פשוט וחוש ריח בדיקה לעכברים בסיוע מחשב

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבחון אפליה ריחנית מולדת, העדפה ריחנית, הימנעות או רגישות ריחנית בעכברים. דבר זה מושג על ידי חשיפת העכבר למשיך או דוחה חדש, ולריח ניטרלי, שהוא מים. במקביל, מצלמת וידאו מקליטה את המפגש ההתנהגותי.

בשלב הבא, הסרטון מנותח בתוכנת Image J באמצעות המקרוס המסופקים כדי לקבל את הזמן שהושקע בפרמטרים של ריח ומים. התוצאות מראות התנהגות של העדפה או הימנעות מריחות בהשוואה למים בקרב גנוטיפים שונים, בהתבסס על ניתוח ממוחשב לאחר הבדיקה (post hoc). היתרון המרכזי של בדיקת חוש הריח זו על פני שימוש בזירה ייעודית ובמערכת ריח הוא השימוש בזירה מוכרת, ולכן היא מאפשרת ביצוע מהיר והקמה פשוטה.

בנוסף, נעשה שימוש בחומרה זולה. את הפרוצדורה ידגים Emmanuel Abry, סטודנט במעבדה שלי. לניסוי זה, השתמשו בעכברים זכרים בני שלושה עד חמישה חודשים, מסוג C 57 black, כולל עכברי wild type ועכברים טרנסגניים. הדגמה זו משתמשת בשני קווי knockout ובביקורות litter mate.

עבור זירות הניסוי, השתמשו בכלובים סטריליים ונקיים לעכברים עם שכבת מצע בעובי של שלושה סנטימטרים. לאחר מכן, הכינו את מערך המצלמה. מקמו אותה בגובה של 58 סנטימטרים מעל רצפת הכלוב על גבי מעמד חצובה מותאם אישית.

סמנו סימונים על המשטח כדי להגדיר את מיקומו של הכלוב. לצורך קבלת תמונה מרכזית, הגדירו את המצלמה להקלטת וידאו ברזולוציה של 320 על 240 פיקסלים בקצב של כ-15 פריימים לשנייה. להכנת הבדיקה, השתמשו בתרכיזים של כל ריח המאוחסנים בממס במידת האפשר.

עבור מבחן ההעדפה, הכין תמיסה של 10% משקל לנפח של חמאת בוטנים בשמן בוטנים. עבור מבחן ההימנעות, השתמש בתמיסה של 98% של חומצה מתיל בוטית. עבור מבחן הרגישות, אסוף שתן מנקבת מאותה זן עכבר יום עד יומיים לפני הבדיקה.

יש לקבע נקבה כך שבטנה תהיה מעל רשת הכלוב ולאסוף טיפות משתן לתוך צלחת פלסטיק. יש לאסוף דגימות ממספר נקבות לצורך נורמליזציה. בשל שונות בין-פרטית, יש לאחד את כל הדגימות לשפופרת של 1.5 milliliter ולאחסנה בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius.

כדי להתחיל בהרגלת בעלי החיים, מקמו בעל חיים אחד בכלוב נקי והניחו לו לחקור את הסביבה. למשך חמש דקות, הסביבה בכלוב הבדיקה צריכה להיות דומה לזו של כלוב הבית. חזרו על שלב ההרגלה פעם אחת בכל יום בדיקה; עם סיום תקופת ההרגלה, התחילו בהקלטה וטפטפו 60 µL של ריח נעים.

במקרה זה, מרחו חמאת בוטנים על קיר אחד, ועל הקיר ממול, טפטפו כמות שווה של מים. זהו ריח ניטרלי; יש להניח את הטיפות בגובה של כ-10 סנטימטרים על כל אחד מהקירות. כעת אפשרו לבעל החיים לחקור את הסביבה במשך שתי דקות, ולאחר מכן הפסיקו את ההקלטה והחזירו את העכבר לכלוב המגורים שלו.

חזור על התהליך עם כל עכבר שייבדק, תוך שימוש בכלים חדשים בכל פעם. שלושה עד חמישה ימים לאחר ביצוע כל מבחני ההעדפה, בצע את מבחן ההימנעות באמצעות כלוב בדיקה חדש.

עבור כל עכבר, בצע את מבחן ההימנעות. בדומה למבחן המשיכה, החלף רק את הריח הנעים בריח ההימנעות, שהוא two methyl butyric acid. עבור מבחן הרגישות, ניתן להשתמש שוב בכלוב אחד בין ניסויים עבור אותו עכבר.

סמנו את צד המים של הכלוב והכינו נייר ספוג ב-70% ethanol לניקוי הדפנות הקצרות בין הניסויים. ביום הניסוי, הכינו ארבעה ריכוזים של השתן באמצעות סדרת דילול של פי עשרה. באמצעות מים מזוקקים פעמיים, בדומה למבחן ההימנעות, הרגילו כל חיה לכלוב הבדיקה שלה למשך חמש דקות.

לאחר מכן, חשפו כל עכבר תחילה לשתן בדילול הגבוה ביותר, שהוא 1 ל-10,000. בזמן ההקלטה, מרחו את השתן המדולל על כלוב הבדיקה ומרחו מים על הקיר הנגדי. כפי שנעשה בבדיקות אחרות, אפשרו לבעל החיים לחקור את הסביבה.

במשך שתי דקות. לאחר מכן, העבירו את החיה לכלוב עכברים נקי. לאחר שכל החיות נחשפו לריכוז הנמוך ביותר, נקו את כל דפנות כלוב הבדיקה וחזרו על הבדיקה בכל עכבר באמצעות השתן בריכוז הגבוה הבא.

המשך בתהליך זה עד לבדיקת השתן הטהור. לאחר איסוף כל הנתונים עבור ניסוי, פתח את הסרטונים ב-Image J לצורך כיוון ועיבוד, שפרטיה מסופקים בטקסט של הפרוטוקול בהתאם לשיטות המתוארות. שני קווי knockout שונים.

קבוצות B ו-C הושוו לקבוצת הביקורת A שהוכנה משבב. מבחן t של Student לא מכוון, עם שונות שווה או לא שווה, משווה את הזמן שהושקע בין הריח למים בתוך הגנוטיפים. השווה את ההתנהגות בין הגנוטיפים באמצעות ANOVA חד-כיווני. שתי הקבוצות הניסיוניות, B ו-C, לא הראו העדפה לריח המושך. במבחן ההימנעות, התגובה כלפי ריח ה-two methyl butyric acid הדוחה הייתה כמצופה עבור קבוצות A ו-B, אך קבוצה C לא הראתה התנהגות הימנעות מריח זה.

בבדיקת הרגישות, סף המשיכה התקבל על ידי חיסור הזמן שהושלם עם מים מהזמן שהושלם עם שתן, כאשר העדפה לשתן על פני מים נצפתה בדילול של 1 ל-1000. לעומת זאת, שתי הקבוצות הניסיוניות, B ו-c, נזקקו לריכוז גבוה פי 100 כדי להפגין העדפה. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה תוך מספר שעות אם היא מבוצעת כראוי; לאחר מכן, ובהמשך לנהל זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו למידה ואבדה של תגובה ריחית (olfactory extinction) כדי לחקור פלסטיות ולמידה ריחית.