטנו של העכבר. לאחר ארבע עד 24 שעות, הזריקו חמישה מיליליטר של PBS סטרילי לתוך הפריטוניאום של החיה שהורדמה, באמצעות מזרק של חמישה מיליליטר המצויד במחט 25 gauge באורך 5/8 אינץ'. עסו בעדינות את הפריטוניאום, ולאחר מכן שאבו את הנוזל בחזרה למזרק כדי לאסוף את תאי הנضح הפריטוניאלי (peritoneal exudate cells).שטפו את התאים ב-RPMI 1640, מצע מועשר ב-10% FBS. לאחר מכן, כדי להסיר את המקרופאגים, דגרו 10⁶ תאים למילליטר בצלחת תרבית בדרגת תרבית רקמה המכילה מצע מועשר ב-FBS למשך שעתיים ב-37 °C. כדי לצבוע את הנויטרופילים המבודדים, השהו 1×10⁵ מהתאים במנות של 50 µL של PBS וסבבו את תרחיפי התאים במתאם להכנת שכבה דקה של תאים ב-150 ×g. לאחר חמש דקות, הפרידו את השקופיות הזכוכית המסומנות מראש מהמתאם, וקבעו וצבעו את התאים.בשלב הבא, שטפו את העגלה 15 פעמים במי ברז. הניחו לעגלה להתייבש באוויר שוב, ולאחר מכן בחנו את התאים תחת מיקרוסקופ אור כדי להעריך את הפעילות נגד הגידול של הנויטרופילים. דללו 5×10⁴ תאי גידול המסומנים בלוסיפראז למילליליטר בתווך מצע עם סרום מופחת ואופטימלי (optimized reduced serum medium), המועשר ב-0.5%FBS.לאחר מכן, זרעו 5×10³ מתאי הגידול ב-100 µL של מצע reduced serum optimized המכיל 0.5% FBS בכל באער של פלטת תרבית רקמה לבנה בעלת 96 באערים וקרקע שטוחה. ארבע שעות מאוחר יותר, הוסיפו 1×10⁵ נויטרופילים ב-50 µL של מצע reduced serum optimized המכיל 0.5% FBS לכל באער, להדגרה למשך לילה.לאחר מכן, שאבו את ה-PBS והוסיפו 50 µL של passive lysis buffer לכל באער. לאחר מכן, דגרו את הפלטה כשהיא מכוסה בנייר אלומיניום על שייקר אורביטלי ב-150 RPM בטמפרטורת החדר. לאחר 20 דקות, הכניסו את הפלטה לקורא פלטות לומניסנציה.הזריקו 50 µL של תמיסת בדיקת לוסיפראז לכל באער וקראו את הצהרת הכמילומינצנציה למשך 10 שניות לכל באער. לבסוף, השתמשו בנוסחה כדי לחשב את אחוז הליזיס של הגידול כדי לבחון את מידת הציטוטוקסיות של הנויטרופילים בניסוי מייצג זה של 1×10⁵. נויטרופילים תורבדו יחד עם תאי מטרה 4T1 המבטאים לוסיפראז כפי שהודגם זה עתה בתרביות משותפות עם נויטרופילים שנוקו מעכברים נקיים מגידולים.נצפתה רמה נמוכה מאוד של הריגה של תאי הגידול. עם זאת, נויטרופילים שסוננו מעכברים הנושאים גידול הפגינו רמה משמעותית של ציטוטוקסיות, וזאת כדי לבחון את התכונות האימונו-סופרסיביות של נויטרופילים בצפיפות נמוכה ובצפיפות גבוהה. מספר תאי T ספלניים חיוביים ל-CD eight נמדד לאחר גירוי באמצעות anti CD three או anti CD three בתוספת נויטרופילים בצפיפות נמוכה או גבוהה, לאחר הפעלת anti CD three.נצפתה עלייה דרמטית במספר התאים החיוביים ל-CD8. עם זאת, תרבית משותפת עם נויטרופילים בריכוז נמוך הובילה להפחתה ניכרת בתאים החיוביים ל-CD8, אפקט שלא נצפה בנוכחות נויטרופילים בריכוז גבוה. מידת השמירה על CFSE הוערכה אף היא כאינדיקטור לפרוליפרציה.שימו לב להסטה שמאלה של המילים בתאים שטופלו ב-anti CD3 ובתאים שטופלו ב-anti CD3 שגודלו בנוכחות נויטרופילים בצפיפות גבוהה, מה שמדגים בשני המקרים עלייה בשגשוג של תאי CD8 חיוביים. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מדידת פרצי חמצון (oxidative bursts), פגוציטוזה או נדידה, כדי לענות על שאלות נוספות כגון: כיצד מושפע תפקוד הנויטרופילים תחת תרחישים פתולוגיים שונים?

isolation-characterization-neutrophils-with-anti-tumor

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

בדו"ח זה, אנו מתארים פרוטוקול בידוד אוכלוסיות מטוהרים מאוד של leukocytes כי החודרים גידולים. פרוטוקול זה הוא עיבוד ביוטק Miltenyi בפרוטוקול כדי לשפר את התשואה וטוהר לבידוד תאים של רקמת הגידול מורכב.

בידוד של תאים חיסוניים של גידולים ראשוניים

בסרטון זה אנו מדגימים את הבידוד של נויטרופילים ציטוטוקסיים בצפיפות גבוהה ונויטרופילים בצפיפות נמוכה מדמו של עכבר נושא גידול על ידי צנטריפוגה הדרגתית לא רציפה של סוכרוז.

בידוד נויטרופילים ציטוטוקסיים מדם עכבר נושא גידול

סרטון זה מדגים בדיקה ליצירת נויטרופילים הקשורים לגידול אנטי-אנגיוגני (TANs). עם נטילת גידול מלנומה מורין המכיל TANs פרו-אנגיוגניים, התאים הבודדים מבודדים באמצעות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) ומטופלים במעכב של ניקוטין-אמיד פוספוריבוזיל טרנספראז (NAMPT) כדי להפחית את היכולת לעורר אנגיוגנזה.

יצירת נויטרופילים הקשורים לגידולים אנטי-אנגיוגניים

נויטרופילים הם הסוג הנפוץ ביותר של תאי דם לבנים. בידוד הנויטרופילים מדם אנושי בשיטת הפרדת שיפוע צפיפות והתמיינות של תאים פרומילוציטיים אנושיים (HL60) לאורך המסלול הגרנולוציטי מתוארים כאן; לבחון את תפקידם ברגישות של תאי לימפומה לחומרים אנטי-לימפומה.

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

פרוטוקולים חדשים מתוארים כאן כדי לבודד ולאפיין microparticles נגזר מן האדם ואת העכבר נויטרופילים. פרוטוקולים אלה לנצל ultracentrifugation, מיכשור וטכניקות immunoblotting לנתח תוכן microparticle, הם יכולים לשמש כדי ללמוד את התפקיד של microparticles נגזר סוגי תאים שונים של תפקוד התאים.

בידוד ואפיון של נויטרופילים, נגזר Microparticles ללימודי פונקציונלי

כאן, אנו מציגים שיטה שבה נויטרופילים אנושיים בצפיפות נמוכה (-כעבור שנה-), התאוששה נוזל שטיפת הצפק לאחר הניתוח, לייצר מסיבית מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות), השמנה ביעילות תאים סרטניים חינם לאחר מכן לגדול.

נויטרופילים מלכודות חוץ-תאי שנוצר על ידי נויטרופילים בצפיפות נמוכה המתקבל נוזל שטיפת הצפק התחלקות התא הגידול וקובץ מצורף

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות הנוכחות של נויטרופילים בסעיפים היסטולוגיה קבוע/permeabilized ולהעריך את מצב ההפעלה נויטרופילים מטוהרים בשידור חי. בפרט, פפטיד40 MUB מאגד לקטופרין נוכח בגרגרים נויטרופילים ספציפיים ושלישוניות. חשיפה של התכנים גרגר דרך permeabilization או הפעלה נויטרופילים מאפשר הסימון של נויטרופילים.

פפטיד40 MUB לשימוש באיתור האירועים דלקת נויטרופילים בתיווך

כאן, אנו מראים פוטנציאל טיפולי של אנטי-אנגיוגנטי הקשורים לגידול נויטרופילים לאחר העברתו לתוך עכברים נושאת הגידול. פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי לתמרן את פעילות נויטרופילים לשעבר vivo וכתוצאה מכך להעריך את הפונקציונליות שלהם ב vivo בפיתוח גידולים. זהו מודל מתאים ללימודי חיסוני פוטנציאלי מבוססי נויטרופילים.

העברה של הגידול מניפולציות הקשורים נויטרופילים לתוך הגידול עכברים נושאת ללמוד פוטנציאל אנגיוגנטי שלהם ב Vivo

פרוטוקול זה מפרט שיטה לבידוד של נויטרופילים מדם שלם, מעילי באפי או ממברנות לויקפרזיס, השגת תשואה טובה, טוהר גבוה, והפעלת תאים מינימלית. אנו משתמשים טיהור הדרגתי, משקעים בתאי דם אדומים (RBC), ותסיסת RBC כדי לקבל הכנה נויטרופיל באיכות גבוהה / טוהר.

בידוד של נויטרופילים אנושיים מדמם שלם ומעילי באפי

פרוטוקול מוגדר זה מתאר גישת מיקרוסקופיה בתפוקה גבוהה בזמן אמת כדי להמחיש ולכמת שחרור מלכודת נויטרופילים חוץ-תאית אנושית (NET) במבחנה. השיטה הניתנת לשחזור מאפשרת לחקור את המאפיינים והקינטיקה של שחרור NET בעת גירוי עם משפרי NETosis מובהקים ומאפשרת הערכה של הפרמקולוגיה של אנטגוניסטים של NETosis.

כימות מיקרוסקופי בזמן אמת בתפוקה גבוהה של שחרור מלכודת נויטרופילים חוץ-תאית אנושית והערכת הפרמקולוגיה של אנטגוניסטים

כאן, אנו מספקים גישה אמינה לבידוד נויטרופילים בצפיפות נמוכה ונורמלית מדם מלא באמצעות בידוד מגנטי (ברירה שלילית) ומדיום שיפוע צפיפות לא רציף. הוא מבטיח בידוד ללא נגיעה של תאים בעלי טוהר גבוה (≥93%), מה שמקל על ניתוח מדויק במורד הזרם של תת-אוכלוסיות נויטרופילים, חיוני להבנת תפקידיהם בבריאות ובמחלות.

בידוד ואפיון של נויטרופילים בצפיפות נמוכה ונורמלית מדם מלא

למדו לבודד נויטרופילים עם תכונות אנטי-סרטניות מדם פריפרי באמצעות מדרג צפיפות ושתרבות עם תאי גידול מתויגים בלוציפראז. שיטה זו מאפשרת הערכת פעילות ציטוטוקסית ללא שימוש ברדיואיזוטופים.

בידוד ואפיון של נויטרופילים עם תכונות אנטי-סרטניים

גלה סרטונים נוספים