שלב תרשים אפיון באמצעות חרוזים מגנטיים כדיסקים נוזליים

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לנתח את נפח השארית (carryover volume) בין מקטעי נוזל סמוכים בתוך מכשיר מעבדה המבוסס על צינורות, באמצעות חרוזים מגנטיים. זאת מושג על ידי יצירת המכשיר באמצעות צינורות הידרופוביים, המטוענים באמצעות משאבת מזרקים כך שיכילו מספר מקטעי נוזל המופרדים על ידי שסתום אוויר, כאשר אחד הנוזלים כולל הן חרוזים מגנטיים והן צבע פלואורסצנטי. כשלב שני, נמדד העוצמה הפלואורסצנטית של מקטעי הנוזל הסמוכים באמצעות מיקרוסקופ, לאחר ביצוע כל העברה של החרוזים המגנטיים בעזרת מגנט חיצוני.

ניתוח מספרי הבא מבוצע על מדידות עוצמת הפלואורסצנציה הללו כדי לחשב את נפח ההעברה של החרוזים המגנטיים. התוצאות מראות כי ניתוח שינוי הפאזה במערכת רב-רכיבית המורכבת משני נוזלים הוא בר-ביצוע, בהתבסס על היכולת להשתמש בחרוזים מגנטיים כשיטה להעברת נפחי נוזל בגודל מיקרוליטר בין מאגרים סמוכים. כפי שאני מקווה שתראו היום, אנו עובדים עם הטכניקה המרגשת והפשוטה הזו, הכוללת שימוש בחרוזים מגנטיים להעברת נוזלים בתוך מבחנה פשוטה, בניגוד למעגלי מיקרופלואידיקה קונבנציונליים ומורכבים יותר.

בתחילה יישמנו זאת לחקירת ממשקי פנים בין נוזלים שאינם ניטבעים, וכעת אנו מרחיבים זאת ליישומים אחרים, כולל ניתוח אבחנתי של דם מלא, הפרדת חלבונים מתאי דם אדומים, ניתוח שתן, בדיקות אימונולוגיות וכדומה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות אחרות, כגון שימוש בערוצים מיקרופלוידיים, הוא פשטותה ועלות הייצור הנמוכה שלה. היא מציעה גמישות גבוהה למשתמש בין סוגי ניסויים שונים ומניבה תוצאות עקביות.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות עבור יישומים הדורשים תנועה של נפחים זעירים בשיאו, ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות כגון הפרדת דם, ת targeting של תרופות וחומרי ניגוד. להכנת הצינור, ראשית חתכו את הצינורית למקטעים של 15 סנטימטר, תלו את מקטעי הצינור באופן אנכי באמצעות סרט דביק, והניחו נייר סופג מתחת לצינורות כדי לאסוף את עודפי תמיסת הפלואורו-פולימר. הזריקו 100 µL של תמיסת הפלואורו-פולימר לפתח העליון של כל מקטע צינור באמצעות פיפטה, באופן שיבטיח מגע עם כל היקף הדופן הפנימית.

השאירו את מקטעי הפיתול לתלות במקומם למשך שעה אחת כדי להסיר כמות עודפת של תמיסת הפלואורו-פולימר. לאחר מכן, הכניסו את מקטעי הפיתול לתנור בטמפרטורה של 100 degrees Celsius למשך שעה אחת כדי להקשות את שכבת ציפוי הפלואורו-פולימר. בשלב הבא, הכינו את תמיסת החרוזי המגנטיים המדוללת על ידי הנחת מבחנה לדגימה בנפח 20 milliliter על מאזני מיקרו ואיפוס המאזניים.

ערבבו את המיכל של תמיסת כדוריות המגנט ולאחר מכן שאיבו 0.6 מיליליטר באמצעות מיקרופיפטה. העבירו את התמיסה שנשאבה אל מבחירת הדגימה שעל המאזניים, והוסיפו 0.4 מיליליטר של מים מזוקקים למבחית הדגימה. כמו כן, הכינו את הצבע הפלואורסצנטי על ידי המסה של 0.02 אחוזי משקל של הצבע במים דה-יוניים וערבוב התמיסה במכשיר וורטקס למשך דקה אחת.

להכנת התקן הצינור, הכניסו מחבר female lure lock לקצה אחד של הצינור. הכניסו את הצינור למזרק lure lock בעל נפח של שלושה מיליליטרים וסימוני מדידה של 0.1 מיליליטר. הכניסו את המזרק למשאבת מזרקים והגדירו את קצב ההזנה לשני מיליליטרים לשעה.

ערבבו במכשיר Vortex את המכל עם תמיסת חרוזי המגנט לפני הזרקת 20 µL לתוך המבחנה באמצעות שאיבה במשאבת מזרק. לאחר סיום הזרקת הנוזל לתא הבדיקה, שאבו שש µL של אוויר לתוך המבחנה. נפח אוויר זה ישמש מאוחר יותר כשסתום בין שני מקטעי הנוזל.

עם השלמת הכנסת מרווח האוויר, התחל בשאיבה של 180 µl של נוזל עם צבע פלואורסצנטי. הנח מחבר female lure lock שני על הקצה השני של הפרוך והסר את התקן הפרוך מהמזרק. לאחר מכן, הנח פקקי lure lock על שני קצוות התקן.

בצעו את מדידת עוצמת הפלואורסצנציה הראשונית של תא הבדיקה והמאגר באמצעות המיקרוסקופ ההפוך. הניחו את המכשיר מעל למגנט הקובייה כך שכל החרוזיים המגנטיים יתרכזו באזור אחד בתא הבדיקה. העבירו את החרוזיים למאגר על ידי הזזת המכשיר מעל למגנט.

לאחר שהצביר של החרוזים המגנטיים הועבר דרך מרווח האוויר אל תוך המאגר, יש לערבב את החרוזים המגנטיים על ידי הנחת המכשיר מעל המגנט וסיבובו כדי לשחרר את הנוזל הנלכד בתוך הצביר, עד להשלמת הומוגניזציה של המאגר. לאחר מכן, יש להניח את המכשיר מעל המגנט כך שכל החרוזים המגנטיים במאגר יתרכזו באזור אחד. העבירו את צביר החרוזים המגנטיים בחזרה לתא הבדיקה.

ברגע שהצביר מגיע לתא הבדיקה, ערבבו את החרוזיים המגנטיים על ידי הנחת המכשיר מעל המגנט וסיבובו. שחררו את הנוזל הפלואורסצנטי הכלוא בתוכו עד להשלמת ההומוגניזציה של תא הבדיקה. בצעו מדידות של עוצמת הפלואורסצנציה הן בתא הבדיקה והן במאגר באמצעות המיקרוסקופ ההפוך.

חזור על שלבים אלו עד ששני מקטעי הנוזל יתכנסו לעוצמות פלואורסצנציה דומות. כדי להכין את התקן הצינור, הכנס מחבר female lure lock לקצה אחד של הצינור והנח את הצינור לתוך מזרק lure lock. לאחר מכן, הנח את המזרק בתוך משאבת מזרקים והגדר את קצב ההזנה לשני מיליליטר לשעה.

החדירו 20 µL של תמיסה מעורבבת של חרוזי מגנט במים ביחס של אחד-לאחד עם C 12 E five אל השפופרת באמצעות שאיבה עם משאבת מזרק. לאחר סיום החדרת הנוזל לתא הבדיקה, שאבו 6 µL של אוויר אל השפופרת לצורך החדרת מרווח אוויר. התחילו בשאיבה של 180 µL של חומר פעיל שטח C 12 E five טהור לצורך כיול האופטיקה.

ראשית, הזז את משאבת המזרקים עם התקן הצינוריות כך שתא הבדיקה עם החרוזיים המגנטיים יהיה במיקוד. השתמש במקרטט סטריאוסקופי עם מקטביים מצולבים. כדי להגביר את הניגודיות בין השלב המוצק השקוע לשלב הנוזלי, הנח דף של סרט מקטב מעל מקור אור LED. החלק את מקור אור ה-LED מתחת לצינור המחובר למשאבת המזרקים.

חברו סרט מקטב נוסף לעדשה של מיקרוסקופ הסטריאו באמצעות סרט דביק, וודאו ששני סרטי המקטבים נמצאים בהיסטה של 90 מעלות זה מזה. הניחו את המגנט הקובייתי לצד תא הבדיקה כאשר המגנט מותקן על מעמד. מרגע שהחרוזים המגנטיים יוצרים צבר, התחילו להזרים נוזלים לתוך הצינור בקצב הזנה של 2 mL לשעה, כך שצבר החרוזים המגנטיים יעבור מתא הבדיקה, דרך מרווח האוויר, אל תוך תא מאגר הסורפקטנט.

כאשר צבר החרוזים המגנטיים מגיע לאמצע תא המאגר, הפסיקו את השאיבה במזרק המשאבה. הרחיקו את המגנט הקובייתי מהמבחנה כדי שהחרוזים המגנטיים יפרידו זה מזה ובכך תצמצמו את זמן הדיפוזיה של הנוזל הכלוא בצבר החרוזים המגנטיים. לאחר השלמת הדיפוזיה ושינוי הפאזה של הנוזל, החזירו את המגנט למיקומו הקודם לצד המאגר, כך שהחרוזים המגנטיים יחזרו להיווות צבר.

באמצעות משאבת המזרק, שאב את הנוזלים כך שצבר החרו지를 המגנטיים יועבר ממאגר החומר הפעיל שטחית, דרך מרווח האוויר ובחזרה אל תא הבדיקה. לאחר שצבר החרו지를 המגנטיים יגיע למרכז תא הבדיקה, עציר את משאבת המזרק והרחק את מגנט הקובייה מהשפופרת. עם השלמת הדיפוזיה ושינוי הפאזה של הנוזל, החזר את המגנט למקומו הקודם לצד המאגר, כך שהחרו지를 המגנטיים יתגבשו שוב לצבר.

חזור על שלבים אלו עד שתא הבדיקה יציג שינוי פאזה. כאן מוצגת תמונה של חרוזי המגנט במים, והחומר הפעיל שטחית הבלתי-יוני C 12 E five בתוך הפיתול ההידרופובי. במהלך תהליך העברת חרוזי המגנט הראשוני, החרוזים מוחזקים במקומם באמצעות מגנט קוביה חיצוני.

בעוד שהנוזלים נשאבים שמאלה כאן, החרוזים יוצאים מתא הבדיקה ונכנסים ל-C 12 E five. ברגע שהחרוזים המגנטיים נכנסים, פולימר הפעיל שטח מתחיל להתפשט מהמבנה של החרוז המגנטי. לאחר שהחרוזים המגנטיים שהו בתא הפעיל שטח למשך חמש שניות, נראה רק שינוי פאזה קטן בנקודת הזמן של עשר שניות.

חריזי המגנט עטופים לחלוטין בחומר הפעיל שטחית. שינוי הפאזה נמשך דרך הסימון ה-92 בדקה הרביעית. שינוי הפאזה גובר בדקה התשעית.

שינוי הפאזה האופקי מתחיל להצטמצם בעוד המבנה גדל אנכית. בעוד שב-17 דקות שינוי הפאזה התכווץ באופן דרסטי, ב-25 דקות נותר רק חלק קטן משינוי הפאזה המוצג. זהו המצב הראשוני של תא בדיקה water C 12 V five עם חרוזי מגנט במכשיר לפני העברת החומר הפעיל שטחית.

לאחר שישה מחזורי העברה, התרחש שינוי פאזה. לעומת זאת, כאשר לא היו חרו지를 מגנט במכשיר, לא נצפה שינוי פאזה, מה שמוכיח כי התוצאות שנצפו נבעו מהעברה של חרוזים מגנטיים ולא מהנוזל. הידבקות לדפנות הפנימיות של הפיתול במהלך ניסיון ביצוע פרוצדורה זו.

חשוב להקדיש מספיק זמן כדי לאפשר לתהליך הדיפוזיה להתרחש בעת העברת נוזלים בין מאגרים סמוכים בעקבות הליך זה. ניתן לשלב במערכת אפשרויות אחרות, כגון שימוש באלקטרומגנט, על מנת לענות על שאלות נוספות כמו כיצד להאיץ את תהליך ההפרדה וכיצד למזער את המניפולציה הידנית. כדי לשים זאת בהקשר רחב יותר, טכניקה פשוטה זו, הכוללת ביסודה צינור פלסטיק, חרוזי מגנט ומגנט חיצוני, יושמה להפרדה של נוזלים שונים ולבחינת מרחב תרשים הפאזה שלהם.

עם זאת, הרב-גוניות והפשטות של הטכניקה ישתלמו ביישומים רבים אחרים, בעיקר בתחום של ניתוח אבחנתי של נוזלים שונים. באמצעות שימוש בחרוזי מגנט להעברת נפחים קטנים, באופן ישיר או דרך פונקציונליזציה של החרוזים המגנטיים, ניתן לנתח את רכיבי דגימת הנוזל. לדבר זה יש יישומים בכל התחומים.

לדוגמה, הפרדה וניתוח של חלבון מתאי דם אדומים בדם מלא, באופן דומה בשתן, ובנוזלים רבים אחרים שניתן לנתח באופן זה באמצעות טכניקה פשוטה, ללא המורכבות והעלות הכרוכות בייצור המקובל של התקני מיקרופלואידיקה.