Name: שיטות החדרה וקיבוע שימושיות בחקר סרטן ריאות עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: למד שיטות להחדרת תאי סרטן וחומרים לריאות עכברים, קיבוע לאחר המוות ומדידת נפח ריאה. פרוטוקולים אלה משפרים את חקר סרטן הריאה ומחלות ריאה אחרות במודלים מכרסמים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הפרוטוקול הבא מתאר מערכת שעובדת היטב בעכברים גרם 20-35. השיטה יכולה בקלות להיות להתאמה לעכברים גדולים יותר או קטנים יותר פשוט על ידי שינוי גודל קטטר. כל פרוטוקולי בעלי החיים אושרו על ידי ועדת בעלי החיים באוניברסיטת ג&#39;ונס הופקינס הטיפול ושימוש. 1. ריאות החדרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר צינורית מסחרית אינץ &#39;אחד ארוכת 20 גרם תוך ורידי לשימוש עבור אינטובציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את קצה צנתר כיפוף ידני בו כדי ליצור עקמומיות קלה בקצה כפי שמודגם באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר בתערובת של קטמין (100 מ&quot;ג / קילוגרם) ו xylazine (15 מ&quot;ג / קילוגרם) שהוחדר IP, ולאשר הרדמה על ידי היעדר תנועת רפלקס. החל משחה וטרינרים בעיניים מייד לאחר הרדמה. מייד לאחר ההרדמה להחיל משחה וטרינרים בעיניים ולתת carprofen (5-10 מ&quot;ג / קילוגרם SQ) לשיכוך כאבים לאחר ניתוח והחדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את mouפרקדן se על פלטפורמה משופעת. כפי שניתן לראות באיור 2, קלסר המשרדי גדול עם לולאות תפר הדביק על עבודות היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את החלק הגחוני של הצוואר ולנקות ולחטא את אזור הצוואר עם אלכוהול 70%. עם כפפות חופשיות latex- והפודרה חדשות, להשתמש במכשירי ניתוח לחטא עם אלכוהול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מספריים חדים לעשות חתך ניתוחי קטן בצוואר כ -12 מ&quot;מ מתחת לשן החותכת התחתונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מלקחיים משוך בעדינות את העור בצוואר caudally עד קיר הגחון של קנה הנשימה שניתן לראות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לחזור בי הלשון ולהכניס את הצינורית עם הקצה המכופף המוטה לכיוון פני השטח הגחון של העכבר. כמו ב1.4, למשוך בעדינות על העור בצוואר, והכנס את הצינורית לקנה הנשימה. הערה: עם קצת תרגול, קטטר תהיה גלויה נעה כלפי מטה את קנה הנשימה. אם זה הולך בוושט, אז לא תהיה תצפית חזותית של התנועה של קטטר. אין חתכיםנעשים בקנה הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהצנתר ראה בקנה הנשימה בצוואר, מתקדם זה כ -5 מ&quot;מ להיות מהימן עבר מיתרי קול, אבל עדיין הרבה מעל קארינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן להנחיל עד 50 μl של נוזל על ידי הזרקה באמצעות הצנתר עם קצה פיפטה טעינת ג&#39;ל. הנח את הקצה ברכזת luer, אבל לפני הזרקת מבט זהירות להתבונן תנועה של הנוזל בקצה סינכרוני עם הנשימה של העכבר. אז להזריק instillate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מזרק 1 מיליליטר, לעשות מייד אינפלציה מהירה יחסית של 0.6 מיליליטר של אוויר לריאות דרך קטטר כדי לעזור להפיץ עמוק נוזל לריאות. הסר את הצינורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכמות קטנה של דבק cyanoacrylate כדי לסגור את פצע הניתוח הקטן לפי הוראות עלון לVetBond. מניחים עכברים בכלובים בודדים וחזותיים לפקח עליהם עד שהם מתעוררים ומתנהגים כרגיל ללא כל אינדיקציה discomfאורט. </li></ol> 2. ריאות קיבוע הערה: לאחר שכל הליכי הניסוי נעשים בעכבר, ניתן הכינו הריאות לעיבוד היסטולוגית על ידי קיבוע עם פורמלדהיד (או כל מקבע רצוי אחרים). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב את העכבר עם הליך מקובל IACUC. לעכבר הנציג מוצג בסרטון, משמש נקע בצוואר הרחם של עכבר הרדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע הנשמה (אם לא עשה) על ידי ניתוח חושף את הצד הגחוני של קנה הנשימה, מה שהופך אותו חתך קטן, והחדרת קצה מחט בדל 18 G לתוך קנה הנשימה, ולקשור אותו עם חוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתוח בזהירות את בית החזה עם חתך קו האמצע, לחתוך את הסרעפת, ולהסיר את קירות חזה לרוחב כדי לחשוף את הריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את קצה luer של המחט למאגר על דוכן טבעת המכיל פורמלדהיד. ראה איור 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המשטח העליון של פורמלדהיד 25 סנטימטרים מעל לרמה של mouSE. ראה איור 3. הבא לוודא שאין אוויר בצינור הקיבעון על ידי הפעלת נוזל החוצה סוף ברזלים. חבר את קצה luer של הצינורית לקנה הנשימה לצינורות המאגר. פתח את השסתום כדי לנפח את הריאות עם פורמלדהיד. השאר את הריאות תחת לחץ לפחות 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את השסתום כדי לנפח את הריאות עם פורמלדהיד. השאר את הריאות תחת לחץ לפחות 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, לקשור את קנה הנשימה מעבר לקצה של מחט הבדל. זה עשוי לעזור למשוך בחזרה לאט על המחט לחשוף יותר של קנה הנשימה uncannulated. כשקשור באופן מאובטח, להסיר את ברזלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות לנתח את הריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הריאות בפורמלדהיד הלילה. פעמים יותר בסדר, וכמה כתמים או לנהלים עלולים לציין שעות מסוימות. כמו כן כל fixatives נוזל אחר, כגון Z-תיקון יכול לשמש להחדרה והטבילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני עיבוד היסטולוגית נוסף, למדודקבוע הריאה כפי שתואר הבא הנפח. </li></ol> 3. מדידה של נפח הריאות הקבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את השימוש בעיקרון ארכימדס כפי שמודגם באיור 4 נפח הריאות. הסר את הריאות קבועות מפורמלדהיד ולנתח את הלב ואת כל רקמה הלא-ריאה אחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במכשיר שנבנה בעבר פשוט תוצרת בית תמיכת תיל המשמש כדי לשמור על הריאות מתחת למים באופן מלא. הערה: מכשיר זה צריך להיעשות בקנה אחד עם לפי המאזן נמצא בשימוש. מכשיר טיפוסי מוצג באיור 5 עשוי מהפלסטיק וטפטפות חוט הדק (20 G). מערכת זו פועלת היטב עם האיזון בשימוש בוידאו, אבל יכולה בקלות להיות מותאמת למרבית מאזני המעבדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כוס עם ≈200 מיליליטר של מים על האיזון וטרה עם הכלוב תומך במקום במים. ראה איור 6 הסר את כלוב המתכת.; למקם את הריאות על פני המים ולחצו מתחת למיםעם הכלוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את המשקל על היתרה. מספר זה משקף את נפח מים שנעקרו ולכן מדידה ישירה של נפח הריאות. להיות זהיר כדי לוודא ריאות או תפר או בכל חלק של כלוב התיל לא נוגע בצדדים או בתחתית של הכוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדיוק, לחזור על מדידה זו. הסר את הריאות מהמים, ויבשות ברקמה. הטרה הכוס עם כלוב במקום שוב ולחזור על מדידת נפח ריאות. שתי מדידות הנפח אמורים להיות בממוצע. הערה: אם הריאות נשארות בפורמלין ליותר משבוע על, האוויר לריאות יפורק בנוזל. כאשר זה קורה, הריאות ישקעו, כך שזה כבר לא צורך להשתמש בכל מכשיר כמו באיור 5 כדי לשמור על הריאות שקועות. במקרה כזה הנפח ניתן למדוד על ידי פשוט על ידי לחיצה על הריאות על ידי אחד ממייתרי התפר עד שהוא שקוע לחלוטין כפי שמודגם באיור 4. </li></ol>

<ol><li>Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+endotracheal+intubation+and+pulmonary+functional+assessment+for+repeated+studies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice.</a> J Appl Physiol. 87, 2362-2365 (1999).</li>
<li>Walters, D. M., Wills-Karp, M., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cellular+profile+and+lung+function+with+repeated+bronchoalveolar+lavage+in+individual+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Assessment of cellular profile and lung function with repeated bronchoalveolar lavage in individual mice.</a> Physiol Genomics. 2, 29-36 (2000).</li>
<li>Hamacher, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+wire+guide-based+orotracheal+mouse+intubation%3A+description%2C+evaluation+and+comparison+with+transillumination%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+animals%22%5BJournal%5D)">Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination.</a> Laboratory animals. 42, 222-230 (2008).</li>
<li>Spoelstra, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+and+simple+method+for+endotracheal+intubation+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory%22%5BJournal%5D)">A novel and simple method for endotracheal intubation of mice.</a> Laboratory. 41, 128-135 (2007).</li>
<li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+retrograde+intubation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+animal%22%5BJournal%5D)">A technique for retrograde intubation in mice.</a> Lab animal. 35, 39-42 (2006).</li>
<li>Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+endotracheal+intubation+of+mice+and+rats+used+in+imaging+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Contemporary+topics+in+laboratory+animal+science+%2F+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies.</a> Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 44, 52-55 (2005).</li>
<li>Vergari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+of+orotracheal+intubation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+review+for+medical+and+pharmacological+sciences%22%5BJournal%5D)">A new method of orotracheal intubation in mice.</a> European review for medical and pharmacological sciences. 8, 103-106 (2004).</li>
<li>Vergari, A., Polito, A., Musumeci, M., Palazzesi, S., Marano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-assisted+orotracheal+intubation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+animals%22%5BJournal%5D)">Video-assisted orotracheal intubation in mice.</a> Laboratory animals. 37, 204-206 (2003).</li>
<li>Hastings, R. H., Summers-Torres, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Laryngoscopy+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Contemporary+topics+in+laboratory+animal+science+%2F+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Direct Laryngoscopy in Mice.</a> Contemporary topics in laboratory animal science / American Association for Laboratory Animal Science. 38, 33-35 (1999).</li>
<li>Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+official+research+policy+statement+of+the+American+Thoracic+Society%2FEuropean+Respiratory+Society%3A+standards+for+quantitative+assessment+of+lung+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure.</a> Am J Respir Crit Care Med. 181, 394-418 (2010).</li>
<li>Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+for+the+measurement+of+mucociliary+function+in+the+mouse+by+scintigraphy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy.</a> J Appl Physiol. 90, 1111-1117 (2001).</li>
<li>Cai, Y., Kimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+intratracheal+intubation+to+study+the+pathology+and+physiology+of+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50601(2013).</li>
<li>Das, S., Macdonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+mouse+lung+intubation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A simple method of mouse lung intubation.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).</li>
<li>MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+simple+method+of+mouse+lung+intubation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">An improved simple method of mouse lung intubation.</a> J Appl Physiol. 106, 984-987 (2009).</li>
<li>Lum, H., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+10%25+formalin+fixation+on+fixed+lung+volume+and+lung+tissue+shrinkage%5BTitle%5D)+AND+%22American+Reveiw+of+Respiratory+Diseases%22%5BJournal%5D)">Effects of 10% formalin fixation on fixed lung volume and lung tissue shrinkage.</a> American Reveiw of Respiratory Diseases. 132, 1078-1083 (1985).</li>
<li>Bishai, J., Fields, M. J., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Mouse+Lung+Volumes+Inflated+with+Air+and+Instilled+Fixatives%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Am+Thorac+Soc%22%5BJournal%5D)">Comparison of Mouse Lung Volumes Inflated with Air and Instilled Fixatives.</a> Proc Am Thorac Soc. 3, A549(2006).</li>
<li>Mitzner, W., Brown, R., Lee, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+lung+volumes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of lung volumes in mice.</a> Physiol Genomics. 4, 215-221 (2001).</li>
</ol>

יש הנהלים שתוארו כאן יש מספר יתרונות. ראשון הציוד הנדרש הוא פשוט וזול. שנית, אינטובציה יכולה להיעשות במהירות עם כמה טעויות. שלישית, את היכולת לתקן את הריאות בלחץ מתמיד, ולאחר מכן למדוד את נפח ריאות הקבוע מאפשרת כימות נכונה של מבנים או תאים בריאה 10. חסרון אפשרי אחת לאינטובציה הוא הניתוח הקטן. הדבר עלול להגביל את היכולת לחזור על התהליך אם נדרש החדרת 2 nd. עם זאת, בניתוח ויישום זהירים של הדבק ...

למספר הסיבות, סרטן הריאות לא נחקר באופן נרחב בעכבר. אחת סיבות לכך היא שגישה לריאות קשה מאוד in vivo, וניתוח כמותי של ריאות קבועים לא נעשה בדרך כלל. השיטות שתוארו במאמר זה נועדו לתקן את המצב. המטרות הן מסמך לתאר שיטות פשוטות שיסייעו מאוד בהגדרה והניתוח של ריאות עכבר עם סרטן ריאות או פתולוגיות אחרות. למרות שאף אחד של גישות אלה הם חדשים לגמרי, הם לא הוצגו יחד כשיטות עצמאיות באופן פשוטים כפי שמתואר כאן. יש כבר מספר כתבי היד שתארו שיטות לאינטובציה של ריאות העכבר בעיקר לצורך עושה תפקוד הריאתי חוזר או שטיפה ברונכואלוואולרית בעכברים בודדים במחקרים ארוכי טווח. מאז שנייר מקורי, היו כמה עיתונים אחרים שתארו גישות שונות לmousאינטובציה דואר 1 -9. בעוד שכל אחת מהשיטות הללו יכולים לשמש בהצלחה, הם בדרך כלל דורשים הכשרה רבה, ולעתים קרובות הם לא בלי שיעור כישלון טריוויאלי. בנוסף, על מנת לבצע מדידות תפקוד הריאתי, הצינורית צריכה להתאים את קנה הנשימה חזק מספיק כך שאין דליפת אוויר. עם זאת, עוד שימוש מעשי לאינטובציה הוא לספק סוכנים ספציפיים (תאים סרטניים או עלבונות אחרים) או תרופות טיפוליות ישירות לריאות. הליך כזה אינו דורש צינורית הולמת הדוקה ולא כל ציוד תפקוד הריאתי מתוחכם. התכונה החדשנית של שיטה זו המוצגת כאן כרוכה הליך כירורגי קטין שמאפשר אינטובציה, ללא כל אפשרות של צינורית הזנת הוושט. גישה פשוטה זו מאפשרת אינטובציה מוצלחת עם הכשרה או ניסיון מועט יחסית. כ -30 עכברים / שעה ניתן לטפל באמצעות גישה זו עם שיעור כישלון מתקרב לאפס. ברגע שלאהוא העכברים מוכנים להקריב, הריאות נפצעו או סרטניים אז יכולות להיות הוסרו להיסטולוגית וניתוח פתולוגי. עם זאת, על מנת לכמת כראוי כל משתנים היסטולוגית להשוואה עם ריאות אחרות, זה חיוני כדי לתקנן את נהלי הקיבעון ולכמת את נפח ריאות הקבוע 10 כראוי. מאמר זה מתאר בפירוט את הנהלים הפשוטים שיאפשר נהלי קיבעון סטנדרטיים, כמו גם דרך למדוד קבוע נפח הריאות. הנפח הוא מדד חיוני בכימות של היסטולוגיה, שכן ללא קביעה כאמור נפח, ניתן למדוד רק צפיפות היחסית 10. ברגע שנפח הריאות ידוע, עם זאת, מדידות מוחלטות של תאים ומדידות מבניות אחרות בריאות אז יכולות להיות לכימות.

<table><tbody><tr><td>איזון מעבדה</td><td>Ohaus</td><td>Adventurer Pro דגם AV 313&nbsp;</td><td>ניתן להשתמש במאזנים אחרים אם יש להם טווח של 1-300 גרם</td></tr><tr><td>20 גרם קטטר תוך-ורידי Luer</td><td>Insylte</td><td></td><td>מספר ספקים אפשריים אחרים, למשל , בקבוק מעבדה של Jelco Optiva</td></tr><tr><td>500 מ"ל</td><td>שונים</td><td></td><td>מספר ספקים אפשריים אחרים</td></tr></tbody></table>

שיטות החדרה וקיבוע שימושיות בחקר סרטן ריאות עכבר

Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

היכולת להחדיר סוכנים חיים, תאים, או כימיקלים ישירות לתוך הריאות מבלי לפגוע או להרוג את העכברים היא כלי חשוב בחקר סרטן הריאה. אמנם יש מספר השיטות שפורסמו מראים כיצד לצנתר את העכברים למדידות תפקוד הריאתי, אף אחד מהם ללא בעיות פוטנציאליות להחדרה לקנה הנשימה מהירה בקבוצות גדולות של עכברים. בעבודה הנוכחית, שיטה פשוטה ומהירה מתוארת המאפשרת חוקר לבצע instillations כזה בצורה יעילה. השיטה אינה דורשת כל כלים או תאורה מיוחדים וניתן ללמוד עם תרגול מעט מאוד. היא כרוכה בהרדמת עכבר, ביצוע חתך קטן בצוואר כדי להמחיש את קנה הנשימה, ולאחר מכן החדרת צנתר לוריד ישירות. החתך הקטן סגור במהירות עם דבק רקמות, והעכברים אפשרו להתאושש. סטודנט או טכנאי מיומן יכול לעשות instillations בשיעור ממוצע של 2 דקות / עכבר. ברגע שלאהוא הסרטן שהוקם, יש לעתים קרובות צורך בניתוח הכמותי היסטולוגית של הריאות. באופן מסורתי פתולוגים בדרך כלל לא טורח לתקן אינפלציה ריאות במהלך קיבעון, וניתוחים מבוססים לעתים קרובות על שיטת ניקוד שיכול להיות די סובייקטיבי. אמנם זה עשוי להיות מתישהו מספיק הולם לאומדנים גולמי של הגודל של גידול ריאה, כל כימות stereological נכון של מבנה ריאות או תאים דורש הליך קיבעון לשחזור ומדידת נפח ריאות שלאחר מכן. כאן אנו מתארים נהלים אמינות פשוטים עבור שני תיקון הריאות תחת לחץ ולאחר מכן מדידה מדויקת הקבוע נפח הריאות. הדרישה היחידה היא משקל למעבדה כי הוא מדויק על פני טווח של G-300 מ&quot;ג 1. הנהלים שהוצגו כאן ובכך יכולים לשפר באופן משמעותי את היכולת ליצור, לטפל, ולנתח סרטן הריאות בעכברים.

ההליך לתאר בפרוטוקול הראשון אינו בעצמו הביא לשום תוצאות כלליות. זה רק מתאר אמצעי אמין מאוד להחדיר חומרים ישירות לקנה הנשימה. איור 7 מציג דוגמא של ריאות בי trypan הכחול הוחדרה עם השיטה המתוארת כאן. יש הפצה נרחבת של הצבע, דומה למה שכבר ראה עם צבעים אחרים או קליעים נותבים ניתנו ישירות לתוך קנה הנשימה או עכברי 11,12. יש לנו גם השתמשתי בשיטה זו כדי לספק גם bleomycin או אלסטט לריאות, מה שגורם בסיסטיק הנפוץ או אמפיזמה, בהתאמה. <p class="jove_content" style...

המטרה של מאמר זה היא לתאר שיטות פשוטות שיסייעו מאוד בהגדרה והניתוח של ריאות עכבר עם סרטן ריאות או פתולוגיות אחרות. אנו מציגים 3 פרוטוקולים פשוט ואמין לביצוע instillations ריאות, קיבעון, ומדידות נפח ריאות.

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer ...

המטרה הכללית של הפרוצדורה המוצגת כאן היא להדגים שיטות פשוטות שיסייעו רבות בהקמה ובניתוח של עכברים עם סרטן ריאות או פתולוגיות ריאתיות אחרות. ראשית, מוצגת שיטה להחדרה ישירה של תאי סרטן או טיפולים כימיים לריאות. לאחר מכן, מתוארים תהליכי קיבוע לאחר המוות ומדידות של נפח הריאות.דבר זה מושג תחילה על ידי הנבקת העכבר באמצעות קנולה תוורידית ששונתה מעט. לאחר מכן, הנוזל הרלוונטי מוחדר דרך הקנולה אל הריאה. לאחר מכן, כאשר כל ניסויי ה-in vivo הסתיימו והעכבר מת.הריאות מחוברות למאגר עבור קיבוע. בשלב הסופי, הריאות מנותחות ונפח הריאות נמדד. בסופו של דבר, ניתן להשוות את המורפולוגיה הכמותית של רקמת הריאה המקובעת בין דגימות ריאה ניסיוניות.היתרון המרכזי של טכניקת ההחדרה החדשה זו על פני שיטות קיימות הוא שבשיטה שלנו, כמעט ואין סיכוי להחדרה שגויה של הקנולה אל תוך הקנה. הפרוצדורה לקיבוע הריאות תחת לחץ קבוע היא פשוטה ומובילה לקיבוע עקבי בריאות שונות. לבסוף, השיטה למדידת נפח ריאת העכבר המקובעת מאפשרת נורמליזציה נאותה לצורך כימות תאי ריאה ומרכיבים מבניים.השתמשו בשיטה זו כדי להבטיח הן הולכה ישירה של התרופה או של חומר אחר רצוי לריאה, והן מדידה מדויקת ונקודתית של הריאה. לפני תחילת הפרוצדורה, כופפו ידנית את קצהו של קנולה תוך-ורידית מסחרית במידה 20 ובאורך של one inch לצורת עיקול קל.לאחר אישור ההרדמה באמצעות היעדר תגובה לצביטה בבהו, יש למרוח משחה על עיניו של עכבר בוגר ולקבע את העכבר במצב שכיבה גבנית (supine) על פלטפורמה משופעת בעזרת קליפס משרדי גדול ולולאות תפר. יש לגלח את החלק הוונטרלי (הבטני) של הצוואר ולחטא את העור באלכוהול 70%. לאחר מכן, באמצעות מספריים חדים, יש לבצע חתך כירורגי קטן בצוואר, כ-12 מילימטרים מתחת לשיני החיתוך התחתונות.לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי למתוח בעדינות את העור באזור הצוואר עד שניתן יהיה לראות את הדופן הוונטרלית של הקנה. לאחר מכן, הרחיקו בעדינות את הלשון והחדירו את הקנולה בעלת הקצה הכפוף, כשהיא מוטה לכיוון השטח הוונטרלי של העכבר. מתוחו שוב בעדינות את עור הצוואר, כפי שהודגם כעת.הכנס את הקנולה לקנה הנשימה כאשר ניתן להבחין בקטטר בתוך קנה הנשימה, והקדמ את הקטטר כחמישה מילימטרים כדי לעבור את מיתרי הקול. כעת, הנח את קצהו של פפית טעינת ג'ל הטעון ב-50 µL מהחומר להחדרה לתוך חיבור ה-lure של הקטטר. ודא שתנועת הנוזל בקצה הפפיטה מסונכרנת עם נשימתו של העכבר.לאחר מכן, הזרק את התמיסה באמצעות מזרק של 1 ml. נפח מיד את הריאות עם 0.6 ml של אוויר דרך הקטטר כדי לסייע בפיזור הנוזל ולהרחיב את הריאות. לאחר מכן, הסר את הקנולה.סגרו את הפצע הכירורגי בכמות קטנה של דבק ציאנואקרילט, והעבירו את העכבר לכלוב אינדיבידואלי תחת ניטור עד להחלמה מלאה. לאחר נקודת הזמן הניסוית האחרונה, בצעו חתך קטן בצווארו של בעל החיים כדי לחשוף את הצד הוונטרלי של הקנה. לאחר מכן, הכניסו קצה של מחט קצורה (stub needle) בכיול 18 gauge אל תוך הקנה.בעזרת חוט, קשרו את המחט בתוך הקנה ופתחו בזהירות את בית החזה באמצעות חתך בקו האמצע. לאחר מכן, חתכו את הסרעפת והסירו את דפנות החזה הצידיות כדי לחשוף את הריאות. לאחר מכן, ודאו שאין אוויר בצינור הקיבוע על ידי הרצת formaldehyde מקצה הברז (stopcock).לאחר מכן, חברו את הצינור הממולא בפורמלין ואת צינור המאגר ישירות לקצה הפיתיון של מחט הטרכאוסטומיה. הגדירו את פני השטח העליונים של הפורמלין בגובה של 25 centimeters מעל גובה הפה, ופתחו את הברז כדי לנפח את הריאות בחומר מקבע. לאחר השארת הריאות תחת לחץ למשך 20 דקות לפחות, משכו לאט את המחט אחורה כדי לחשוף חלק נרחב יותר של הקנה שאינו מקנול, תוךما קשירה של הקנה מעבר לקצה המחט הקצרה.לאחר שהקנה קשור היטב, הסר את ברז המעצור ובצע דיסקציה זהירה של הריאות. לאחר מכן, השקע את הריאות בפורמלידה למשך לילה. כאן מוצג מכשיר טיפוסי להחזקת הריאות במקומן במהלך קביעת נפח הריאה המקובע, העשוי מפ pipette-ים מפלסטיק וחוט דק בכיול 20 gauge; השתמש בו תחילה למדידת נפח הריאה המקובע, ולאחר מכן בצע דיסקציה להסרת הלב וכל רקמה אחרת שאינה רקמת ריאה מהריאות.בשלב הבא, הניחו על מאזניים כוס כימית המכילה כ-200 milliliters של מים ומצוידת במכשיר תמיכה מחוט, ואפסו את המאזנה. לאחר מכן, הסירו את המכשיר. הניחו את הריאה על פני המים והשתמשו במכשיר כדי ללחוץ את הרקמה אל מתחת לפני המים.תוך הקפדה על כך שתפר הריאה או כל חלק מהמכשיר אינם נוגעים בדפנות או בתחתית של הכוס, רשמו את המשקל במאזניים. מספר זה משקף את נפח המים שנדחקו והוא מהווה אפוא מדד ישיר לנפח הריאה. לאחר מכן ייבשו את הריאה בעזרת נייר ניגוב, הניחו את הכוס במכשיר שוב, וחזרו על מדידת נפח הריאה.לאחר מכן יש לחשב את הממוצע של שתי מדידות הנפח. מוצגת דוגמה של ריאה שבה הוזרק trypan blue כפי שהודגם זה עתה. שימו לב להתפזורות הנרחבת של הצבע, בדומה למה שנצפה עבור סמני צבע אחרים שהוגשו ישירות לקנה הנשימה של העכבר. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להחדיר את הקנולה בזהירות ולהקפיד שהקצה יהיה פונה כלפי הצד הוונטרלי (הבטני).הטכניקות שתיארנו כאן שימושיות במחקרים של סרטן ריאה, אך הן ישימות גם לרוב מודלי מחלות הריאה האחרים בעכבר.

instillation-and-fixation-methods-useful-in-mouse-lung-cancer-research

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

Instillations Intratracheal לספק מומסים ישירות לריאות. הליך זה מטרות אספקת instillate לתוך אזורים דיסטלי של הריאה, ולכן שולבו לעתים קרובות במחקרים שמטרתם ללמוד alveoli. אנו מספקים הישרדות פרוטוקול מפורט לביצוע instillations intratracheal בעכברים.

החדרה ישירה של קנה הנשימה אל הריאות מומסים עכבר

פרוטוקול הרומן שדווח במחקר הנוכחי מאפשר איתור סלקטיבי של גרורות בריאות ברזולוצית תא בודדה בעכברים על ידי...

ויזואליזציה המשופרת של גרורות בריאות ברזולוצית תא בודדה בעכברים על ידי משולב<em&gt; באתרו</em&gt; זלוף של רקמת ריאה וכתמי X-גל של<em&gt; LacZ</emגידול תאים&gt; תייג-

סרטון זה מתאר שיטה להשתלת תאי אדנוקרצינומה ריאתיים בריאות על ידי מיזוג מוקדם של דרכי הנשימה בחומר מעורר פיברוזיס – בלומיצין. שיטה זו משפרת באופן משמעותי את ההשתלה האורתוטופית של תאי סרטן הריאה לריאות...

השתלת אדנוקרצינומה: שיטה להשתלת תאים סרטניים בריאות המורין

סרטון זה מתאר שיטה פשוטה ואמינה להחדרת נוזלים לקנה הנשימה לצורך החדרת ריאות, קיבוע ומדידת נפח ריאה.

החדרת ריאות וקיבוע: החדרת נוזלים לקנה הנשימה ותיקון ריאות למדידת נפח הריאה הקבוע

מאמר זה מתאר שיטת striaghforward ויעילה של intubating עכברים למדידת תפקוד הריאתי או החדרה ריאתי, שמאפשרת לעכברים להתאושש ולהיחקר בתקופות מאוחרות יותר. ההליך כרוך מקור אור סיב אופטי יקר שמאיר ישירות לקנה נשימה.

שיטה פשוטה של ​​אינטובציה ריאות המאוסות

אנו מתארים שיטה כדי לשפר באופן משמעותי את engraftment orthotopic של סרטן ריאות תאים לריאות מאתר על ידי מיזוג מראש את דרכי הנשימה עם פציעה. גישה זו ויכול להיות מיושם גם ללמוד אינטראקציות סטרומה בתוך הריאות microenvironment, הפצתו גרורתי, morbidities משותף של סרטן ריאות, לייצר ביעילות רבה יותר החולה נגזר xenografts.

מיזוג מראש את דרכי הנשימה של עכברים עם Bleomycin מגדיל את היעילות של Orthotopic ריאות סרטן תא Engraftment

מוצג כאן הוא פרוטוקול שימושי עבור קיבעון ריאה שיוצר מצב יציב עבור הערכה היסטולוגית של דגימות ריאה ממודל העכבר של אמפיזמה. היתרון העיקרי של מודל זה הוא שהוא יכול לתקן את הריאות הרבה עם הלחץ התמידי אותו ללא התמוטטות ריאה או בדלציה.

קיבעון ריאה תחת לחץ מתמיד על הערכה של אמפיזמה בעכברים

Intratracheal (IT) המינהל של סוכנים ניסיוניים בעכברים לעתים קרובות מביא משלוח אסימטרי הריאות המרוחק.  בדוח זה, אנו מתארים גישה ישירה בלתי-מרורונצ'יאל (ליברות) כדי לאגור כל ריאה בעכברים חיים שאינם מבצעית.  גישה זו יכולה לשמש באופן סלקטיבי לניהול סוכנים לריאה אחת או להתאים כדי לשפר את מסירת הסוכן הסימטרי לשתי הריאות.

מינהל הארגון הישיר כדי לשפר את הסוכן הסלקטיבי התצהיר בתוך הריאה של העכבר

מטרת שיטה זו היא להציג שיטה פשוטה ויעילה עבור זלוף, אינפלציה, קיבוע של ריאות העכבר לבדיקת פתולוגיה גידול ריאות והערכת גרורות לריאה.

זלוף ואינפלציה של ריאת העכבר עבור היסטולוגיה גידול

אנו מציגים שיטה למודל פתוגנזה פטרייתית המשמרת את המיקום הטבעי של נבגי פטריות בדרכי הנשימה של הריאות לניתוח באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

שיטה יעילה להדמיית ריאות עכברים המשמרת דינמיקה מרחבית של נבגי פטריות בדרכי הנשימה

אתגר מרכזי בפיתוח טיפולים חדשים לסרטן ריאות כולל מידול המיקרו-סביבה של הגידול כאשר מחלה אזורית מתקדמת למחלה גרורתית. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה להקמת מודל סינגני אורתוטופי של סרטן ריאות המאפשר מעקב in vivo אחר המחלה לאורך זמן.

שיטה זעיר פולשנית ליצירת מודל עכבר אורתוטופי סינגני של סרטן ריאות

למד שיטות להחדרת תאי סרטן וחומרים לריאות עכברים, קיבוע לאחר המוות ומדידת נפח ריאה. פרוטוקולים אלה משפרים את חקר סרטן הריאה ומחלות ריאה אחרות במודלים מכרסמים.

שיטות החדרה וקיבוע שימושיות בחקר סרטן ריאות עכבר

גלה סרטונים נוספים