מישורי צבע מערכת דיפוזיה לחקירת Chemotaxis בקולגן מטריקס 3D

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור תא דיפוזיה של שיפוע פלנר כדי לחקור מיסי כימותרפיה במטריצת קולגן תלת מימדית. זה מושג על ידי ייצור תחילה של תבנית סיליקון תלת מימדית באמצעות תא הדמיה של תאים חיים. השלב השני הוא להכין החלקות כיסוי הידרופיליות והידרופוביות ולהשתמש בהן להרכבת תבנית הסיליקון התלת מימדית.

לאחר מכן, תערובת תאי הקולגן מתווספת לתא המרכזי ומניחה לה להתפלמר. השלב האחרון הוא להסיר את החלקות הכיסוי ההידרופוביות מהתבנית לאחר הדגירה ולהוסיף מדיה רגילה למאגר אחד ומדיה עם מושך כימותרפיה למאגר השני. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה קונפוקלית משמשת למעקב אחר כימוטקסיס תאים לאורך זמן ולהמחשת תזוזה של תנועת התאים בתוך מטריצת הקולגן.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני טכניקות קיימות כמו תא הבוין ומיקרו אתלטיקה, הוא שהיא מאפשרת הגדרה פשוטה לחקור הגירה במרחב תלת מימדי עם שיפוע דיפוזיה פשוט, ללא שימוש בפיפטה חד פעמית. מדוד 150 מיקרוליטר של האמינו סלין A-P-T-M-S ושפך אותו בצינור של 50 מיליליטר. לאחר מכן הוסיפו 30 מיליליטר של 100% אתנול לצינור בעזרת פיפטה חד פעמית שנייה, וסגרו את המכסה.

מערבל את התמיסה למשך שתי דקות כדי להבטיח ערבוב מלא. לאחר מכן שופכים את התמיסה בצלחת פטרי מזכוכית ומניחים בצד. לאחר מכן, שפכו 15 מיליליטר של 100% אלכוהול אתילי בצלחת פטרי שנייה והניחו אותה עם המנה הראשונה בעזרת פיפטה חד פעמית חדשה.

מודדים 30 מיליליטר מים נטולי יונים ושופכים את התמיסה לצינור של 50 מיליליטר. לאחר מכן, השתמש בפיפטה חד פעמית חדשה כדי להוסיף 1.875 מיליליטר גלו אלדהיד לצינור ולסגור את המכסה. מערבלים את התמיסה למשך שתי דקות, ואז יוצקים את התערובת לצלחת פטרי שלישית.

בעזרת מלקחיים מוציאים 1 22 מילימטר כיסוי זכוכית עגול ושוטפים את שני הצדדים בתערובת אתנול 100%. בעזרת פיפטה חד פעמית, הכניסו את מכסה זכוכית השטיפה לכלי הראשון שמכיל אמינו סלין והניחו לו לשבת בתמיסה במשך חמש דקות בעזרת מלקחיים. הוצא את פתק מכסה הזכוכית ושטוף אותו שוב עם 100% אתנול.

לאחר מכן זרוק את מכסה הזכוכית השטופה לתוך הכלי עם גלוטרלדהיד והניח אותו בצד למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, הסר את החלקת כיסוי הזכוכית בעזרת מלקחיים ושטוף אותו במים נטולי יונים. מניחים את החלקת הכיסוי השטוף על טישו לייבוש למשך הלילה בטמפרטורת החדר.

להכנת החלקות כיסוי הידרופוביות, הוסף תחילה 500 מיקרוליטר של TTS 100 מיקרוליטר חומצה אצטית ו -19.4 מיליליטר האן בצינור של 50 מיליליטר ומערבל אותו למשך שתי דקות. לאחר מכן שפכו את התמיסה לצלחת פטרי מזכוכית והשתמשו במלקחיים נקיים כדי להפיל כיסוי זכוכית אחד, להחליק לתוך התמיסה המוכנה ולהשאיר אותה שם למשך שתי דקות. לאחר שתי דקות, הוציאו את פתק כיסוי הזכוכית בעזרת מלקחיים ושטפו אותו במים נטולי יונים באמצעות פיפטה חד פעמית, הניחו את החלקה על טישו והניחו לה להתייבש בטמפרטורת החדר למשך הלילה.

אחסן את פתקי הכיסוי המיובשים בצלחת פטרי מפלסטיק עד שהם נחוצים כדי להתחיל, הרכיבו את תא ההדמיה של התא החי כמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. לאחר מכן, מערבבים את תמיסות אלסטומר הסיליקון לפי הוראות היצרן להכנת חמישה מיליליטר אלסטומר. לאחר מכן השתמש במרית מעבדה חד פעמית כדי לשפוך לאט את תמיסת אלסטומר הסיליקון לתוך מערך תא ההדמיה של התא החי כדי לא להפריע לרכיבי התבנית.

הניחו את התבנית בצד במקום בטוח כדי לאצור את טמפרטורת החדר למשך הלילה. למחרת בבוקר, שלפו את התבנית בעזרת מלקחיים וחלצו בזהירות את קוביית המתכת מאלומיניום מעובדת מהתבנית. לאחר מכן, גשו לכיור ושטפו את התבנית במים נטולי יונים, ואז הניחו את התבנית על מגבת נייר לייבוש.

לאחר הייבוש, השתמש בסכין תחביב כדי לחתוך חריצים במרחק של 2.34 מילימטרים זה מזה מכל קצה אורך בתוך תבנית הסיליקון. ודא שהתבנית נשארת במקום בטוח ויבש עד הדרוש לניסוי לפני השימוש. שוטפים את התבנית עם אתנול 90% ומניחים את התבנית בצלחת פטרי מלאה במים נטולי יונים לשבת למשך הלילה.

למחרת בבוקר מעבירים את התבנית למגבת נייר ומניחים לה להתייבש באוויר בזמן שהתבנית מתייבשת. השתמש בכלי שרבוט יהלום דיוק גבוה כדי לחתוך את הריבוע. כיסוי הידרופילי מחליק לשני מלבנים, מעט גדולים יותר מ -3.95 מילימטרים על 5.99 מילימטרים.

לאחר מכן החלק כל אחד מכיסוי המלבן החתוך לתוך החריצים, חתוך לתבנית הסיליקון, הפוך את התבנית והחל שומן ואקום לאורך תחתית תבנית הסיליקון באמצעות פיפטה חד פעמית. לאחר מכן, הפוך את התבנית בחזרה בצד ימין כלפי מעלה ולחץ את תחתית התבנית על החלקת כיסוי הזכוכית ההידרופילית העגולה. ליצירת איטום, הכינו תערובת של מדיה וחומר משיכה כימו-כימולוגי בשפופרת של 15 מיליליטר בריכוז הרצוי, פיפטה חמישה מיליליטר מהתערובת לתוך שפופרת מיליליטר חדשה וחמישה מיליליטר של מדיה רגילה לתוך צינור שני.

העבירו את שני הצינורות לאמבט מים שחומם ל-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן פיפטה 30 מיקרוליטר של 10 XPBS לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה. הוסף שישה מיקרוליטרים של תמיסת נתרן הידרוקסיד רגילה אחת לאותו צינור מיקרו צנטריפוגה ומערבולת למשך 15 שניות.

לאחר מכן הוסיפו 18 מיקרוליטר של קרבוקסילט פלואורסצנטי צהוב ירוק, מיקרוספירות שעברו שינוי לצינור מיקרו צנטריפוגה ו-168.3 מיקרוליטר קר כקרח. קולגן זנב עכברוש מסוג אחד. מערבלים את התערובת למשך 30 שניות.

לאחר מכן, הוסף 77.7 מיקרוליטר מהתא הרצוי. הקלד פעמיים 10 עד ששת התאים למיליליטר במדיה לצינור המיקרו צנטריפוגה וערבב. בעזרת קצה פיפטה למשך 20 שניות, פיפטה 300 מיקרוליטר מתערובת תאי הקולגן לבאר המרכזית של מכלול התבנית המוכנה.

לאחר מכן מניחים את התבנית על צלחת פטרי חד פעמית ומעבירים אותה לחממה רגילה למשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני לאחר תקופת הדגירה, השתמש במלקחיים כדי להסיר את שתי החלקות הכיסוי ההידרופוביות על ידי הידוק על החלק העליון של כל החלקת כיסוי, ולאחר מכן משיכה כלפי מעלה והרחק מהתבנית. העבירו את המערכת כולה למיקרוסקופ ובחנו את התא כדי לוודא שדפנות תבנית הקולגן עדיין ישרות, מה שמאפשר שיפוע דיפוזיה שטוח יותר עם מערכת עדיין מתחת למיקרוסקופ. הוסף 100 מיקרוליטר של מדיה סלולרית לבאר הראשונה.

לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר של מדיה תאית עם ריכוז המשיכה הכימו-כימולוגי הרצוי לבאר בצד השני של המטריצה. עקוב אחר נדידת התאים בהתייחס למיקרוספירות המסומנות פלואורסצנטיות כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. סדרת התמונות המוצגת כאן מציגה את הדיפוזיה של רומין העובר דרך מיליגרם אחד למיליליטר ג'ל קולגן.

דוגמה זו מציגה את שיפוע הדיפוזיה המישורי האמיתי של המערכת, שניתן לצפות לו גם מכל מושכי כימותרפיה שהוכנסו למערכת. בדוגמה המוצגת כאן, עוצמת אות הרום נמדדה לאורך זמן במיקומים שזוהו על ידי הריבועים האדומים. הריכוז בכל אחד מהמיקומים הללו מוצג בגרף זה כקו נפרד, שכאשר נמדד במצב יציב, מייצר שיפוע ריכוז ליניארי המבוסס על המיקום בג'ל.

קשר זה נשאר ליניארי לאורך מגוון ריכוזי מטריצת קולגן, מה שהופך את המערכת הזו לשימושית מאוד לניסויים בתאים. בתמונה זו, נויטרופיל בצבע אדום מוצג בתוך מטריצת קולגן המפוזרת במיקרוספירות ירוקות פלואורסצנטיות המשמשות כהפניות למיקום. שלוש התמונות הבאות מציגות את הנדידה המכוונת של הנויטרופיל כשהוא נע במעלה שיפוע מושך כימותרפיה, המתואר על ידי החץ הלבן.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד ליצור תא דיפוזיה פשוט כדי לחקור נדידת תאים במטריצת קולגן תלת-ממדית.