Name: Microbead השרשה בעובר דג הזברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: למדו שיטת השרשת מיקרו-חרוזיות בעוברי דג הזברה לחקר ביולוגיה התפתחותית. טכניקה זו מאפשרת לשנות את הסביבה הרקמית מקומית מבלי לשבש את ההתפתחות הנורמלית ולחקור השפעות מולקולריות על אורגנוגנזה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי DP2OD008470 מענק NIH.

הנהלים לעבודה עם עוברי דג הזברה מתוארים בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים באוניברסיטת נוטרדאם. פתרון ההכנה של 1. רינגר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון של 116 מ&quot;מ NaCl, 2.9 מ&quot;מ KCl, 3.6 מ&quot;מ CaCl 2, ו 5 Hepes מ&quot;מ עם H 2 O ultrapure באמצעות ערבוב מתמיד כדי למנוע כל משקעים מלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הוספת מלחים ואילו הפתרון עדיין ערבוב, להוסיף 100 יחידות / פניצילין לכל מ&quot;ל ולכל מיליליטר 100 מיקרוגרם סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הוספת כל האנטיביוטיקה ומלחים, לבצע עיקור מסנן של הפתרון והחנות במכל סטרילי. הערה: N-Phenylthiourea ניתן להוסיף (1-פניל-2-thiourea) או PTU לפתרון של רינגר לחסום את ההיווצרות של פיגמנט בעוברים מושתלים חרוז ללא השלכות שליליות לבריאות עובר. כדי להכין פתרון החסימה / פיגמנטציה רינגר, להשתמש concentration של PTU 0.003%. בשל הריכוז הנמוך של PTU יש להוסיף מומלץ כי נפח גדול יותר של תמיסת רינגר להתבצע, L לפחות 1, כדי להימנע מהוספת כמויות זעירות של אבקת PTU. להוסיף PTU בשלב 1.2, ואילו פתרון ערבוב. </li></ol> 2. Tricaine פתרון הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 גרם של אתיל-3 aminobenzoate מלח methanesulfonate (Tricaine) לליטר של פתרון בתוספת 0.1 M טריס, ממניות 1 M מאוזנים לpH של 9.5 ועשה עם ultrapure H 2 O. הערה: Tricaine ישמש להרדים את עוברי דג הזברה בנקודת הזמן הרצוי לassay פנוטיפים השתלת חרוז. </li></ol> 3. E3 פתרון הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון של 0.25 M NaCl, 10 מ&quot;מ KCl, 12.5 מ&quot;מ CaCl 2, ו16.6 מ&quot;מ MgSO 4-1 ליטר מים ultrapure ליצור 1 ליטר של E3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של מתילן בלו לפתרון E3 לעכב פטריית צמיחה. </li></ol>4. מחטי משיכת להעברת Microbead <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זכוכית בורוסיליקט אש מלוטשת עם נימה בOD: 1.0 מ&quot;מ, מזהה: 0.5 מ&quot;מ, באורך של 10 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים זכוכית borosilicated לחולץ micropipette להכין מחטים עדינות. הערה: ארבעה הממדים הבאים יכולים לשמש כנקודת התחלה כדי למשוך את המחטים: החום = 540, משוך = 245, מהירות = 200, והזמן = 125. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהפיל מספר מספיק של מחטים, חנות בפלסטיק מכוסה פטרי מנות, ממוקמות על רצועות של פלסטלינה או דבק כדי למנוע שבירת קצה המחט, עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקצץ את קצה המחט לגודל הרצוי משעמם, להשתמש זוג מלקחיים בסדר להבקיע סופו של המחט. הערה: גודל שעם מחט ישתנה בהתאם לגודל microbead מנוצל כמו גם העדפות טיפול משתמש. נקודת התחלה טובה היא גדלים נשאו מלאכה בטווח שבין 100 ל -200 מיקרומטר אם microbeads החל 50-100 מיקרומטר ישמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PRIOr להשתמש, להכניס את המחט הגזוז לבעל צינור נימי אופנה מכשיר העברת microbead הושלם. </li></ol> 5. זיף / לאש כלי הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג זיף, להשתלח, או חתיכה עדיין חברה קטנה אחרת של חוט שיער טבעי או סינטטי. חותך ליד הבסיס של החוט בזווית של 45 מעלות. לדבוק הזיף לקצה micropipette P-1000 באמצעות דבק דבק ברור קבוע. </li></ol> 6. Microbead השרשה מגש הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 2 גרם של agarose עם פתרון של E3 100 מיליליטר לעשות 2% agarose ג&#39;ל E3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את פתרון agarose 2% 1 דקות ו -30 שניות בארלנמייר 250 מיליליטר, מתערבל את הבקבוק כל 30 שניות כדי למנוע את הג&#39;ל ממבעבע מעל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את המכסה של צלחת פטרי x 15 מ&quot;מ 60 מ&quot;מ ומניח אותו בצלחת גדולה יותר 150 מ&quot;מ x 15 מ&quot;מ עם הפנים כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את הג&#39;ל agarose החם לתוך צלחת פטרי x 15 מ&quot;מ 150 מ&quot;מ, והקפד לעגן אתהמכסה של הצלחת קטנה עם האצבע. הערה: אפשר בשכבה דקה של agarose מתחת למכסה של הצלחת קטנה יותר כדי להסיר עיבוי שיהווה בעת מזיגת ג&#39;ל; זה יהפוך את חרוזים קלים יותר לראות תחת מיקרוסקופ לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כagarose מתקרר, אבל לפני שהוא מבצרים, למקם את התבנית היטב בג&#39;ל. זה יאפשר למיקום קל של העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב: על מנת למנוע בועות בבארות, הנח את התבנית לאט בזווית עד שהוא צף על גבי ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות microspatula, להסיר בזהירות את התבנית היטב פעם ג&#39;ל יש הקרושה. להוסיף פתרון E3 ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol> אוסף 7. העובר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תאי הזדווגות, מופרדים על ידי מחיצות, על ידי מילוי אותם עם מים במערכת, ולאחר מכן הצבת זכר בוגר דג הזברה (ים) וזוגות נשים (ים) בתאים O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף ביצים מופרות באמצעות מסננת רשת תיל דקה (שלבים עובריים ישתנו מעט). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפקיד את הביציות המופרות ב, צלחת פטרי בקוטר 10 סנטימטרים נקייה על ידי הפיכת המסננת הפוכה ושטיפתו עם זרם עדין של E3 עד אין ביצים שנותרו במסננת, ויש כ 25 מיליליטר של תמיסת E3 בצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר איסוף, לחלק את הביצים לכמה מנות (כ 50-60 ביצים לכל צלחת), כדי למנוע צפיפות, אשר עלול להוביל לאי-סנכרון התפתחותית בתוך המצמד ולעשות איסוף נקודות פעמים הרצויות קשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עובר בפתרון E3 על 28.5 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר הערכה התפתחותית על פי סדרת בימוי דג הזברה סטנדרטית 40. הערה: עובר צריך להיות מועבר לE3 / PTU ב 24 שעות שלאחר הפריה (hpf) כדי למנוע התפתחות פיגמנט אם מניפולציות בשלבים מבוגרים מחייבות בהירות אופטית. </li></ol> 8. חרוז השרשה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה microbeads בריכוז מולקולת מבחן רצוי או של הרכב המקבילolution למועד שנקבע בנפח מתאים. הערה: החוקר יכול להשתמש בכלים סטריליים פטרי הנעים 3-6 סנטימטר קוטר, או צלחות רב גם, אשר שניהם מאפשרות הדמיה של microbeads בתוך הפתרון. זמן עשוי להשתנות בהתאם לסוג והכמות של מולקולה של עניין, והחוקר צריך להתייחס ליצרן או המלצות שפורסמו לתקופת דגירה והיבטים אחרים, כגון רגישות לאור וטמפרטורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שעובר הגיע לנקודת הזמן ההתפתחותי הרצויה, להסיר את העוברים מchorions שלהם באמצעות מלקחיים בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עובר בפתרון רינגר המסונן עם אנטיביוטיקה במשך 10 דקות כדי להסתגל להם הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד עוברי הסתגלות, להעביר את microbeads לתוך צלחת microbead שוכנת בתוך מגש ההשתלה ולשטוף אותם בפתרון רינגר במשך 10 דקות. הערה: שתל חרוזים בתוך 50 דקות לאחר שהגיע נקודה זו. w זהחולה להקטין את הסבירות לכך שאחד יהיה להשתיל חרוז עם ריכוז קטן של המולקולה של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערך העוברים לתוך הבארות של מגש השתלת microbead, דואג לכוון אותם כל כך באזור של עניין שבו microbead יהיה מושתל הוא נגיש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קטן בעובר באמצעות מחט טונגסטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את microbead על העובר באמצעות פיפטה העברת microcapillary: מדכאת את הנורה של פיפטה, משוך בעדינות את microbead לטור הנימים, ולאחר מכן שחרר את הלחץ להעביר את microbead ביעד הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכלי זיף / שוט כדי למקם את microbead בתוך העובר. הערה: הקפד למקם את microbead לתוך הרקמה מהאתר של חתך כך microbead לא יגורש מן העובר כפי שמרפא. </li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

במאה השנים האחרונות, את ההבנה של דפוסי תכנית הגוף וorganogenesis עברה התקדמות מונומנטלית. טכניקות מניפולציה רקמה היו קריטיות בחשיפת מידע חשוב על תהליכים החיוניים אלה. הנדסה גנטית היא אחת מהשיטות הנפוצות ביותר לבירור תפקוד גן, ושיטות ניתוח פסיפס, כגון השתלת תאים, מספקות גישות שימושיות להבין אוטונומיה של תפקוד גן. השתלת Microbead מספקת מקום אחר לחקור כיצד מולקולות מסוימות לשנות דינמיקה התפתחותית, כשיטת זו מאפשרת לחוקר לשנות סביבת רקמות מקומית על ידי החדרת מולקולות או מעכבי איתות. מגוון של microbeads שונה זמין מסחרי, שבגדלים שונים ומאפיינים פיזיים אחרים קיימים (למשל, תשלום) כך שהם יכולים להיות מועסקים על מנת לתנאי הניסוי של עניין. לכן, על ידי השתלת microbeads שהם ספוגים בחלבון או חמיקאל של עניין בתוך האורגניזם, חוקרים יכולים לחקור השפעות מקומיות במהלך פיתוח ולמצוא קשרים בין הגן או המולקולה של עניין ופנוטיפ המסוים הביולוגי (ים). מחקרים כמו זה שבוצע על ידי ואדה ועמיתיו השתמש השתלת microbead כדי להעריך את ההשפעה של איתות הקיפוד גדל בדפוסי שלד בneurocranium הקדמי (ANC) בדג הזברה 23. מחקרים קודמים הראו כי שישה נדרשים להיווצרות ANC 14. חוקרי microbeads מצופה ששש שימוש זיהו שאות זו מקדמת היווצרות סחוס בANC. תהליך השתלת microbead שימש כדי להדגים קשר ברור בין איתות הקיפוד והיווצרות סחוס בANC. דוגמא נוספת מפתח של טכניקת המניפולציה רקמה זו בדג הזברה הוא ציינה במחקרים שבם מדענים חקרו את שליטת תעתיק של Erythroblastoma עשרים והשש f (ETS) תחוםמולקולה קשורה-ETS שחקנים (ERM) וactivator Polyoma משפר 3 (Pea3) על ידי איתות FGF במהלך התפתחות מוח דג הזברה מוקדמת 19. באמצעות ניסויי השתלת microbead, הם הצליחו להראות שFgf8 וFgf3 ectopically יכולים להפעיל ביטוי של ERM וpea3. הדוגמות הללו ממחישות את התועלת של microbeads לספק תובנות מנגנוני ההתפתחות שמשתפים פעולה במהלך היווצרות רקמה, שיכול להיות מאופיין היטב על ידי השימוש בשיטות להערכת ביטוי גנים 41. לפיכך, השתלת microbead יכולה להיות שיטת קיימא לחקור רקמות אחרות, כגון המזודרם ביניים (IM) אשר נותן עלייה לכליות. באופן ספציפי, זה יסייע במחקרים התפתחותיים כליות, כדי לחקור כיצד מולקולות שונות משפיע נפרון פילוח 42 וtubulogenesis 43,44, תהליכים שהם הבינו רק באופן שטחי בהווה. יתר על כן, השתלת microbead החלה לשמש להרבעהתהליכי התחדשות y בדג הזברה 29] ויכולים להיות מותאמים לשימוש עם כל מספר של דגמי התחדשות איבר, כגון אבלציה הלייזר הבאה של רקמות עובריות כמו נפרון 45 או בשילוב עם שיטות שגובשו לבצע מחקר עם המבנים המבוגרים המקבילים 46-49. לבסוף, יש השתלת microbead הפוטנציאל לשמש במודלים של מחלות אנושיות, כגון סרטן 50,51 או רקמת ניוון 52,53. בפרוטוקול הנוכחי, אנחנו מדגימים את השיטה של השתלת microbead בעוברי דג הזברה, שגם תוארה באופן דומה על ידי חוקרים אחרים, אבל לא הראתה באמצעות פרוטוקולי וידאו 1. בעזרת תרגול מינימאלי הצלחנו להשתיל microbeads בשיעור של כ 8-10 עוברים / שעה, המתייחס הכדאיות של הליך זה פעם אחת החוקר יש קצת ניסיון. התוצאות הראו במסמך זה מדגימות חרוזים של ד השוניםיכול להיות מושתל imensions בשלבים מוקדמים, וכי עם טיפול, טכניקת מניפולציה רקמה זו יכולה להיות מיושמת עם הפרעה פיזית מינימאלית לעובר. שיפור אחד שיש להדגיש הוא השימוש בכלי זיף / שוט כדי למקם את microbead לעובר. חתיכה זולה יחסית ופשוטה זו של ציוד היא בערך באותו הקוטר כמו microbead, קל להשיג ומסייע להאיץ את תהליך ההשתלה. הזיף / השוט ניתן לחתוך לאורך רצוי כדי לייצר חברה עדיין כלי טיפול בחרוז עדין, תלוי במיומנות חוקר והעדפה. לבסוף, בעוד שתארנו כאן כיצד לתפעל פיזי microbeads ועוברי דג הזברה לבצע השתלה, פרוטוקול זה אינו מתאר נהלי טיפול ספציפיים לסמים או פפטידים שונים. באופן כללי, צריך להיות מושתל microbeads טיפול כימי לבעלי החיים עם האינטרס של המשטר, כדי למנוע תופעות לא רצויות באזורים אחרים של האורגניזם, וחוקרים צריכים להיות גם בנוצר על חששות בטיחות האפשריים הקשורים בכימיקלים כגון לפני ביצוע מחקריהם. לסיכום, יש לנו הפגנו שיטת השתלת microbead יחסית פשוטה ויעילה עם מגוון רחב של יישומים תוך שימוש בחומרים שאינם זמינים במעבדה. סופו של דבר, אנו מקווים שמדריך זה יסייע לחוקרים הטבע העדין של מניפולציה רקמות דג הזברה.

חוקרי ביולוגיה התפתחותית לנצל מגוון רחב של שיטות סלולריות, מולקולריות, וגנטיות לחשוף את המנגנונים ששולטים באופן האורגניזם נוצר. בין גישות אלה, מניפולציה רקמות היא כלי מרכזי בפענוח שאלות מורכבות על גורל תא, תנועה סלולרית, והארגון של רקמות. דרך אחת לשנות סביבות רקמות מקומיות היא באמצעות היישום כירורגית של microbeads המשמשים כדי לספק מקור מוקד של חלבונים או מולקולות איתות אחרות 1. סוג זה של מניפולציה ניסויית יושם באופן נרחב במודלים קלאסיים חוליות אמבריולוגיה, כגון צפרדע וחומוס 2. דג הזברה הפכה אורגניזם מודל חוליות חשוב לחקר organogenesis וגם מספקת יתרונות רבים ייחודיים לדוגמנות מחלה 3-5 כפי שהם חולקים שימור גנטי גבוה עם בני אדם 6. ב, השקיפות האופטית מסוימת ולשעברפיתוחן פנימי של עובר דג הזברה מציע נקודת מבט שאין כמוהו לתצפית של ontogeny הרקמה 3-5. היישום של מסך גנטי קדימה בקנה מידה גדולה יצר מאגר עוצמה של זנים מוטנטים דג הזברה למחקר נוסף 7,8, וזיהוי של טכניקות הקרנה חלופיות שניתן לבצע ביעילות בקנה מידה מופחתת במעבדות בודדות 9,10. בהמשך עבודה ניסויית עם דג הזברה כבר מתאפשרת באמצעות התקדמות בשיטות מהונדסים גנטיות ולהפוך גישות 11,12, כמו גם גנטיקה כימית 13-15. טכניקות מניפולציה רקמה, כגון היישום של microbeads, לא היו מועסקים באופן נרחב בדג הזברה, אבל בכל זאת לספק כלי שימושי להבנה נוספת איתות תא במהלך התפתחות. השתלת Microbead נעשתה שימוש כדי לחקור את תהליכי היווצרות של איבר ברשתית דג הזברה16,17, 18 לב, מוח 19-22, עצבי פסגה 23, ו24,25 סנפיר. במחקרים אלה ואחרים, חרוזים יושמו במהלך ההתפתחות להבין את דיפוזיה של מולקולות איתות 26, איך להשפיע הדרגתיים תא הגירה 27 ודפוסים צירי 28. לאחרונה, microbeads כבר נוצל כדי להעריך מנגנוני התחדשות במבוגרים דג הזברה 29. במחקרים התפתחותיים, למשל, עבודת microbead דג הזברה סיפקה תובנות לתוך מנגנוני היווצרות איבר באמצעות מחקרים של 25 סנפיר החזה. ניצן סנפיר חזה דג הזברה הוא הומולוגי לניצן forelimb ב -30 העכבר וחומוס 31. יש ניצן איבר חוליות שני צמתים איתות חיוניים: אזור פעילות קיטוב (ZPA) שקובע את הציר הקדמי-אחורי ל- דרך הביטוי של קיפוד סוניק (ששש) ומטרות גן קופסא מבנה במורד הזרם,ורכס ectodermal הפסגה (AER) נכח בקצה איבר הניצן, הפועל להקמה הפרוקסימלי לזהות הדיסטלי של האיבר דרך ביטוי של גורמי גדילת פיברובלסטים (Fgfs). על ידי השתלת microbeads FGF נספג מוטציות גנטיות ששש דג הזברה, חוקרים זיהה FGF כחיוני להתקדמות מחזור התא והצמיחה של איבר החוליות 25. בנוסף ל מפלים FGF ושש מאותת כי לבסס את זהות positional, מחקריו החלוציים באמצעות ניצן איבר החומוס מזוהה חומצה רטינואית (RA) כמולקולה שיכול לחקות את הפעולה של אזור הקיטוב להקים קדמי לאחוריים זהות 32. ניסויים אלה מעורבים הצבת רצועות קטנות של נייר Whatman ספוג-RA לאיבר החומוס להעריך דפוסי ספרה 32. יתר על כן, חוקרים ביצעו מחקרים אלגנטיים אחרים המעסיקים את השימוש בmicrobeads, השתלת תאים, ואקסוגנייםטיפולי דלקת מפרקים שגרונית בדג הזברה לקבוע כי RA פועל למתן רמזי positional ארוך טווח במוח האחורי והמזודרם 28 דג הזברה. עם זאת, כיום שאלות רבות נותרו על התפקידים של איתות גורמים כמו FGF ודלקת מפרקים שגרוני בהיבטים רבים של פיתוח חוליות. השפעות האיתות של דלקת מפרקים שגרונית, מתנהג כמו מורפוגן, להשפיע איברים רבים 33, כמו לב פיתוח 34 ואבות הכליות, דלקת מפרקים שגרונית שבי מציין תאי כליה הפרוקסימלי הקלד גורל 35-39. הבנה נוספת של נושאים כגון יכולה להפיק תועלת משמעותית ממחקרי ניסויים תוך שימוש בטכניקות מניפולציה רקמות והשתלת microbead. בעוד פחות מחקרים שבוצעו עם השתלת microbead בדג הזברה, בהשוואה לדגמים כמו החומוס, אלה שבוצעו היו מאוד אינפורמטיבי. אחת סיבות למיעוט השתלת microbead המבוסס על מחקר בעובר דג הזברה היא likely הרעיון שיש אתגרים טכניים קשים, בהתבסס על הגודל של העובר, המהווה מכשול לביצוע מניפולציות בהצלחה כזו. עם זאת, השתלת microbead בעוברי דג הזברה ניתן ללמוד עם תרגול וסיוע באמצעות תצפית חזותית של הטכניקה, ולכן יכולה להיות רדוף כאמצעי לחקור את המנגנונים של פיתוח. הנה, אנחנו מדגימים את היישום המדויק של microbead לעובר דג הזברה, אשר יכול להיות מנוצל לביצוע מגוון רחב של מבחני על היווצרות רקמה והמורפוגנזה סלולרית.

<table><tbody><tr><td>נתרן כלורי</td><td>AB01915</td><td></td><td>ביואנליטי אמריקאי</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>AB01652</td><td></td><td>ביואנליטי אמריקאי</td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>AB00366</td><td></td><td>ביואנליטי אמריקאי</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Life Science</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-20ML</td><td></td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea (PTU)</td> <td>Aldrich Chemistry</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>אתיל 3-אמינובנזואט (טריקאין)</td> <td>Fluka אנליטי</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>בורוסיליקט זכוכית</td><td>סאטר אינסטרומנטס ושות'</td><td>BF100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה בוער/חום</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>Mo. P097</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>מתילן כחול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>250 מ"ל בקבוק ארלנמאייר</td><td>פישר מדעי</td><td>FB-500-250</td><td></td></tr><tr><td>פלקון צלחות פטרי חד פעמיות,</td><td>קורנינג</td> סטרילי <td>430167</td><td></td></tr><tr><td>60 מ"מ x 15 מ"מ</td><td>VWR</td><td>25373-085</td><td></td></tr><tr><td>100 מ"מ x 15 מ"מ</td><td>VWR</td><td>25373-100</td><td></td></tr><tr><td>150 מ"מ x 15 מ"מ</td><td>VWR</td><td>25373-187</td><td></td></tr><tr><td>Saint-Gobain Chemware Microspatula</td><td>Fischer Scientific</td><td>21-401-50B</td><td></td></tr><tr><td>P-1000 קצות מיקרופיפטה</td><td>Fischer Scientific</td><td>2707402</td><td></td></tr><tr><td>חממה בטמפרטורה נמוכה</td><td>פישר מדעי</td><td>11 690 516DQ</td><td></td></tr><tr><td>דימתלי סולפוקסיד</td><td>AB00435</td><td></td><td>ביואנליטי אמריקאי</td></tr><tr><td>מיקרו-חרוזים (45-106 ומיקרו; m)</td> <td>Biorad</td><td>140-1454 AG1-X8</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-חרוזים (45 ומיקרו; מ)</td> <td>Polysciences</td><td>7314</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו ניתוח פינצטה</td><td>Roboz מכשירים כירורגיים ושות'.</td><td>RS-5010</td><td></td></tr><tr><td>מחט טונגסטן</td><td>Roboz מכשירים כירורגיים ושות'</td><td>מחזיק צינור נימי RS-6065</td><td></td></tr><tr><td></td><td>גלוב סיינטיפיק בע"מ&nbsp;</td><td>ברקוד 51674</td><td></td></tr></tbody></table>

microbead השרשה בעובר דג הזברה

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

דג הזברה התפתחה כמערכת מודל גנטית יקרת ערך לחקר ביולוגיה ומחלות התפתחותיות. דג הזברה לשתף רמה גבוהה של שימור הגנומי, כמו גם דמיון בתהליכים תאיים, מולקולריים, ופיסיולוגיים, עם חוליות אחרות כולל בני אדם. במהלך ontogeny המוקדם, עוברי דג הזברה הם שקופים אופטי, המאפשרים לחוקרים לחזות את הדינמיקה של organogenesis באמצעות סטראו פשוט. השתלת Microbead היא שיטה המאפשרת מניפולציה של רקמות באמצעות השינוי של גורמים בסביבה מקומית. זה מאפשר לחוקרים assay את ההשפעות של כל מספר של מולקולות איתות של עניין, כגון פפטידים מופרשים, בנקודות מרחב ובזמן ספציפיות בעובר המתפתח. כאן, אנו פרטנו פרוטוקול לכיצד לתפעל וחרוזים שתל במהלך התפתחות מוקדמת דג הזברה.

כמה סוגים של כלי מניפולציה שימושיים לטיפול בmicrobeads ביישומי מחקר (איור 1). בנוסף, עובש agarose פשוט עם בארות קטנות יכול להיות מנוצל כדי להחזיק את עובר דג הזברה, שהוא חיוני לביצוע ניסויים אלה במועד והיעיל (איור 1). השתלת microbead יכולה להתבצע במיקום המרחבי ושלב זמני של ריבית, המאפשר לחוקרים כדי לצמצם חלון ספציפי של פעולה למולקולה של עניין. כאן, microbeads אחת הושתלו לתוך עוברי דג הזברה בשלב ניצן זנב או בנקודות זמן מאוחר יותר במהלך שלבי somitogenesis (איור 3). שני microbeads בגדלים שונה, שטף עם הפתרון של רינגר לבד, שימש בהפגנת פרוטוקול זה (איור 3 א, 3 ב ו3C). השתלת microbead זה בהעדר כל מצומדותמולקולות קטנות מוכיחות כי השתלת חרוז יכולה להיות מושגת ללא תופעות מורפולוגיות גולמית במהלך ההתפתחות התקינה של עובר דג הזברה (איור 4). בניסויים עלולים להיתקל בקשיים בתמרון microbead לתוך חור ניקוב נעשה על ידי מחט טונגסטן גבי העובר. כדי להשיג טיפול טוב יותר של microbead להציב פעם אחת בעובר על ידי מיקרו-המחט, ניתן להשתמש זיף / כלי שוט. זה יכול להיות בעל מבנה עם באופן טבעי לשפוך חתולים או כלבי שפם, למרות שיכולים להיות מנוצל חוטי שוט טבעי או סינטטי אחרים (איור 1). דחיפה עדינה של microbead גם עם מחט טונגסטן או כלי הזיף צריכה לראות את microbead לשקוע הפתרון של רינגר של העובש. ברגע שmicrobead שקע לתוך תבניתו יש להעביר למרחקים גדולים במידת צורך באמצעות מחט טונגסטן ופעם אחת על גבי עובר כלי המחט או זיף יכול לשמש לposition microbead לעובר. ההצלחה של השתלת microbead ניתן למדוד באופן מיידי באמצעות הדמיה בסטראו, כחרוז יישאר ממוקמת ביציבות ברקמות. כדי להעריך את עמדת חרוז לאורך זמן, כל דגימת עובר ניתן הדמיה באמצעות צילום בזמן קורס בשידור חי או בדיקה במרווחים תקופתיים (כמתואר באיור 4) כדי להבטיח שמיקום חרוז לא עבר על משך הניסוי בשל רקמת אנדוגני המורפוגנזה. הבנת עמדתו של חרוז לאורך הזמן היא קריטית לפרשנות מושכלת ביותר של תוצאות, כגון הערכת ההשפעה של מולקולה קטנה ברקמות יעד או תהליך התפתחותי. השימוש בצעדים מעל אלה יספקו סביבה אידיאלית שבלהשתיל microbeads לעובר דג הזברה בזמן ומיקום רצויים. מניסיוננו, למשתמשים מתחילים בפרוטוקול השתלת microbead זה בדרך כלל צברו ne המיומנותcessary לבצע השתלה כירורגית עקבית של microbeads לעובר דג הזברה לאחר שבוע אחד של כ בפועל. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig1.jpg" /> כלי 1. איור משמשים לביצוע השתלת microbead. () מגש השתלת חרוז (משמאל, בקוטר 15 סנטימטרים) עם תבניות עובר (משמאל) ומגש דגירה microbead (בצד ימין, 6 סנטימטרים קוטר). מגש עבודה זו מאפשר לחוקר מניח את העוברים לכיוון הרצוי להשתלת microbead, ויש לי microbeads מוכן להשתלה בסמיכות לתחנת מיקרוסקופ. Microbeads צריך להיות מודגרות במולקולה קטנה (ים) ו / או כלי רכב ולאחר מכן לשטוף בצלחת microbead נפרדת (מימין) לפני הצבה אותם לתוך מגש השתלת חרוז שממוקם מתחת לתחנת מיקרוסקופ. (ב) שני זוגות מלקחיים בסדר ישמשו כדי להסיר את Choriעל מקיף כל עובר דג הזברה וגם לשבור את סופו של מחט microcapillary. (ג) מחט טונגסטן יועסק לעשות לנקב יפה מאוד לעובר דג הזברה שלמצב microbead. (ד) פיפטה העברת microcapillary תשמש להרים ולמקם microbead על גבי עובר דג הזברה בסמוך למקום לנקב. (ה) הזיף / כלי השוט יאפשר המיצוב העדין של microbead לאתר החתך בתוך העובר שנעשה בעבר על ידי מחט טונגסטן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig2.jpg" /> איור 2. סכמטי של הליך השתלת microbead. () מגש השתלת microbead עם soaki microbeadsng בפתרון לשטוף הרצוי שהוקם לפי תחנת סטראו, ואת העוברים ממוקמים ברקמות תפנינה כלפי מעלה. (ב) באמצעות מחט טונגסטן, חתך קטן לעובר יכול להתבצע עם תנועה עדיין תקיפה קלה. (ג) בעזרת פיפטה העברת microcapillary, microbead הרצוי ניתן לאסוף מתא הדגירה microbead במגש, ממוקם בצד הימין, והובא לתא השמאלי שבו אזור העבודה העובר נמצא. Microbead צריך להיות מופקד בסמוך למקום החתך, אז ממוקם בעדינות לתוך אתר החתך שנעשה על ידי מחט טונגסטן באמצעות הזיף / כלי השוט. ברגע שmicrobead הוא תמרן באתר החתך, זה צריך להיות תחוב לתוך הרקמה (מהחתך) למצב ביציבות microbead ולמנוע התנועה הבאה מהעובר כפיתוח ממשיך. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig2large.jpg" target="_blank">P</a>לחכור לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig3.jpg" /> יכול להיות מושתל microbeads 3. איור לעוברי בשלבי התפתחות שונה. () עוברי דג הזברה הושתלו עם microbead (קוטר של כ -50 מיקרומטר) לתא המטען בשלב ניצן זנב. כשבדק בשתל 24 שעות שלאחר חרוז (hpbi), העוברים שהתפתחו בצורה נורמלית וmicrobead הראה תנועה מינימאלית בחלוף זמן התפתחותי. עוברי דג הזברה (ב) מושתלים עם microbeads (בקוטר של כ 50 מיקרומטר) לתוך שק החלמון בשלב 3 somite (SS) מוצגים התפתחות תקינה עם תנועת חרוז קטנה יחסית לאורך זמן. (ג) microbeads גדול יותר (בקוטר של כ 70 מיקרומטר) הושתלו לתוך עובר 7 ss דומה הראה התפתחות תקינה שלאחר מכן, כמו גם מיניmal אם תנועה כלשהי מהאתר של השתלה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig4.jpg" /> איור 4. פיתוח ברוטו של עובר דג הזברה הוא מוטרד מהנוכחות של microbead דרך 72 hpbi. עוברי דג הזברה הושתלו עם microbeads הספוג בתמיסת רינגר (בקוטר של כ 50 מיקרומטר) בשלב 7 somite (SS). כל microbead הוכנס בניתוח לתא המטען, בין somites 3 ​​ו -4 הנוכחות של חרוז לא הייתה קשורה לפגמים גלויים התפתחותית בשתל לאחר חרוז 24 שעות (hpbi), 48 hpbi, או 72 hpbi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

דג הזברה הוא מערכת מודל מצוינת למחקרים גנטיים והתפתחותיים. השתלת חרוזים היא טכניקה חשובה למניפולציה של רקמות שניתן להשתמש בה כדי לחקור מנגנוני התפתחות על ידי הכנסת שינויים בסביבות תאיות מקומיות. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע השתלת מיקרו-חרוזים בעובר דג הזברה.

Microbead השרשה בעובר דג הזברה

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשתמש בהשתלת מיקרו-חרוצים (microbeads) כדי להחדיר שינויים בסביבת הרקמה המקומית בנקודות מרחביות וזמניות ספציפיות במהלך האמ בריוגנזה של דגי זברה. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת מגש להשתלת חרוצים כדי להקל על הטיפול המדויק וההשתלה של המיקרו-חרוצים. כשלב שני, ביצי דגי הזברה מדגרות עד לשלב ההתפתחות הרצוי.לאחר מכן מכינים את המיקרו-חרוצים בתמיסות הניסוייות המתאימות ומעבירים אותם בזהירות למיקום הרצוי בתוך העובר. בסופו של דבר, ניתן לבצע השתלת מיקרו-חרוצים ללא פגיעה בהתפתחות הרגילה של דגי הזברה, מה שמאפשר הערכה של השפעות המולקולות הנחקרות על העוברגנזה של דגי הזברה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית, כגון כיצד מולקולות שונות משפיעות על תהליך האורגנוגנזה?באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בתחילה, שכן נדרש תרגול כדי לרכוש מיומנות בטיפול במיקרו-חרוצים (microbeads). להכנת מגש השתלת המיקרו-חרוצים, חממו תחילה תמיסת 2%aro שהוכנה טריה למשך 90 שניות. השתמשו בבקבוק ארלנמאייר בנפח 250 milliliter, תוך סיבוב של הבקבוק כל 30 שניות כדי למנוע מהג'ל לגלוש החוצה עקב התבעבעות.בשלב הבא, הניחו את המכסה של צלחת פטרי בגודל 60 על 15 מילימטר בתוך צלחת בגודל 150 על 15 מילימטר, כך שהחלק הפנימי של המכסה פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, כאשר מקבעים את המכסה של צלחת הפטרי הקטנה באמצעות אצבע המורה, שפכו את ג'ל ה-aros החם לתוך הצלחת הגדולה יותר.אפשרו לשכבה דקה של agros להיווצר מתחת למכסה הקטן כדי למנוע היווצרות עיבוי ולהקל על ראיית החרוצים תחת המיקרוסקופ בעוד ה-agros מתקרר. לפני שהג'ל מתמצק, הכניסו בזווית הדרגתית תבנית בור (well mold) לחלקו העליון של הג'ל כדי לאפשר הנחה קלה יותר של העוברים. כאשר הג'ל התמצק, השתמשו במרית מיקרוסקופית (micros spatula) כדי להסיר בזהירות את תבנית הבור.לאחר מכן, הוסיפו את תמיסת E three לצלוחית ואחסנו אותה בטמפרטורה של 4 °C. כדי לאסוף את עוברי דג הזברה, מלאו תא הזדווגות במי מערכת. לאחר מכן, הניחו מחיצה במרכז התא והכניסו דגי זברה זכרים ונקבות בוגרים לצדדים המתאימים של התא.למחרת בבוקר, השתמשו במסננת רשת דקה כדי לאסוף את הביצים ההפריות. הפכו את המסננת בתוך צלחת פטרי נקייה בקוטר 10 סנטימטר, ושטפו את הרשת בזרם דק של E three עד שלא יישארו ביצים במסננת, ויהיו בצלחת כ-25 milliliters של תמיסת E three. לאחר מכן, חלקו את הביצים בין מספר צלחות, ביחס של 50 עד 60 ביצים לצלחת כדי למנוע צפיפות יתר, והדגירו את הביצים בתמיסת E three בטמפרטורה של 28.5 degrees Celsius. לפני השתלת המיקרו-בידס (microbeads), הדגירו אותן בנפח המתאים של המולקולה הנבדקת או של חומר הבקרה (control vehicle) למשך פרק הזמן המתאים.כאשר העוברים מגיעים לנקודת הזמן ההתפתחותית הרצויה, השתמשו בפינצטה עדינה כדי להסיר את ה-kons והדגירו את דגי הזברה בתוך תמיסת ringer מסוננת, המועשרת באנטיביוטיקה, למשך 10 דקות בזמן שהעוברים עוברים אקלימציה. העבירו את המיקרו-חרוצים (micro beads) אל פלטת המיקרו-חרוצים שהוכנה מראש, הממוקמת בתוך מגש ההשתלה, ושטפו את החרוצים ואת תמיסת ה-ringer למשך 10 דקות.בתוך 50 דקות משטיפת החרוצים, סדרו עובר אחד בכל פעם בתוך באר של מגש ההשתלה, כך שיהיה גישה לאזור השתלת המיקרו-חרוצים. בעזרת מחט טונגסטן, בצעו חתך קטן בעובר, ולאחר מכן לחצו על נורת השאיבה של פיפטת העברה מיקרו-קפילרית כדי למשוך בעדינות מיקרו-חרוץ לתוך עמוד הקפילרה, ושחררו את הלחץ כדי להעביר את המיקרו-חרוץ למגש ההשתלה כדי להקל על הטיפול בו. דחפו בעדינות את החרוץ כדי שישקע לתוך תמיסת הרינגר בתוך התבנית.לאחר מכן, בעזרת המחט המיקרוסקופית, העבירו את המיקרו-חרוד אל העובר ואל תוך החתך. לבסוף, השתמשו בכלי השערה (whisker tool) כדי להרחיק את המיקרו-חרוד מאתר החתך, כדי שהחרוד לא יידחף החוצה בזמן ההחלמה. ניתן להעריך באופן מיידי את הצלחת השתלת המיקרו-חרוד באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי, שכן החרוד יישאר במיקום יציב בתוך הרקמה.בניסוי זה, חרוזי מיקרו בודדים בשני גדלים שונים שנשטפו בתמיסת רינגר בלבד הושתלו בעוברי דג זבברה (zebrafish) בשלב ניצן הזנב, או בנקודות זמן מאוחרות יותר במהלך המיוגנזה, כדי להבטיח שמיקום החרוד לא השתנה במהלך הניסוי עקב מורפוגנזה של רקמה אנדוגנית. ניתן להדמיא את דגימות העוברי באמצעות צילום של מהלך החיים או לבדוק אותן במרווחי זמן תקופתיים, כפי שהתמונות מדגימות את השתלת חרוזי המיקרו. בהיעדר כל צימוד, ניתן להשיג מולקולות קטנות ללא השפעות מורפולוגיות גסות במהלך הפיתוח הנורמלי של עוברי דג ה-SPR.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון Whole Mount In situ hybridization כדי לחקור כיצד ה-Microbead משפיע על ביטוי גנים. באופן כללי, הבנת מיקום החרוד לאורך זמן היא קריטית לפרשנות של התוצאות, כגון הערכת ההשפעות של מולקולה קטנה על רקמת מטרה או על תהליך התפתחותי.

microbead-implantation-in-the-zebrafish-embryo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

בסרטון הזה, אנחנו מראים שיטה שבאמצעותה לנתח את המוח חוליות עוברי דג הזברה מתפתח לחיות ברזולוציה של תא בודד על ידי מיקרוסקופיה confocal. זה כולל את השיטה שבאמצעותה אנו מזריקים את העובר מתא בודד דג הזברה ולאחר מכן הר התמונה במוח המתפתח.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

עוברי דג הזברה שקוף הוכיחו המארחים מודל שימושי כדי לחזות אינטראקציות למידה תפקודית בין תאים חיסוניים מולדים פתוגנים חיידקיים תאיים,...

זיהום של עוברים דג הזברה עם פתוגנים חיידקיים תאיים

סרטון זה מתאר טכניקה של מיקרו-הזרקה של עוברים כדי להעביר תרכובות לתוך שק החלמון של דג הזברה.

מיקרו-הזרקה עוברית: טכניקה להעברת תרכובת לחלמון דג הזברה

מקור: Zhang, X. et al., מודל עובר של דג זברה להדמיה In Vivo וניתוח תוך-חיוני של זיהום סטפילוקוקוס זהוב הקשור לביו-חומר. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים מודל עוברי של דג זברה לחקר זיהומים הקשורים לביו-חומרים מושתלים. הזרקת סטפילוקוקוס זהוב עם מיקרוספירות פוליסטירן משפרת את הישרדות החיידקים, ומאשרת את תפקידם של חומרים מושתלים בקידום זיהום.

ניתוח in vivo של זיהומים חיידקיים הקשורים להשתלה באמצעות עוברי דג זברה

מקור: שי, ג', ואח', סקר וזיהוי מדכאי השתקת RNA מאפקטורים מופרשים של פתוגנים צמחיים. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים את ההליך להכנת תרבית Agrobacterium tumefaciens על ידי השראת ביטוי גנים של אלימות באמצעות אצטוסירינגון, ולאחר מכן הסרת אנטיביוטיקה באמצעות שטיפה והשעיה מחדש, ליצירת השעיה מוכנה לשינוי להעברת גנים לרקמות הצמח.

מיקרוהזרקה של חיידקים לווריד הזנב של עוברי דגי זברה

המחקר הנוכחי מתאר מודל העובר דג זברה ויזואליזציה ויוו וניתוח intravital לזיהום הקשורים biomaterial לאורך זמן מבוסס על קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. מודל זה היא מערכת מבטיח משלימים מודלים בעלי חיים יונקים כגון עכבר מודלים לימוד הקשורים biomaterial זיהומים ויוו.

מודל העובר דג זברה, ויזואליזציה Vivo, ניתוח Intravital של Biomaterial-הקשורים Staphylococcus aureus זיהום

מניפולציות עובריות כגון סילוק והשתלת תאים הן כלים חשובים לחקר ההתפתחות המוקדמת. פרוטוקול זה מתאר מכשיר השתלה פשוט ויעיל לביצוע מניפולציות אלה בעוברי דגי זברה.

מכשיר השתלה פשוט ויעיל לעוברי דגי זברה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקור את התכונות המכניות התאיות של תאי זברה עובריים מבודדים בכליאה תלת מימדית עם מדידת כוח ישירה על ידי מלכודת אופטית.

מדידות כוח ישירות של מכניקה תת-תאית בכליאה באמצעות פינצטה אופטית

פרוטוקול זה מדגים את המיקרו-הזרקה של ליפופוליסכריד לאזור חדר המוח במודל של זחל דג זברה כדי לחקור את התגובה הנוירו-דלקתית והרעילות העצבית המתקבלות כתוצאה מכך.

מיקרו-הזרקות חדריות למוח של ליפופוליסכריד לדגי זברה זחליים להערכת דלקת עצבית ורעילות עצבית

במחקר זה, אנו מתארים שיטה פשוטה לביצוע ניתוח צבע כחול של אוונס (EBD) על זחלי דג הזברה.  טכניקה זו היא כלי רב עוצמה לאפיון שלמות שרירי השלד ותיחום מודלים של דג זברה של ניוון שרירים, והיא שיטה רבת ערך לפיתוח טיפולים חדשים.

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

למדו שיטת השרשת מיקרו-חרוזיות בעוברי דג הזברה לחקר ביולוגיה התפתחותית. טכניקה זו מאפשרת לשנות את הסביבה הרקמית מקומית מבלי לשבש את ההתפתחות הנורמלית ולחקור השפעות מולקולריות על אורגנוגנזה.

Microbead השרשה בעובר דג הזברה

גלה סרטונים נוספים