Microbead השרשה בעובר דג הזברה

דג הזברה הוא מערכת מודל מצוינת למחקרים גנטיים והתפתחותיים. השתלת חרוזים היא טכניקה חשובה למניפולציה של רקמות שניתן להשתמש בה כדי לחקור מנגנוני התפתחות על ידי הכנסת שינויים בסביבות תאיות מקומיות. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע השתלת מיקרו-חרוזים בעובר דג הזברה.

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשתמש בהשתלת מיקרו-חרוזים כדי להכניס שינויים בסביבת הרקמה המקומית בנקודות מרחביות וזמניות ספציפיות במהלך העובריות של דג הזברה. זה מושג על ידי הכנת מגש השתלת חרוזים כדי להקל על הטיפול וההשתלה המדויקים של חרוזי המיקרו. כשלב שני, ביצי דג הזברה מודגרות לשלב ההתפתחות הרצוי.

לאחר מכן מכינים את חרוזי המיקרו בתמיסות הניסוי המתאימות ומועברים בזהירות למיקום הרצוי בתוך העובר. בסופו של דבר, ניתן לבצע השתלת מיקרו-חרוזים ללא הפרעה בהתפתחות תקינה של דג הזברה, מה שמאפשר להעריך את ההשפעות של המולקולות המעניינות על העובריות של דג הזברה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח, תחום הביולוגיה ההתפתחותית, כגון כיצד מולקולות שונות משפיעות על תהליך האורגנוגנזה?

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שנדרש תרגול כדי להיות מיומנים בטיפול במיקרו-חרוזים. להכנת מגש השתלת המיקרו-חרוזים יש לחמם תחילה תמיסת 2% ארו טרייה שהוכנה למשך 90 שניות. בבקבוק ארלנמאייר של 250 מיליליטר מסובב את הבקבוק כל 30 שניות כדי למנוע מהג'ל לבעבע.

לאחר מכן, הניחו את המכסה של צלחת פטרי בגודל 60 על 15 מילימטר לתוך צלחת בגודל 150 על 15 מילימטר כשהחלק הפנימי של המכסה פונה כלפי מעלה. ואז עיגון המכסה של צלחת הפטרי הקטנה יותר באצבע מורה. יוצקים את ג'ל הארוס החם לכלי הגדול יותר.

אפשר לשכבה דקה של אגרוס להיווצר מתחת למכסה הקטן יותר כדי למנוע היווצרות עיבוי וכדי להקל על ראיית החרוזים במיקרוסקופ כשהאגרוס מתקרר. אך לפני שהוא מתמצק לאט לאט בזווית תבנית באר לתוך החלק העליון של הג'ל כדי לאפשר מיקום קל יותר של העוברים. כאשר הג'ל התמצק, השתמש במרית מיקרוס כדי להסיר בזהירות את תבנית הבאר.

לאחר מכן מוסיפים תמיסת E שלוש לתבשיל ושומרים אותה בארבע מעלות צלזיוס. כדי לקצור את עוברי דג הזברה, מלאו תא הזדווגות במי מערכת. לאחר מכן הניחו מחיצה באמצע החדר והוסיפו דג זברה זכר ונקבה בוגרים לצדדים המתאימים של החדר.

למחרת בבוקר, השתמש במסננת רשת דקה כדי לאסוף את הביצים המופרות. הופכים את המסננת הפוכה בתוך צלחת פטרי נקייה של 10 סנטימטרים, ושוטפים את הרשת בזרם דק של E שלוש עד שלא נותרו ביצים במסננת, ויש כ -25 מיליליטר של תמיסת E שלוש בצלחת. לאחר מכן חלקו את הביצים בין מספר מנות ב-50 עד 60 ביצים למנה כדי למנוע צפיפות יתר ודגרו את הביצים בתמיסה E שלוש ב-28.5 מעלות צלזיוס לפני השתלת המיקרו-חרוזים, דגרו אותן בנפח המתאים של הבדיקה, מולקולת העניין או רכב הבקרה לפרק הזמן המתאים.

לאחר מכן, כאשר העוברים הגיעו לנקודת הזמן ההתפתחותית הרצויה, השתמשו במלקחיים עדינים כדי להסיר את העוברים שלהם ולדגור את דג הזברה בתמיסת רינגר מסוננת. תוסף אנטיביוטיקה למשך 10 דקות בזמן שהעוברים מתאקלמים. העבירו את חרוזי המיקרו לצלחת המיקרו חרוזים שהוכנה בעבר, השוכנת בתוך מגש ההשתלה, ושטפו את החרוזים ותמיסת הצלצול למשך 10 דקות.

תוך 50 דקות משטיפת החרוזים מערך עובר אחד בכל פעם בתוך באר מגש ההשתלה, כך שהאזור להשתלת מיקרו-חרוזים נגיש. בעזרת מחט טונגסטן, בצע חתך קטן על העובר, ולאחר מכן לחץ על הנורה של פיפטת העברה מיקרו נימית כדי למשוך בעדינות מיקרו-חרוז לתוך עמוד הנימים ולשחרר את הלחץ כדי להעביר את המיקרו חרוז למגש ההשתלה כדי להקל על הטיפול במיקרו. דחף בעדינות את החרוז כדי להטביע אותו בתמיסת הצלצול בתוך התבנית.

לאחר מכן בעזרת המיקרו-מחט, העבירו את המיקרו חרוז אל העובר ואל החתך. לבסוף, השתמשו בכלי השפם כדי להרחיק את המיקרו-חרוז ממקום החתך כך שהחרוז לא ייפלט בזמן שהוא מתרפא. לאחר מכן ניתן למדוד מיד את הצלחת השתלת המיקרו-חרוזים באמצעות מיקרוסקופ הסטריאו מכיוון שהחרוז יישאר ממוקם ביציבות בתוך הרקמה.

בניסוי זה, מיקרו-חרוזים בודדים בשני גדלים שונים שנשטפו בתמיסת רינגר בלבד הושתלו בעוברי דג הזברה בשלב ניצני הזנב, או בנקודות זמן מאוחרות יותר במהלך מיוגנזה כלשהי כדי להבטיח שמיקום החרוז לא השתנה לאורך הניסוי עקב רקמה אנדוגנית. מורפוגנזה. ניתן לדמיין את דגימות העובר על ידי צילום מסלול חיים או לבדוק במרווחי זמן תקופתיים כאשר התמונות מדגימות השתלת מיקרו-חרוזים. בהיעדר מולקולות מצומדות, ניתן להשיג מולקולות קטנות ללא השפעות מורפולוגיות גסות במהלך ההתפתחות הנורמלית שדג ה- SPR עובר אותך.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו Whole Mount Institute hyper כדי לחקור כיצד המיקרו-חרוז משפיע על ביטוי הגנים. בסך הכל, הבנת מיקום החרוז לאורך זמן היא קריטית בפרשנות התוצאות, כגון הערכת ההשפעות של מולקולה קטנה על רקמת מטרה או תהליך התפתחותי.