Microbead השרשה בעובר דג הזברה
30 ביולי 2015
דג הזברה הוא מערכת מודל מצוינת למחקרים גנטיים והתפתחותיים. השתלת חרוזים היא טכניקה חשובה למניפולציה של רקמות שניתן להשתמש בה כדי לחקור מנגנוני התפתחות על ידי הכנסת שינויים בסביבות תאיות מקומיות. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע השתלת מיקרו-חרוזים בעובר דג הזברה.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשתמש בהשתלת מיקרו-חרוצים (microbeads) כדי להחדיר שינויים בסביבת הרקמה המקומית בנקודות מרחביות וזמניות ספציפיות במהלך האמ בריוגנזה של דגי זברה. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת מגש להשתלת חרוצים כדי להקל על הטיפול המדויק וההשתלה של המיקרו-חרוצים. כשלב שני, ביצי דגי הזברה מדגרות עד לשלב ההתפתחות הרצוי.
לאחר מכן מכינים את המיקרו-חרוצים בתמיסות הניסוייות המתאימות ומעבירים אותם בזהירות למיקום הרצוי בתוך העובר. בסופו של דבר, ניתן לבצע השתלת מיקרו-חרוצים ללא פגיעה בהתפתחות הרגילה של דגי הזברה, מה שמאפשר הערכה של השפעות המולקולות הנחקרות על העוברגנזה של דגי הזברה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה ההתפתחותית, כגון כיצד מולקולות שונות משפיעות על תהליך האורגנוגנזה?
באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בתחילה, שכן נדרש תרגול כדי לרכוש מיומנות בטיפול במיקרו-חרוצים (microbeads). להכנת מגש השתלת המיקרו-חרוצים, חממו תחילה תמיסת 2%aro שהוכנה טריה למשך 90 שניות. השתמשו בבקבוק ארלנמאייר בנפח 250 milliliter, תוך סיבוב של הבקבוק כל 30 שניות כדי למנוע מהג'ל לגלוש החוצה עקב התבעבעות.
בשלב הבא, הניחו את המכסה של צלחת פטרי בגודל 60 על 15 מילימטר בתוך צלחת בגודל 150 על 15 מילימטר, כך שהחלק הפנימי של המכסה פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, כאשר מקבעים את המכסה של צלחת הפטרי הקטנה באמצעות אצבע המורה, שפכו את ג'ל ה-aros החם לתוך הצלחת הגדולה יותר.
אפשרו לשכבה דקה של agros להיווצר מתחת למכסה הקטן כדי למנוע היווצרות עיבוי ולהקל על ראיית החרוצים תחת המיקרוסקופ בעוד ה-agros מתקרר. לפני שהג'ל מתמצק, הכניסו בזווית הדרגתית תבנית בור (well mold) לחלקו העליון של הג'ל כדי לאפשר הנחה קלה יותר של העוברים. כאשר הג'ל התמצק, השתמשו במרית מיקרוסקופית (micros spatula) כדי להסיר בזהירות את תבנית הבור.
לאחר מכן, הוסיפו את תמיסת E three לצלוחית ואחסנו אותה בטמפרטורה של 4 °C. כדי לאסוף את עוברי דג הזברה, מלאו תא הזדווגות במי מערכת. לאחר מכן, הניחו מחיצה במרכז התא והכניסו דגי זברה זכרים ונקבות בוגרים לצדדים המתאימים של התא.
למחרת בבוקר, השתמשו במסננת רשת דקה כדי לאסוף את הביצים ההפריות. הפכו את המסננת בתוך צלחת פטרי נקייה בקוטר 10 סנטימטר, ושטפו את הרשת בזרם דק של E three עד שלא יישארו ביצים במסננת, ויהיו בצלחת כ-25 milliliters של תמיסת E three. לאחר מכן, חלקו את הביצים בין מספר צלחות, ביחס של 50 עד 60 ביצים לצלחת כדי למנוע צפיפות יתר, והדגירו את הביצים בתמיסת E three בטמפרטורה של 28.5 degrees Celsius. לפני השתלת המיקרו-בידס (microbeads), הדגירו אותן בנפח המתאים של המולקולה הנבדקת או של חומר הבקרה (control vehicle) למשך פרק הזמן המתאים.
כאשר העוברים מגיעים לנקודת הזמן ההתפתחותית הרצויה, השתמשו בפינצטה עדינה כדי להסיר את ה-kons והדגירו את דגי הזברה בתוך תמיסת ringer מסוננת, המועשרת באנטיביוטיקה, למשך 10 דקות בזמן שהעוברים עוברים אקלימציה. העבירו את המיקרו-חרוצים (micro beads) אל פלטת המיקרו-חרוצים שהוכנה מראש, הממוקמת בתוך מגש ההשתלה, ושטפו את החרוצים ואת תמיסת ה-ringer למשך 10 דקות.
בתוך 50 דקות משטיפת החרוצים, סדרו עובר אחד בכל פעם בתוך באר של מגש ההשתלה, כך שיהיה גישה לאזור השתלת המיקרו-חרוצים. בעזרת מחט טונגסטן, בצעו חתך קטן בעובר, ולאחר מכן לחצו על נורת השאיבה של פיפטת העברה מיקרו-קפילרית כדי למשוך בעדינות מיקרו-חרוץ לתוך עמוד הקפילרה, ושחררו את הלחץ כדי להעביר את המיקרו-חרוץ למגש ההשתלה כדי להקל על הטיפול בו. דחפו בעדינות את החרוץ כדי שישקע לתוך תמיסת הרינגר בתוך התבנית.
לאחר מכן, בעזרת המחט המיקרוסקופית, העבירו את המיקרו-חרוד אל העובר ואל תוך החתך. לבסוף, השתמשו בכלי השערה (whisker tool) כדי להרחיק את המיקרו-חרוד מאתר החתך, כדי שהחרוד לא יידחף החוצה בזמן ההחלמה. ניתן להעריך באופן מיידי את הצלחת השתלת המיקרו-חרוד באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי, שכן החרוד יישאר במיקום יציב בתוך הרקמה.
בניסוי זה, חרוזי מיקרו בודדים בשני גדלים שונים שנשטפו בתמיסת רינגר בלבד הושתלו בעוברי דג זבברה (zebrafish) בשלב ניצן הזנב, או בנקודות זמן מאוחרות יותר במהלך המיוגנזה, כדי להבטיח שמיקום החרוד לא השתנה במהלך הניסוי עקב מורפוגנזה של רקמה אנדוגנית. ניתן להדמיא את דגימות העוברי באמצעות צילום של מהלך החיים או לבדוק אותן במרווחי זמן תקופתיים, כפי שהתמונות מדגימות את השתלת חרוזי המיקרו. בהיעדר כל צימוד, ניתן להשיג מולקולות קטנות ללא השפעות מורפולוגיות גסות במהלך הפיתוח הנורמלי של עוברי דג ה-SPR.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון Whole Mount In situ hybridization כדי לחקור כיצד ה-Microbead משפיע על ביטוי גנים. באופן כללי, הבנת מיקום החרוד לאורך זמן היא קריטית לפרשנות של התוצאות, כגון הערכת ההשפעות של מולקולה קטנה על רקמת מטרה או על תהליך התפתחותי.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול להשתלת מיקרו-בידס (microbeads) בעוברי זבבורג (zebrafish), טכניקה המועילה לחקר הביולוגיה ההתפתחותית. שיטה זו מאפשרת לחוקרים להשפיע על סביבת הרקמה המקומית מבלי להפריע להתפתחות תקינה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה התפתחותית
- גנטיקה
- אמבריולוגיה
רקע
- דגי זברה הם אורגניזם מודל בעל ערך למחקרים גנטיים.
- השתלת מיקרו-חרוזי (Microbead) יכולה לשנות סביבות תאיות מקומיות.
- טכניקה זו מסייעת בהבנת מנגנוני התפתחות.
- היא מאפשרת להעריך השפעות מולקולריות על אורגנוגנזה.
מטרת המחקר
- להחדרת שינויים בסביבת הרקמה במהלך העוברים של דגי הזברה.
- להערכת ההשפעה של מולקולות ספציפיות על תהליכי התפתחות.
- לשכלול טכניקת השתלת חרוזי מיקרו (microbeads) להשגת תוצאות ניסיוניות טובות יותר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של מגש להשתלת מיקרו-בידס.
- דגירה של עוברים של דגי זברה (zebrafish) עד לשלב ההתפתחות הרצוי.
- השתלה זהירה של מיקרו-בידס לתוך העוברים באמצעות מחט טונגסטן.
- תצפית על יציבות המיקרו-בידס והשפעותיהם על ההתפתחות.
תוצאות עיקריות
- השתלה מוצלחת של חריזי מיקרו (microbeads) ללא פגיעה בהתפתחות תקינה.
- חריזי המיקרו נותרו במיקום יציב בתוך הרקמה.
- הערכה חזותית של העובריים לא הראתה השפעות מורפולוגיות גסות.
- פוטנציאל למחקרים נוספים על ביטוי גנים ותהליכי התפתחות.
מסקנות
- השתלה של מיקרו-beads היא שיטה יעילה לחקר ביולוגיה התפתחותית.
- הבנת מיקום ה-beads קריטית לפרשנות של תוצאות הניסוי.
- טכניקה זו יכולה לסייע במחקר של השפעותיהם של מולקולות שונות על ההתפתחות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך המנהלים
השתלת מיקרו-חרוזיים (Microbeads) בעוברים של דגי זבבורש מאפשרת מניפולציה מרחבית-זמנית מדויקת של מולקולות איתות לבחינת מסלולי התפתחות. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות (target validation) על ידי מתן אפשרות להערכה תפקודית של השפעות מולקולריות על אורגנוגנזה ללא שיבוש מורפולוגי משמעותי. השיטה מספקת מערכת רלוונטית למחלות עבור הפחתת סיכונים מכניסטיים (mechanistic de-risking) בשלבי הגילוי המוקדמים, ובמיוחד עבור מסלולים שמורים בין דגי זבבורש לבני אדם.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות על ידי שינוי סביבות רקמה מקומיות באמצעות פפטידים מופרשים או מולקולות איתות רלוונטיות.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות תצפית ישירה על יציבות החרוגים והשפעות פנוטיפיות באמצעות מיקרוסקופ סטריאו.
- ערך ניבוי: מסייע בהערכת ההשפעה המולקולרית על תהליכי התפתחות, ובכך תורם לביסוס הביטחון במטרה ולמיון תיקי הפיתוח.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מכין מערכות ביולוגיות עוברות תיקוף להמשך ניתוח, כגון whole mount in situ hybridization, לצורך חקר שינויים בביטוי גנים.
- פלט כמותי: מאפשר ויזואליזציה של מיקום החרוגים לאורך זמן, ובכך מאפשר קורלציה בין חשיפה מולקולרית לתוצאות התפתחותיות.
- יכולת הרחבה (Scalability): ניתן להדגיר עוברים בפורמטים של מרובי בארות ולהדגיריהם עם מולקולות בדיקה לפני השתלה, דבר התומך בסריקה בקיבולת בינונית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מנצל שימור גנומי גבוה בין דגי זברה לבני אדם כדי למדל תהליכי התפתחות של בעלי חוליות.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין מודולציה של מסלולים בשלב הגילוי לבין תוצאות פנוטיפיות הרלוונטיות להפרעות מולדת או לרפואה רגנרטיבית.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאפשר להעריך האם ההשפעות שנצפו נובעות מפעילות מולקולרית ספציפית ולא מרעילות התפתחותית.
שילוב נתיבי עבודה ותהליכי עבודה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי החל מתיקוף מטרות, דרך סריקה פנוטיפית ועד להערכה פרה-קלינית, ובמיוחד עבור מסלולים השולטים במורפוגנזה ובאורגנוגנזה.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת השערות על ידי מתן אפשרות להחדרה מקומית של מולקולות לאזורים עובריים ספציפיים בשלבים מוגדרים.
- סריקה: מתאר הכנה של עובריים בתמיסות של מולקולות בדיקה לפני השתלה, מה שמאפשר הערכה של חשיפה לתרכובות.
- אנליטיקה: מסתמך על מיקרוסקופיה סטריאוסקופית ודימוי Time-lapse למעקב אחר מיקום החרוז והתקדמות התפתחותית כמדדי קריאה מרכזיים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין הפרעה מולקולרית בעובריים לבין ניתוח ביטוי גנים במורד הזרם, ובכך תומך בתיקוף של מסלולים המותאמים לסממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להגדיר סטנדרט למגש ההשתלה ולכלים למיקרו-כירורגיה עבור פרויקטים הבוחנים מורפוגנים שונים או רקעים גנטיים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק תובנה מכניסטית לגבי ויסות מסלולים על ידי מתן שליטה מרחבית וזמנית מדויקת של הצגה מולקולרית.
- ערך תפעולי: פרוטוקולים סטנדרטיים להכנת מגשים ולטיפול בחרוזים משפרים את השחזוריות בין משתמשים ומעבדות.
- ערך אסטרטגי: מפחית עמימות בתיקוף המטרה על ידי הפרדה בין השפעות מולקולריות לבין רעילות מערכתית או עיכוב התפתחותי.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר קבלת החלטות מוקדמתים של go/no-go על בסיס השאלה האם מולקולה משבשת מסלול רלוונטי בהקשר של חרשrtimes Vertebrate.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרו-כירורגיה ובאמבריולוגיה של דגי זבראפיש כדי לטפל בעובריים ולהשתיל חרו지를 מבלי לגרום לנזק קטלני.
- תלויה בציוד הכולל מחטי טונגסטן, פיפטות מיקרו-קפילריות ומיקרוסקופי סטריאו למניפולציה מדויקת של החרוזים.
- מחייבת סטנדרטיזציה של שלבי התפתחות העוברים, גודל החרוז ותנאי התמיסות כדי להבטיח השוואתיות בין ניסויים.
- ההתאמה למערכות מודל אחרות עשויה להיות מוגבלת בשל הנגישות האופטית וההתפתחות החיצונית הייחודית לעוברי זבראפיש.
- מגבלות מעשיות כוללות את עקומת הלמידה של הטיפול בחרוזים ואת הצורך לוודא שהמולקולות המושתלות נשארות פעילות ביולוגית וממוקמות באופן מקומי.
