Name: כימות של Cytosolic לעומת vacuolar סלמונלה ביסודי המקרופאגים על ידי דיפרנציאל permeabilization (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: חקור כימות של חיידקי Salmonella typhimurium ציטוזוליים לעומת ואקואולריים במקרופאגים שמקורם ממח עצם באמצעות חדירות דיפרנציאלית עם דיגיטונין. שיטה זו מאפשרת הבחנה מדויקת במיקום התוך-תאי של הפתוגן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות מתיאס ס דיק, רולנד פ Dreier וסבסטיאן רול לדיון. עבודה זו נתמכה על ידי קתדרת PP00P3_139120 SNSF / 1 וID2153162 פרויקט מענק אוניברסיטת באזל לPB

<ol><li>Kumar, Y., Valdivia, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leading+a+sheltered+life%3A+intracellular+pathogens+and+maintenance+of+vacuolar+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Leading a sheltered life: intracellular pathogens and maintenance of vacuolar compartments.</a> Cell Host Microbe. 5, 593-601 (2009).</li>
<li>Chong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+phagosomal+stage+of+Francisella+tularensis+determines+optimal+phagosomal+escape+and+Francisella+pathogenicity+island+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The early phagosomal stage of Francisella tularensis determines optimal phagosomal escape and Francisella pathogenicity island protein expression.</a> Infect Immun. 76, 5488-5499 (2008).</li>
<li>Mellouk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+subverts+the+host+recycling+compartment+to+rupture+its+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Shigella subverts the host recycling compartment to rupture its vacuole.</a> Cell Host Microbe. 16, 517-530 (2014).</li>
<li>Checroun, C., Wehrly, T. D., Fischer, E. R., Hayes, S. F., Celli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy-mediated+reentry+of+Francisella+tularensis+into+the+endocytic+compartment+after+cytoplasmic+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autophagy-mediated reentry of Francisella tularensis into the endocytic compartment after cytoplasmic replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 14578-14583 (2006).</li>
<li>Broz, P., Monack, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+described+pattern+recognition+receptors+team+up+against+intracellular+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Newly described pattern recognition receptors team up against intracellular pathogens.</a> Nat Rev Immunol. 13, 551-565 (2013).</li>
<li>Hagar, J. A., Powell, D. A., Aachoui, Y., Ernst, R. K., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+LPS+activates+caspase-11%3A+implications+in+TLR4-independent+endotoxic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic LPS activates caspase-11: implications in TLR4-independent endotoxic shock.</a> Science. 341, 1250-1253 (2013).</li>
<li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escape+of+intracellular+Shigella+from+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Escape of intracellular Shigella from autophagy.</a> Science. 307, 727-731 (2005).</li>
<li>Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonellae+interplay+with+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Salmonellae interplay with host cells.</a> Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).</li>
<li>Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+controls+Salmonella+infection+in+response+to+damage+to+the+Salmonella-containing+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole.</a> J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).</li>
<li>Malik-Kale, P., Winfree, S., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bimodal+lifestyle+of+intracellular+Salmonella+in+epithelial+cells%3A+replication+in+the+cytosol+obscures+defects+in+vacuolar+replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The bimodal lifestyle of intracellular Salmonella in epithelial cells: replication in the cytosol obscures defects in vacuolar replication.</a> PLoS One. 7, e38732(2012).</li>
<li>Zhao, Y. O., Khaminets, A., Hunn, J. P., Howard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+Toxoplasma+gondii+parasitophorous+vacuole+by+IFNgamma-inducible+immunity-related+GTPases+%28IRG+proteins%29+triggers+necrotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Disruption of the Toxoplasma gondii parasitophorous vacuole by IFNgamma-inducible immunity-related GTPases (IRG proteins) triggers necrotic cell death.</a> PLoS Pathog. 5, e1000288(2009).</li>
<li>Meunier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-11+activation+requires+lysis+of+pathogen-containing+vacuoles+by+IFN-induced+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Caspase-11 activation requires lysis of pathogen-containing vacuoles by IFN-induced GTPases.</a> Nature. 509, 366-370 (2014).</li>
<li>Yamamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cluster+of+interferon-gamma-inducible+p65+GTPases+plays+a+critical+role+in+host+defense+against+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A cluster of interferon-gamma-inducible p65 GTPases plays a critical role in host defense against Toxoplasma gondii.</a> Immunity. 37, 302-313 (2012).</li>
<li>Degrandi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+guanylate+binding+protein+2+%28mGBP2%29+controls+Toxoplasma+gondii+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Murine guanylate binding protein 2 (mGBP2) controls Toxoplasma gondii replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 294-299 (2013).</li>
<li>Mariathasan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+activation+of+the+inflammasome+by+caspase-1+adaptors+ASC+and+Ipaf%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Differential activation of the inflammasome by caspase-1 adaptors ASC and Ipaf.</a> Nature. 430, 213-218 (2004).</li>
<li>Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+cytosolic+Salmonella+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells.</a> PLoS One. 9, e84681(2014).</li>
<li>Ng, H., Smith, D. J., Nagley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+flow+cytometry+to+determine+differential+redistribution+of+cytochrome+c+and+Smac%2FDIABLO+from+mitochondria+during+cell+death+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Application of flow cytometry to determine differential redistribution of cytochrome c and Smac/DIABLO from mitochondria during cell death signaling.</a> PLoS One. 7, e42298(2012).</li>
<li>Krawczyk, E., Suprynowicz, F. A., Sudarshan, S. R., Schlegel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+orientation+of+the+human+papillomavirus+type+16+E5+oncoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Membrane orientation of the human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein.</a> J Virol. 84, 1696-1703 (2010).</li>
<li>Keller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+measurements+of+vacuolar+rupture+caused+by+intracellular+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens.</a> J Vis Exp. , e50116(2013).</li>
</ol>

אין לנו מה לחשוף.

permeabilization ההפרש הוא שיטה קלה וחזקה כדי לנתח ולכמת את הפצת subcellular של חיידקים פתוגנים בין תאי vacuolar וcytosol. אותו assay שמש בהצלחה עם חיידקים כגון Francisella novicida 2,4 וShigella flexneri 12. עם זאת, מאחר שרבי הפתוגן תאיים לשנות או לשנות את מבני endomembrane מארח, על חוסנו של permeabilization digitonin יצטרך להיקבע על בסיס פרטני. כוונון עדין של assay בביחס לקו הפתוגן או תא משמש ייתכן שיהיה צורך. Assay אינו מוגבל רק לביולוגיה...

חיידקים פתוגנים תאיים לשכפל באופן ישיר בcytosol התא המארח, או בתאי vacuolar מיוחדים 1. בשלב הראשוני של הזיהום ביותר פתוגנים לקבל הפנימו או על ידי phagocytosis על ידי תאים מיוחדים (כגון מקרופאגים) או על ידי פעיל בקידום הספיגה שלהם לתאים שאינם phagocytic. בתאי phagocytic, phagosome בדרך כלל משלב עם lysosomes כדי ליצור תא נגרע, שבו חלקיקי phagocytosed מתעכלים. חיידקי cytosolic מיוחדים, כגון Francisella novicida או Shigella flexneri, לברוח השפלה phagosomal ידי גרימת הקרע של phagosome ולאחר מכן לברוח ל2,3 cytosol. זה דורש מנגנון הקשורים ארסי כגון פתוגניות אי Francisella (FPI) או Shigella flexneri T3SS, שמזריק חלבוני מפעיל המקדמים קרע vacuolar 2-4. תכונות cytosol התא המארחמספר הקולטנים זיהוי תבניות נשמרים, כי בדרך כלל לזהות את הנוכחות של פתוגנים ולגרום לחיסון מולדים איתות 5. בנוסף, xenophagy, צורה אנטי-מיקרוביאלי של autophagy יכולה לבזות חיידקים שנכנסים cytosol. חיידקי cytosolic בדרך כלל גם מותאמים ללהקהות או לעקוף תגובות אלה באמצעות אסטרטגיות שונות. לדוגמא, Francisella משנה LPS כדי להימנע מהכרת המארח וShigella מונע גיוס autophagy באמצעות חלבונים מופרשים מפעיל 6,7. אסטרטגיה נוספת לברוח השפלה lysosomal מועסקת על ידי Typhimurium serovar enterica הפתוגן vacuolar המודל סלמונלה, התייחס לאחר מכן כלtyphimurium סלמונלה. סלמונלה משתמשת T3SS להזריק effectors שלשפץ phagosome הראשוני לנישה תאית שלה, סלמונלה המכיל vacuole (SCV) 8,9. מניפולציה מתמשכת של מסלולי מארח היאנחוץ כדי לשמור על vacuole זאת על ידי גיוס שומנים וחומרים מזינים אחרים לvacuole. ואכן, מוטציה SIFA של סלמונלה לא מצליחה לשמור על יציבות vacuolar, ונכנסה cytosol של תאי מארח בתוך שעות לאחר הדבקה, וכתוצאה מכך ההפעלה של מסלולי חיסון מולדים וגיוס autophagy 8. בריחת vacuolar של סלמונלה משתנה בהתאם לסוג התא שהוא לימודים, וכמה מחקרים הראו כי בתאי אפיתל אפילו WT סלמונלה יכולה לברוח SCV וhyperreplicate בcytosol 10. הדיווחים אחרונים מראים כי זיהוי חיסון מולדים של פתוגנים vacuolar גם תלוי ביכולת של המארח להכיר ולערער vacuoles המכיל הפתוגן (PCVs) 11-14. בהתחשב בכך ששניהם המארח או חיידקי גנוטיפ יכול להשפיע על ההפצה של חיידקים תאיים בין vacuolar ותא cytosolic, יש צורך לכמת את מספר לעומת vacuolarחיידקי cytosolic. מאז, בהגדרות ניסיוניות רוב תאי מארח נגועים בחיידק אחד או יותר, ולאחר מכן יכולים נמל כמה חיידקים בתאי subcellular שונים, יש צורך בטכניקה המאפשרת כימות ברמה של חיידקים בודדים. permeabilization ההפרש (הידוע גם בassay הגנת phagosomal) מספק רזולוציה זו 2,4,10,12. Assay מבוסס על permeabilization סלקטיבית של קרום הפלזמה התא המארח עם digitonin חומר הניקוי, מה שמשאיר את קרומי vacuolar שלמים ובכך מאפשר צביעה סלקטיבית של חיידקי cytosolic עם נוגדנים. כאן אנו מספקים שני פרוטוקולים לכימות של cytosolic וvacuolar typhimurium סלמונלה באמצעות permeabilization ההפרש. העיקרון של שיטה זו מתואר באיור 1: מקרופאגים מח העצם נגזרים (BMDMs) נגועים בשלב נייח mCherry להביע סלמונלה. השלב נייח סלמונלה צריכה to לשמש כי הם downregulate הביטוי של T3SS SPI-1, שפעילותם אמורה היה להיות מוכרת על ידי inflammasome NLRC4 ולגרום למוות מהיר של תאים (pyroptosis) של 15 BMDMs. בעקבות זיהום תאים נשטפים וטופלו עם 50 / מיליליטר מיקרוגרם של digitonin דקה 1. תאים נשטפים שוב מייד וטופחו עם נוגדנים נגד סלמונלה מצמידים את FITC לסמן חיידקים עם גישה לcytosol. לאחר שטיפה נוספת תאי צעד הם lysed ואחוז mCherry + (vacuolar) וFITC + / mCherry + (cytosolic) החיידקים נקבע על ידי FACS. כמו כן, אנו מדווחים על הסתגלות של שיטה זו, שניתן להשתמש אם אין זנים להביע חלבון פלואורסצנטי זמינים (איור 2). צעדים נוספים שהוכנסו לאחר תיוג FITC שבו תאים הם קבועים וpermeabilized לחלוטין. לאחר מכן כל חיידקי מגואלות נוגדנים נגד סלמונלה ונוגדנים משני המתאימים. Detשיקוף מכן על ידי מיקרוסקופ במקום ניתוח FACS.

<table><tbody><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D5628</td><td>50 &mu; גר'/מ"ל</td></tr><tr><td>PFA</td><td>219998380</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן אצטט</td><td>סיגמא</td><td>791733</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>נגד סלמונלה CSA-1-FITC</td><td>KPL</td><td>01-91-99-MG</td><td>1/500</td></tr><tr><td>אנטי סלמונלה CSA-1</td><td>KPL</td><td>02-91-99-MG</td><td>1/500</td></tr><tr><td>אנטי קלנקסין</td><td>Enzo Lifesciences</td><td>SPA-860D</td><td>1/100</td></tr><tr><td>אנטי PDI</td><td>Enzo Lifesciences</td><td>SPA-890</td><td>1/100</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield הרכבה בינונית</td><td>Vectorlabs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד ארנב-488</td><td>מולקולרי בדיקות</td><td>A-11070</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Life Technologies</td><td>15710-49</td><td>100 &mu; גרם/מ"ל ו-10 &mu; גר'/מ"ל</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5141</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-019</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td></td><td>NEAA Amimed</td><td>5-13K00-H</td><td></td></tr><tr><td>LSM700 מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Zeiss</td><td></td><td>הדמיה שנעשתה ב-63X</td></tr><tr><td>FACS Fortessa</td><td>BD טכנולוגיות</td><td></td><td>זיהוי mCherry 610 ננומטר</td></tr><tr>זיהוי <td>טכנולוגיות</td><td></td> <td>FACS Fortessa</td> BD <td>FITC 530 ננומטר</td></tr></tbody></table>

כימות של cytosolic לעומת vacuolar<em&gt; סלמונלה</em&gt; ביסודי המקרופאגים על ידי דיפרנציאל permeabilization

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

חיידקים פתוגנים תאיים יכול לשכפל בcytosol או בvacuoles מיוחד המכיל הפתוגן (PCVs). כדי להגיע cytosol, חיידקים כמו Shigella flexneri וFrancisella novicida צריכים לגרום לקרע של phagosome. לעומת זאת, typhimurium סלמונלה משכפל בתא vacuolar, הידוע בשם vacuole סלמונלה המכיל (SCV). מוטציות עם זאת מסוימות של סלמונלה להיכשל כדי לשמור על שלמות SCV ומשתחררים כך לתוך cytosol. אחוז cytosolic לעומת חיידקי vacuolar על הרמה של חיידקים בודדים ניתן למדוד על ידי permeabilization ההפרש, הידוע גם בassay phagosome-ההגנה. הגישה עושה שימוש ברכוש של digitonin חומר הניקוי כדי לאגד כולסטרול באופן סלקטיבי. מאז קרום הפלזמה מכיל יותר כולסטרול מאשר קרומים תאיים אחרים, digitonin יכול לשמש כדי permeabilize סלקטיבי קרום הפלזמה תוך השארת קרומים תאייםבשלמותה. בזיהום קצר, הבא עם הפתוגן לבטא חלבון סמן פלואורסצנטי (למשל mCherry בין השאר), קרום הפלזמה של תאי מארח permeabilized עם דגירה קצרה בdigitonin מכילה מאגר. לאחר מכן תאים נשטפים וטופחו עם נוגדן ראשוני (מצמידים את fluorophore בחירה) המכוון נגד החיידק של בחירה (למשל אנטי סלמונלה -FITC) ושטפו שוב. אם חיידקים לא מסומנים משמשים, ניתן לעשות צעד נוסף, שבו כולם קרומי permeabilized וכל החיידקים מוכתמים עם נוגדן מקביל. בעקבות הצביעה, אחוז חיידקי vacuolar וcytosolic ניתן לכמת על ידי FACS או במיקרוסקופ על ידי ספירת אירועים חד או דו-חיוביים. כאן אנו מספקים פרטים ניסיוניים לשימוש בטכניקה זו עם typhimurium סלמונלה החיידק. היתרון של assay זה הוא כי, בניגוד לassay האחר, היא מספקת כימות ברמה של bacte אחתריה, ואם נותח על ידי מיקרוסקופ מספק את המספר המדויק של cytosolic וחיידקים vacuolar בתא נתון.

איור 1 ואיור 2 מציגים את השרטוטים של assay digitonin המתוארים בפרוטוקול 1 ופרוטוקול 2 ממחישים את השלבים הקריטיים בפרוטוקול ותוצאות שהתקבלו. איור 3 מראה תוצאות FACS טיפוסיות. בקרות חיוביות ושליליות משמשות כדי להגדיר את השערים לחיידקים mCherry + / FITC- (vacuolar סלמונלה) וmCherry + / FITC + חיידקים (cytosolic סלמונלה). בהתבסס על השערים האלה אחוז חיידקי cytosolic וvacuolar ניתן לקבוע בדגימות הניסוי. בדוגמא זו יש לנו בהשוואה wild-type וΔsifA סלמונלה...

אנו מתארים את הכימות של סלמונלה טיפימוריום ציטוזולי ווואקולרי במקרופאגים שמקורם במח עצם באמצעות חדירות דיפרנציאלית של דיגיטונין.

כימות של Cytosolic לעומת vacuolar<em&gt; סלמונלה</em&gt; ביסודי המקרופאגים על ידי דיפרנציאל permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לקבוע את אחוז ה-Salmonella Typhi בציטוזול ובוואקולות בתוך מקפגים נגזרים ממח עצם מזוהמים. מטרה זו מושגת על ידי זיהום של מקפגים עם Salmonella Typhi המבטאת M-cherry. כשלב שני, התאים מטופלים בדטרגנט Toniconin, המגביר את חדירות ממברנת הפלזמה, אך לא את ממברנות הוואקולות.לאחר מכן צובעים את התאים באמצעות נוגדן אנטי-סלמונלה המשויך לפלואורופור Zi. כדי לסמן סלמונלה ציטזוליים, התוצאות מראות את אחוז החיידקים הציטזוליים מתוך סך החיידקים, בהתבסס על מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS). שיטות אלו יכולות לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום האינטראקציה עם פתוגנים, כגון האם פתוגן תוך-תאי משתכפל בתוך ואקואולה (VA) או בציטוזול. יש להוסיף את זן החיידקים יום לפני ההדבקה, בשלושה מיליליטר של מצע Luria Britani המועשר בסטרטפטומיצין ואמפיצילין, בשייקר בטמפרטורה של 37 °C למשך הלילה, כדי להתחשב בתנאים האישיים. יש להוסיף כיסויי זכוכית (cover slips) לבארות של פלטה בעלת 24 בארות שישמשו כביקרות לזריעת התאים להדבקה. יש לזרוע מקפגוים המופקים ממח עצם מסוג wild type (BMDMs) בצפיפות של 0.125 מיליון תאים לבערה במיליליטר אחד של מצע למקפגים ראשוניים, ולאחר מכן להדגיר את התאים למשך הלילה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide.ביום למחרת. קבעו את ריכוז הסלמונלה בתרבית של הלילה על ידי מדידת הצפיפות האופטית ב-600 ננומטרים או OD 600 של התרבית המדוללת מול תמיסת PBS (phosphate buffered saline). פעולה זו מבטיחה שה-OD 600 יימדד בטווח הליניארי של הספקטרופוטומטר.חשב את ריכוז הסלמונלה למיליליטר; OD 600 של 1 תואם למיליארד חיידקים. דלל את החיידקים במצע למקרופאגים כדי להגיע לריכוז סלמונלה של 1.25 מיליון תאים למיליליטר לצורך הדבקת התאים בסלמונלה. הסר את המצע מה-B MDMs.הוסיפו מיליליטר אחד של מצע למקרופגים לבארות הביקורת שאינן מזוהמות, B1 עד B3 ו-C1 עד C3. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסות סלמונלה לבארות A1 עד A5 כדי להגיע לריבוי זיהום (MOI) של 10 חיידקים לתא. סובבו את הפלטה בצנטריפוגה למשך 15 דקות ב-300 $\times$g ובטמפרטורה של 37 °C כדי לסנכרן את הזיהום, לפני העברת הפלטה לדגירה ב-37 °C ו-5% $CO_2$ למשך שעה אחת לאחר הזיהום. הוציאו את הפלטה מהמדגרה והוסיפו 0.1 מיליליטר של מצע למקרופגים המכיל Gentamycin כדי להרוג חיידקים חוץ-תאיים.הוסיפו gentamycin לכל הבארות, כולל הביקורות שאינן מזוהמות, כדי להבטיח שכל התאים יעובדו באופן זהה. לאחר מכן, העבירו את הפלטה לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide כשעתיים לאחר ההדבקה. הוציאו את הפלטה מהאינקובטור ושטפו את כל הבארות פעמיים עם 1 mL של docos, modified eagles medium או DMEM שחוממו מראש.החליפו את ה-DMEM במצע למקרופאגים שחומם מראש ומכיל gentamicin כדי למנוע צמיחה של חיידקים חוץ-תאיים שנותרו, לפני העברת הפלטה חזרה לאנקובטור סמוך לנקודת הזמן הרצויה לניתוח. הכינו תמיסות טריות של KHM buffer, KHM buffer עם digitonin ו-KHM buffer עם saponin. בנוסף לתמיסות הנוגדנים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט לביצוע חדירה לתאים (cell permeation), הוציאו את הפלטה מהאינקובטור ושטפו את הבארים שלוש פעמים עם 0.5 milliliters של KHM buffer שחומם מראש.לאחר מכן, הסירו את תמיסת ה-KHM והוסיפו 0.25 milliliters של תמיסת KHM פשוטה לבארים A4, B1 ו-C1; תמיסת KHM עם digitonin לבארים A1 עד A3, B2 ו-C2; ותמיסת KHM עם saponin לבארים A5, B3 ו-C3. הדגרירו למשך דקה אחת בדיוק בטמפרטורת החדר, לפני שטיפה מיידית של כל הבארים שלוש פעמים עם 0.5 milliliters של תמיסת KHM שחוממה מראש. לבסוף, הסירו את תמיסת ה-KHM והוסיפו את תמיסות הנוגדן הראשוני לבארים המתאימות, לפני הדגרת הפלטה למשך 15 דקות ב-37 degrees Celsius ו-5% carbon dioxide. לאחר ההדגרה, שטפו את התאים פעם אחת עם 1 milliliter של PBS עבור התאים המודבקים בבארים A1 עד A5.הכינו את התאים לניתוח FACS על ידי שטיפתם שלוש פעמים ב-PBS. לאחר מכן, הוסיפו 0.5 מיליליטר של PBS קר מאוד המכיל 0.1% Triton. לאחר מכן, העבירו את תרחיף התאים לשפופרת FACS בנפח חמישה מיליליטר עם מכסה בעל מסנן תאים כדי לפרק צבירי תאים, תוך שמירה על הדגימות על קרח.נתחו את הדגימות במכשיר FACS באמצעות הביקרים החדירים לחלוטין. הגדירו את השער (gate) עבור סך החיידקים בהתבסס על פיזור קדימה (forward scatter), פיזור צידי (side scatter) ואות ה-mCherry. לאחר מכן, נתחו את אות ה-fitz באוכלוסיית החיידקים הכוללת, תוך שימוש בביקרים החדירים ובביקרים שאינם חדירים, כדי להגדיר את השערים עבור חיידקים ציטוזוליים וחיידקים ואקואולריים.נתחו את הדגימות וקבעו את אחוז החיידקים הציטוזוליים לעומת החיידקים הוואקואולריים באמצעות תוכנת FlowJo. בהתאם לפרוטוקול היצרן עבור בקרות החדירות (permeation controls) שאינן מזוהמות בבארים B1 עד B3 ובארים C1 עד C3, הכינו את הדגימות למיקרוסקופיה על ידי הסרת ה-PBS והוספה של 250 µL של 4% Paraformaldehyde ב-PBS; דגרו למשך 10 דקות ב-37 °C לאחר ההוספה. שטפו את הבארים פעמיים עם 1 mL של PBS והוסיפו 250 µL של 0.1 M glycine ב-PBS למשך 10 דקות כדי לנטרל את המקבע, ולאחר מכן שטפו את הבארים פעמיים עם 1 mL של PBS לביצוע צביעה בנוגדן שני.צבע את בקרות החדירות במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר באמצעות נוגדים שניים מתאימים המצומדים לצבעים פלואורסצנטיים ב-PBS. ה-PBS מועשר ב-0.1% saponin ו-3% BSA. כדי להבטיח חדירות מלאה של התאים, שטוף את כיסויי הזכוכית שלוש פעמים ב-1 mL של PBS והעבר אותם לניתוח באמצעות מדיום קיבוע עם DAPI.נתחו את לבישי הכיסוי עם הביקרות בהגדלה של 40x או 63x באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה קונפוקאלי. כאן מוצגות תוצאות טיפוסיות. ביקורות חיוביות ושליליות משמשות לקביעת השערים עבור חיידקים חיוביים ל-m cherry ו-FITC, שהם ציטוסוליים (סלמונלה), וחיוביים ל-m cherry ושליליים ל-FITC, שהם ואקולריים (סלמונלה).על בסיס שערים אלו, נקבע אחוז החיידקים הציטוזוליים והוואקואולריים בדגימות הניסוי. בדוגמה זו, מושווה Salmonella typhimurium wild type חיובי ל-m cherry למוטנט עם מחיקת CA במקרופאגים של מחולל גרמי (BMDM). מוצגות כאן צביעות של calnexin ו-PD-1 שהתקבלו בבקרי חדירות שטופלו ב-digitonin או בספונין; מכיוון ש-calnexin הוא חלבון ממברנת הרשת האנדופלזמית (ER), ניתן לראות את צביעת ה-calnexin ברחבי הציטוזול ומסביב לגרעין בתאי חדירות שטופלו הן ב-digitonin והן בספונין. בבקרי חדירות שטופלו ב-digitonin, לא נראית צביעה של PD-1.ניתן להבחין בצביעה בתאי sasin ו-perme. מוצגת כאן תוצאת צביעה anti salmonella בתאים שעברו perme עם tonin. חיידקים כוללים מופיעים באדום וחיידקים ציטוזוליים מופיעים בירוק.האוכלוסייה החיובית ל-E היא שעלמונלה עם גישה לציטוזול. לעומת זאת, האוכלוסייה השלילית ל-fite היא חיידקים השוהים בתוך ואקואולת שעלמונלה שלמה (SCV), ולכן הם מוגנים מפני סימון FSE של שעלמונלה. כאן, שעלמונלה מסוג בר (wild type) מושווית לזן מוטנטי עם מחיקה של CFE. מכיוון ש-CA הכרחית לשמירה על שלמות ה-SCV, אחוז גבוה יותר של שעלמונלה נמצא בציטוזול. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן לקבוע את אחוז החיידקים הוואקואולריים והציטוזוליים.

quantification-cytosolic-vs-vacuolar-salmonella-primary-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

במאמר זה, אנו מתארים את שיטת ניצול רב רפאים זרימת cytometry הדמיה לכמת את ההפנמה של חלקיקים polyanhydride או חיידקים של 264.7 תאים הגלם.

ניתוח הפנמה נייד של חלקיקים וחיידקים על ידי Cytometry Multi-Flow דימות ספקטרלי

סרטון זה מדגים בדיקה לכימות הצמיחה התוך-תאית של טפילים במקרופאגים שמקורם במח עצם (BMM). תאי המקרופאגים נגועים בשלבים הפולשניים התנועתיים והלא תנועתיים של לישמניה, פרומסטיגוטים מטאציקליים ואמסטיגוטים, בהתאמה. הטפילים פולשים למקרופאגים, מופנמים לחלל טפילי ומתרבים בפנים. צמיחת הטפיל התוך-תאי מכומתת באמצעות מיקרוסקופ על צביעה פלואורסצנטית של גרעיני המקרופאגים והטפילים.

בדיקה חוץ גופית לכימות הצמיחה התוך-תאית של טפיל במקרופאגים

סרטון זה מדגים בדיקה לכימות ציטוסולי וסלמונלה טיפימוריום בתוך מקרופאגים שמקורם במח עצם באמצעות חדירה דיפרנציאלית. המקרופאגים נגועים בסלמונלה המבטאת חלבון פלואורסצנטי, המופנמת בתוך מבנה כלי דם מיוחד הנקרא ואקואול המכיל סלמונלה או SCV. תת-קבוצה של חיידקים בורחת מה-SCV ונכנסת לציטוזול. קרום הפלזמה העשיר בכולסטרול של המקרופאגים חדור באמצעות דיגיטונין, ומשאיר את ה- SCV שלם. לאחר תיוג החיידקים הציטוסוליים עם נוגדן מתויג פלואורסצנטית, אחוז החיידקים vacuolar ו cytosolic מכומת באמצעות מיון תאים מופעל...

בדיקה לכימות סלמונלה ציטוסולית וסלקולארית במקרופאגים ראשוניים נגועים

אנו מתארים שיטה למעקב אחר קרע endomembrane שהושרו על ידי החיידקים תוך...

מידות תא יחיד של קרע vacuolar נגרמים על ידי פתוגנים תאיים

Assay תפוקה גבוהה לסלמונלה במבחנה פנוטיפ או עמותת חיידקים אחרת, פלישה, ושכפול בתאי phagocytic עם קיבולת תפוקה גבוהה פותח. השיטה הועסקה כדי להעריך זנים מוטנטים נוקאאוט גן סלמונלה למעורבותם באינטראקציות מאכסן לפתוגן.

Assay תפוקה גבוהה להפנוטיפ Enterica סלמונלה Typhimurium איגוד, פלישה, ושכפול בהמקרופאגים

מאמר זה מתאר שיטות לסינתזה ותיוג ניאון של חלקיקים (NPS). הצירופים ויושמו בניסויי דופק מרדף לתייג מערכת אנדו-lysosomal של תאים האיקריוטים. מניפולציה של מערכת אנדו-lysosomal על ידי פעילויות של enterica סלמונלה הפתוגן תאיים היו במעקב על ידי הדמיה תא החי ולכמת.

יישום של פלורסנט חלקיקים לחקר שיפוץ של מערכת Endo-lysosomal על ידי חיידקים תאיים

נתאר כאן שיטה פשוטה ומהירה בידודו של סלמונלה typhimurium-המכילה phagosomes של מקרופאגים על-ידי ציפוי החיידקים עם ביוטין ו streptavidin.

בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

כל המינים לישמניה פתוגניים שוכנים וישכפלו בתוך המקרופאגים של מארחיהם חוליות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדביק מאתר מקרופאגים הנגזרות מח עצם בתרבות עם לישמניה, ואחריו כימות מדויק של קינטיקה גידול תאיים. שיטה זו שימושית עבור לימוד בודדים הגורמים המשפיעים על אינטראקציה פתוגן-פונדקאי, לישמניה התקפה אלימה.

כימות של צמיחה תאיים בתוך המקרופאגים הוא מהיר, שיטה אמינה להערכת של התקפה אלימה של טפילים לישמניה

Efferocytosis, הסרת phagocytic בתאים אפופטוטיים להיפגע, הוא נדרש כדי לשמור על הומאוסטזיס, בהנחייתם של רצפטורים, איתות המסלולים המאפשרים זיהוי, היבלעות של הפנמה של מוות תאים. במסמך זה, אנו מציגים מיקרוסקופ פלורסצנטיות פרוטוקול עבור כימות של efferocytosis וכן את פעילותם של efferocytic איתות המסלולים.

כימות של Efferocytosis על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיקרוסקופ

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את העכבר מקרופאג הצפק phagocytosis שימוש משופרת פלורסצנטיות ירוק חלבון-הבעת Escherichia coli.

שימוש משופרת פלורסצנטיות ירוק חלבון-הבעת Escherichia Coli כדי להעריך את העכבר מקרופאג הצפק Phagocytosis

סלמונלה פולשת ומשתכפלת בתוך תאי אפיתל מעיים הן בוואקולות ספציפיות לסלמונלה והן בחינם בציטוזול (היפר-שכפול). פרוטוקול מבוסס מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בתפוקה גבוהה מתואר כאן כדי לכמת את הפנוטיפים התוך-תאיים של סלמונלה על ידי שני ניתוחי תמונה משלימים באמצעות ImageJ, המגיעים לרזולוציה של תא בודד וניקוד.

ניתוח אוטומטי של פנוטיפים תוך תאיים של סלמונלה באמצעות ImageJ

חקור כימות של חיידקי Salmonella typhimurium ציטוזוליים לעומת ואקואולריים במקרופאגים שמקורם ממח עצם באמצעות חדירות דיפרנציאלית עם דיגיטונין. שיטה זו מאפשרת הבחנה מדויקת במיקום התוך-תאי של הפתוגן.

כימות של Cytosolic לעומת vacuolar

גלה סרטונים נוספים