Name: טכניקת microfluidic Genipin הפקדת לתרבות מורחבת של כלי דם micropatterned השרירים Thin Films (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: למד טכניקת microfluidic להפקדת genipin ו-fibronectin על רקמות שרירי כלי דם דקים לחקירת תפקוד התכווצות שריר חלק לאורך זמן. השיטה שומרת על שלמות הרקמה עד שבועיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מכירים בתמיכה כספית ממענק פיתוח המדענים של איגוד הלב האמריקאי, 13SDG14670062 (PWA) ומלגת עבודת הדוקטורט של אוניברסיטת מינסוטה (ESH). אנו מכירים גם במשאבי המיקרו-ייצור של מרכז הננו של מינסוטה (MNC) ובמשאבי עיבוד התמונה של מרכזי ההדמיה האוניברסיטאיים (UIC), שניהם באוניברסיטת מינסוטה. חלקים מעבודה זו בוצעו במתקן האפיון באוניברסיטת מינסוטה, המקבל תמיכה חלקית מ-NSF באמצעות תוכנית MRS.

<ol><li>Humphrey, J. D., Baek, S., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemomechanics+of+cerebral+vasospasm+and+its+resolution%3A+I.+A+new+hypothesis+and+theoretical+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Biochemomechanics of cerebral vasospasm and its resolution: I. A new hypothesis and theoretical framework.</a> Ann. Biomed. Eng. 35, 1485-1497 (2007).</li>
<li>Hald, E. S., Alford, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+phenotype+switching+in+blast+traumatic+brain+injury-induced+cerebral+vasospasm%5BTitle%5D)+AND+%22Transl.+Stroke+Res%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle phenotype switching in blast traumatic brain injury-induced cerebral vasospasm.</a> Transl. Stroke Res. 5, 385-393 (2014).</li>
<li>Olivetti, G., Anversa, P., Melissari, M., Loud, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometry+of+medial+hypertrophy+in+the+rat+thoracic+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Morphometry of medial hypertrophy in the rat thoracic aorta.</a> Lab. Invest. 42, 559-565 (1980).</li>
<li>, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis.</a> Nature. 407, 233-241 (2000).</li>
<li>Alford, P. W., Feinberg, A. W., Sheehy, S. P., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biohybrid+thin+films+for+measuring+contractility+in+engineered+cardiovascular+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biohybrid thin films for measuring contractility in engineered cardiovascular muscle.</a> Biomaterials. 31, 3613-3621 (2010).</li>
<li>Rhodin, J. A. G. Architecture of the vessel wall. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRhodin%2C+JAG+%22Physiol.+Rev%22">Physiol. Rev</a>. ed, B. erne,R. ., , American Physiology Society. (1979).</li>
<li>Balachandran, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+strain+induces+dual-mode+endothelial-mesenchymal+transformation+of+the+cardiac+valve%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Cyclic strain induces dual-mode endothelial-mesenchymal transformation of the cardiac valve.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 19943-19948 (2011).</li>
<li>Grosberg, A., Alford, P. W., McCain, M. L., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ensembles+of+engineered+cardiac+tissues+for+physiological+and+pharmacological+study%3A+heart+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Ensembles of engineered cardiac tissues for physiological and pharmacological study: heart on a chip.</a> 11, 4165-4173 (2011).</li>
<li>Alford, P. W., Nesmith, A. P., Seywerd, J. N., Grosberg, A., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+smooth+muscle+contractility+depends+on+cell+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Vascular smooth muscle contractility depends on cell shape.</a> Integr. Biol. (Camb). 3, 1063-1070 (2011).</li>
<li>Win, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+architecture+within+cell-dense+vascular+tissues+influences+functional+contractility%29%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle architecture within cell-dense vascular tissues influences functional contractility).</a> Integr. Biol. (Camb). , (2014).</li>
<li>Genchi, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio%2Fnon-bio+interfaces%3A+a+straightforward+method+for+obtaining+long+term+PDMS%2Fmuscle+cell+biohybrid+constructs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Colloid+Surface+B%22%5BJournal%5D)">Bio/non-bio interfaces: a straightforward method for obtaining long term PDMS/muscle cell biohybrid constructs).</a> Colloid Surface B. 105, 144-151 (2013).</li>
<li>Fessel, G., Cadby, J., Wunderli, S., van Weeren, R., Snedeker, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-+and+time-dependent+effects+of+genipin+crosslinking+on+cell+viability+and+tissue+mechanics+-+Toward+clinical+application+for+tendon+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Dose- and time-dependent effects of genipin crosslinking on cell viability and tissue mechanics - Toward clinical application for tendon repair.</a> Acta Biomater. , (2013).</li>
<li>Lima, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genipin+enhances+the+mechanical+properties+of+tissue-engineered+cartilage+and+protects+against+inflammatory+degradation+when+used+as+a+medium+supplement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Genipin enhances the mechanical properties of tissue-engineered cartilage and protects against inflammatory degradation when used as a medium supplement.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 91, 692-700 (2009).</li>
<li>Madhavan, K., Belchenko, D., Tan, W. Roles of genipin crosslinking and biomolecule conditioning in collagen-based biopolymer: Potential for vascular media regeneration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMadhavan%2C+K+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22">J. Biomed. Mater. Res. A</a>. , (2011).</li>
<li>Satyam, A., Subramanian, G. S., Raghunath, M., Pandit, A., Zeugolis, D. I. In vitro evaluation of Ficoll-enriched and genipin-stabilised collagen scaffolds. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSatyam%2C+A+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22">J. Tissue Eng. Regen. Med</a>. , (2012).</li>
<li>Alford, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blast-induced+phenotypic+switching+in+cerebral+vasospasm%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Blast-induced phenotypic switching in cerebral vasospasm.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 12705-12710 (2011).</li>
<li>Song, H., Tice, J. D., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+system+for+controlling+reaction+networks+in+time%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">A microfluidic system for controlling reaction networks in time.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 42, 768-772 (2003).</li>
<li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).</li>
<li>Hald, E. S., Steucke, K. E., Reeves, J. A., Win, Z., Alford, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+vascular+contractility+assay+using+genipin-modified+muscular+thin+films%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Long-term vascular contractility assay using genipin-modified muscular thin films.</a> Biofabrication. 6, 045005(2014).</li>
<li>Han, M., Wen, J. K., Zheng, B., Cheng, Y., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+deprivation+results+in+redifferentiation+of+human+umbilical+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Serum deprivation results in redifferentiation of human umbilical vascular smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 291, C50-C58 (2006).</li>
<li>Feinberg, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscular+thin+films+for+building+actuators+and+powering+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Muscular thin films for building actuators and powering devices.</a> Science. 317, 1366-1370 (2007).</li>
<li>Volfson, D., Cookson, S., Hasty, J., Tsimring, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+ordering+of+dense+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Biomechanical ordering of dense cell populations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 15346-15351 (2008).</li>
<li>Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+remodeling+in+hypertension%3A+roles+of+apoptosis%2C+inflammation%2C+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Vascular remodeling in hypertension: roles of apoptosis, inflammation, and fibrosis.</a> Hypertension. 38, 581-587 (2001).</li>
<li>Kayembe, K. N., Sasahara, M., Hazama, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+aneurysms+and+variations+in+the+circle+of+Willis%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Cerebral aneurysms and variations in the circle of Willis.</a> Stroke. 15, 846-850 (1984).</li>
<li>McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromolded+gelatin+hydrogels+for+extended+culture+of+engineered+cardiac+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Micromolded gelatin hydrogels for extended culture of engineered cardiac tissues.</a> Biomaterials. 35, 5462-5471 (2014).</li>
<li>Weir, B., Grace, M., Hansen, J., Rothberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+vasospasm+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Time course of vasospasm in man.</a> 48, 173-178 (1978).</li>
<li>McCain, M. L., Sheehy, S. P., Grosberg, A., Goss, J. A., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulating+maladaptive%2C+multiscale+remodeling+of+failing+myocardium+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Recapitulating maladaptive, multiscale remodeling of failing myocardium on a chip.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9770-9775 (2013).</li>
<li>Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+heart+on+a+chip+for+higher+throughput+pharmacological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies.</a> Lab. Chip. 13, 3599-3608 (2013).</li>
<li>Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineered+physiological+biomimicry%3A+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips.</a> Lab. Chip. 12, 2156-2164 (2012).</li>
<li>Meer, A. D., van den Berg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-chips%3A+breaking+the+in+vitro+impasse%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Organs-on-chips: breaking the in vitro impasse.</a> Integr. Biol. (Camb). 4, 461-470 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שבונה על טכנולוגיה שפותחה בעבר vMTF, מאפשרים פעמים ניסוי מורחבות טיפוסיות יותר של מסלולי מחלת כלי דם כרוניים 1,23,24. כדי להשיג זאת, אנו micropattern genipin, אשר בעבר הוכח לספק functionalization לטווח הארוך של מצעי PDMS 11, תוך שימוש בטכניקה בתצהיר microfluidic להניב lamellae עורקים מהונדס עם כדאיות רקמות כלי דם משופרת לשימוש בניסויי התכווצות MTF. מקיין et al. פיתח מצע חלופי micromolded הידרוג&#39;ל ג&#39;לטין לתרבות מורחבת ...

מחלות כלי דם, כגון vasospasm המוחית 1,2, יתר לחץ דם 3, וטרשת עורקת 4, לפתח לאט, הן בדרך כלל כרוניים בטבע, וכרוכים בכוח-דור מתפקד על ידי תאי שריר חלק של כלי דם (VSMCs). אנו שואפים ללמוד בתפקוד אלה איטיים מתקדמים של כלי הדם באמצעות בשיטות מבחנה עם שליטה עדינה יותר של תנאי ניסוי מאשר בin vivo מודלים. סרטים שפותחנו בעבר בכלי דם שרירי דק (vMTFs) למדידת התכווצות פונקציונלית של רקמות מהונדסות במבחנה לב וכלי דם 5, אך שיטה זו הוגבלה למחקרים יחסית לטווח קצר. כאן, אנו מציגים טכניקת שינוי מצע שמתרחבת טכניקת vMTF הקודמת שלנו למדידות לטווח ארוך. בעוד האנדותל הוא גם קריטי בתפקוד כלי דם כללי, lamellae עורקים מהונדסים לספק מערכת מודל שימושית להערכת שינויים בכלי דםהתכווצות במהלך התקדמות מחלה. להנדס מודל פונקציונלי של כלי דם ברקמת מחלה, גם את המבנה ותפקוד של lamella העורקים, יחידת ההתכווצות הבסיסית של כלי השיט, יש סכמה עם איכות גבוהה. lamellae עורקים הם גיליונות קונצנטריים, circumferentially מיושר של VSMCs ההתכווצות מופרדת על ידי גיליונות של אלסטין 6. הדפסת microcontact של חלבוני מטריצה ​​תאית (ECM) על גבי מצעי polydimethylsiloxane (PDMS) כבר השתמשה בעבר כדי לספק רמזי הדרכה לארגון רקמה לחקות מיושרים רקמת לב וכלי דם 5,7-10. עם זאת, רקמות דוגמת באמצעות הדפסת microcontact יכול לאבד יושרה לאחר 3-4 ימים בתרבות, הגבלת תחולתם בלימודים כרוניים. פרוטוקול זה מספק פתרון לבעיה זו על ידי החלפת טכניקות הדפסת microcontact קודמות עם טכניקה בתצהיר microfluidic חדשה. Genchi et al. מצעי PDMS שונה עם genipin וFound ממושך כדאיות של myocytes עד חודש בתרבות 11. כאן, אנו משתמשים בגישה דומה להארכת תרבות של תאי שריר בדוגמת כלי דם חלקים על PDMS. Genipin, נגזר hydrolytic טבעית של הפירות גרדניה, הוא מועמד רצוי לשינוי מצע בשל רעילותה הנמוכה יחסית בהשוואה לסוכני crosslinking דומים והשימוש הגובר שלה כביולוגי בתחומי תיקון רקמות 12,13 ושינוי ECM 14, 15. בפרוטוקול זה, פיברונקטין הוא מנוצל כרמז הדרכת תא, כמו בשיטות הדפסת microcontact קודמות; עם זאת, genipin מופקד על גבי מצעים לפני דפוסי פיברונקטין PDMS. לפיכך, כתאים לבזות את המטריצה ​​בדוגמת, ECM מסונתז חדש מVSMCs המצורף יכול להיקשר למצע PDMS המצופה genipin. פרוטוקול זה משתמש בהתקן משלוח microfluidic לgenipin שני שלבים ותצהיר ECM. העיצוב של microco מחקה מכשיר microfluidicדפוסי הדפסת ntact משמשים לlamellae עורקים מהונדסים במחקרים קודמים 16. לפיכך, אנו מצפים פרוטוקול זה להניב מחקה lamellae עורקים שבהצלחה לשחזר מזדהים ביותר במבנה ותפקוד vivo התכווצות של lamellae עורקים. אנו גם מעריכים התכווצות רקמות כדי לאשר genipin שהיא תרכובת שינוי המצע מתאימה לטווח ארוך בדגמי מחלת כלי דם במבחנה.

<table><tbody><tr><td>מתלה צביעה Coverslip</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td><a href="http://www.emsdiasum.com/">www.emsdiasum.com/</a></td><td>72239-04</td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי מיקרוסקופ - 25 מ"מ</td><td>Fisher Scientific, Inc.</td><td><a href="http://www.fishersci.com/">www.fishersci.com</a></td><td>12-545-102</td></tr><tr><td>Poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td><a href="http://www.polysciences.com/">www.polysciences.com/</a></td><td>#21458</td></tr><tr><td>1-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>360465</td></tr><tr><td>Spincoater</td><td>Specialty Coating Systems, Inc.</td><td><a href="http://www.scscoatings.com/">www.scscoatings.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhesives (Dow Corning)</td><td><a href="http://www.ellsworth.com/">www.ellsworth.com</a></td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5 ק"ג</td></tr><tr><td>מיקרו-חרוזים פלואורסצנטיים</td><td>Polysciences, Inc.</td><td><a href="http://www.polysciences.com/">www.polysciences.com/</a></td><td>17151</td></tr><tr><td>פרוסות סיליקון</td><td>Wafer World, Inc.</td><td><a href="http://www.waferworld.com/">www.waferworld.com</a></td><td>2398</td></tr><tr><td>Photoresist&nbsp;</td><td>MicroChem Corp.</td><td><a href="http://www.microchem.com/">www.microchem.com</a></td><td></td></tr><tr><td>יישור מסכות מגע</td><td>Suss MicroTec</td><td><a href="http://www.suss.com/">www.suss.com</a></td><td></td></tr><tr><td>מפתח</td><td>MicroChem Corp.</td><td><a href="http://www.microchem.com/">www.microchem.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Tridecafluro-trichlorosilane</td><td>UCT Specialties, Inc.</td><td><a href="http://www.unitedchem.com/">www.unitedchem.com</a></td><td>T2492</td></tr><tr><td>אגרוף ביופסיה כירורגית</td><td>Integra LifeSciences Corp.</td><td><a href="http://www.miltex.com/">www.miltex.com</a></td><td>33-31AA-P/25</td></tr><tr><td>Genipin</td><td>Cayman Chemical</td><td><a href="http://www.caymanchem.com/">www.caymanchem.com</a></td><td>10010622</td></tr><tr><td>1X פוספט חוצץ מלח</td><td>Mediatech, Inc.</td><td><a href="http://www.cellgro.com/">www.cellgro.com</a></td><td>21-031-CV</td></tr><tr><td>פיברונקטין</td><td>קורנינג, בע"מ</td><td><a href="http://www.corning.com/">www.corning.com</a></td><td>356008</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Life Technologies, Inc.</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/">www.lifetechnologies.com</a></td><td>15140-122</td></tr><tr><td>תאי שריר חלק בעורק הטבורי</td><td>Lonza</td><td><a href="http://www.lonza.com/">www.lonza.com</a></td><td>CC-2579</td></tr><tr><td>רכיבי התמיסה של Tyrode</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td></td></tr><tr><td>מגוון סטריאומיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td><td>4350020000000000</td></tr><tr><td>פלטפורמה מבוקרת טמפרטורה</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td><a href="http://www.warneronline.com/">www.warneronline.com</a></td><td>641659; 640352; 641922</td></tr><tr><td>אנדותלין-1</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>E7764-50UG</td></tr><tr><td>HA-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>H139-10MG</td></tr></tbody></table>

טכניקת microfluidic genipin הפקדת לתרבות מורחבת של כלי דם micropatterned השרירים thin films

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

האופי הכרוני של התקדמות מחלות כלי דם דורש פיתוח של טכניקות ניסיוניות המדמות התנהגויות כלי דם פיזיולוגיות ופתולוגיות בטווחי זמן רלוונטיים למחלה. בעבר, הדפסת מיקרו-מגע שימשה לייצור חיקויים עורקיים פונקציונליים דו-ממדיים באמצעות דפוס של חלבון מטריצה חוץ-תאית כרמזים מנחים לארגון רקמות. סרטים דקים שריריים וסקולריים השתמשו בחיקויים אלה כדי להעריך את ההתכווצות התפקודית. עם זאת, טכניקת ייצור הדפסת המיקרו-מגע המשמשת בדרך כלל משלבת מצעי PDMS הידרופוביים. כאשר הרקמה הופכת את המטריצה החוץ-תאית הבסיסית, חלבונים חדשים חייבים לעבור שינוי קונפורמציה או דנטורציה על מנת לחשוף שאריות חומצות אמינו הידרופוביות למשטחי ה-PDMS ההידרופוביים לצורך התקשרות, וכתוצאה מכך פעילות ביולוגית של חלבון מטריצה משתנה, דלמינציה ומוות של הרקמות.
כאן, אנו מציגים טכניקת תצהיר מיקרופלואידית לדפוס של תרכובת הצלבה genipin. Genipin משמש כמתווך בין רקמות מעוצבות למצעי PDMS, ומאפשר לתאים להפקיד חלבון מטריצה חוץ-תאי שסונתז לאחרונה על משטח הידרופילי יותר ולהישאר מחובר למצעי ה-PDMS. אנו מראים גם שניתן לעצב חלבוני מטריצה חוץ-תאיים ישירות על גבי ג'יפין שהושקע, מה שמאפשר הכתבה של מבנה רקמה מהונדס. רקמות המיוצרות בטכניקה זו מראות נאמנות גבוהה הן ביישור המבני והן בתפקוד ההתכווצות של רקמת השריר החלק בכלי הדם במודל סרט דק שרירי כלי דם. ניתן להרחיב טכניקה זו באמצעות סוגי תאים אחרים ומספקת את המסגרת למחקר עתידי של פונקציונליות כרונית ברמת הרקמות והאיברים.

המטרה העיקרית של עבודה זו הייתה להאריך את הכדאיות של VSMCs micropatterned על מצעי PDMS הידרופובי. הדבר זה הושג על ידי שילוב מערכת מסירת microfluidic להפקיד genipin בדוגמת ופיברונקטין על PDMS (איור 1). בתצהיר של חלבוני ECM באמצעות משלוח microfluidic הניב העברת נאמנות גבוהה של דפוס הערוץ עם PDMS החשוף בין השורות של genipin ופיברונקטין (1D איור). התאים המצורפים (איור 1E) monolayers מחוברות צורה מחקה את מבנה vivo של lamellae ...

אנו מציגים שיטה לתצהיר מיקרופלואידית של ג'יניפין ופיברונקטין דפוסיים על מצעי PDMS, המאפשרת כדאיות מורחבת של רקמות צפופות תאי שריר חלק בכלי הדם. שיטת ייצור רקמות זו משולבת עם טכנולוגיית סרט דק שרירי כלי דם קודמת למדידת התכווצות כלי הדם לאורך מסלולי זמן רלוונטיים למחלה.

טכניקת microfluidic Genipin הפקדת לתרבות מורחבת של כלי דם micropatterned השרירים Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לפתח מודל in vitro של תפקוד התכווצות שריר חלק, שניתן להשתמש בו כדי לחקור את המנגנונים של תקלות תפקודיות בכלי הדם, כגון ואסו-ספאזם מוחי (cerebral vasospasms) לאורך לוחות זמנים הרלוונטיים למחלה. דבר זה מושג באמצעות שכבות דקות של שריר כלי דם לטווח ארוך, על ידי הכנה ראשונית של מצעים אלסטומריים באמצעות ציפוי ספין (spin coating) סדרתי של לוחות כיסוי ברצועה של piam ולאחריה PDMS. השלב השני הוא שימוש במכשיר השקעה מיקרופלואידי להשקעה סדרתית של genin ופיברונקטין על פני השטח.על מנת לספק רמזי הכוונה לארגון עצמי של רקמות על גבי שכבות דקות של תאי שריר כלי דם, השלב הסופי הוא ביצוע בדיקת כיווץ על ידי השראה של כיווץ והרפיית כיווץ בשכבות הדקות של תאי שריר כלי דם תוך כדי דימות של הדגימה. בסופו של דבר, גישה זו מניבה רקמות השומרות על נאמנות מבנית ועל כושר כיווץ תפקודי למשך עד שבועיים בתרבית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הדפסת מיקרו-מגע (micro contact printing) של שכבות דקות של תאי שריר, הוא ששלמות הרקמה וכושר הכיווץ התפקודי נשמרים למשך שבועות, בעוד שרקמות שנבנו בשיטות קודמות מתחילות להתפרק לאחר שלושה עד ארבעה ימים.בתרבית, שיטה זו מספקת פלטפורמה לבחינת שאלות מפתח במחלות כלי דם, כגון האופן שבו המכניקה התפקודית של עורקי דם משתנה במהלך התקדמות של מחלה כרונית. כאן אנו חוקרים מכניקה של כלי דם, אך ניתן ליישם שיטה זו על מערכות איברים מודליות אחרות, כגון טכנולוגיות של איברים על שבב (organ chip) לשחזור תפקוד של שריר הלב או שריר שלד. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר ביקשנו לחקור תפקודים לקויים של כלי דם המתפתחים לאט, ומצאנו כי השיטות הקיימות אינן מאפשרות כימות של תפקוד תאי שריר חלק בכלי דם, או שאינן שומרות על שלמות המערכת למשך פרק זמן מספיק.שיקוע מיקרופלואידי (Jin Microfluidic deposition) מספק תבנית לארגון עצמי של תאים באופן דומה להדפסה במגע מיקרוסקופי (micro contact printing), אך מאפשר גם לרקמות בעלות דפוס לשמור על מבנהן ושלמותן למשך פרקי זמן המתאימים לבדיקת רמיodeling של כלי דם. כדי להתחיל, נקהו סדרה של לוחות כיסוי מזכוכית בקוטר 25 millimeter כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה; כסו את קצוות לוחות הכיסוי הנקיים על ידי הצמדת סרט דביק לצדדיהם, כך שיישאר פס זכוכית חשוף במרכז. לאחר מכן, חתכו את לוחות הכיסוי מהצלחת והניחו אותם אחד אחד על צ'אק לציפוי בסחרור (spin coated chuck).באמצעות פינצטה, הוסיפו 150 µL של תמיסה בריכוז 10% של poly N isop profile. Acrylamide, המכונה גם poly pam או Piam, המומס ב-one butanol. ודאו כי השטח החשוף של זכוכית המכסה מכוסה לחלוטין.לאחר מכן, הפעל את ה-spin coater והעלה את המהירות במשך 10 שניות עד ל-3000 RPMs. המתן חמש שניות ולאחר מכן העלה את המהירות במשך 10 שניות עד ל-6,000 RPMs. המתן ב-6,000 RPMs למשך דקה אחת, ולאחר מכן הורד את המהירות בחזרה ל-3000 RPMs במשך 10 שניות.החזיקו זאת שם למשך חמש שניות לפני סיום מחזור הציפוי בסבב (spin coating). לאחר הייבוש, הסירו בזהירות את סרט ההדבקה מכל זכוכית הכיסוי, כך שכל שטח זכוכית הכיסוי יהיה חשוף עם שכבה דקה של ציפוי piam במרכז זכוכית הכיסוי. לאחר מכן, בצעו ציפוי בסבב של שכבת Degas PDMS על כל כיסוי.החליקו וייבשו אותם בתנור בטמפרטורה של 90 °C למשך 1.5 שעות לפחות. תכננו מסכת פוטו-ליתוגרפיה למיקרופלואידיקה של רקמות ולאחר מכן הכינו פרוסת סיליקון עם תבנית כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. לאחר יצירת התבנית, בצעו תגירה (etching) לפרוסה בשיטות סטנדרטיות והניחו אותה בצحن פטרי כאשר הצד עם התבנית פונה כלפי מעלה.לאחר מכן, ערבבו 100 גרם של PDMS עם יחס קושר (crosslinker) של 10 ל-1. שפכו את ה-PDMS אל תוך הצלחת כך שיכסה באופן מלא ואחיד את הוופר המודפס. הניחו את הצלחת במייבש ואקום למשך כ-30 דקות עד להסרה מלאה של כל בועות האוויר. לאחר מכן, בשלו את ה-PDMS בצלחת בטמפרטורה של 90 °C למשך 1.5 שעות לפחות.לאחר הפילוס, חתכו את עודפי ה-PDMS וקלפו באיטיות את ה-PDMS המודפס שנותר מצד התבנית של הפרוסה (wafer). חתכו את עודפי ה-PDMS מסביב לתבניות באמצעות להב תער ועצבו את ההתקנים למלבנים כדי להקל על הוצאת ההתקן בשלבים מאוחרים יותר. לאחר מכן, השתמשו במנקב ביופסיה כירורגי של 1 מילימטר כדי ליצור את חורי הכניסה והיציאה.בצע סוניקציה למכשירים המיקרופלואידיים ב-70% ethanol למשך 30 דקות לפחות לפני כל שימוש. הנח עד 10 לוחות כיסוי של מצע קולגן שרירי כלי דם (vascular muscular thin film substrate) במכשיר ניקוי אולטרה-סגול ואוזון למשך שמונה דקות. לאחר מכן, הכן תמיסת genin בריכוז חמישה מיליגרם למילליטר על ידי הוספה של 1 mL מים מזוקקים פעמיים סטריליים למכל של 5 mg של genin ליופיליזי.ערבבו את התמיסה באמצעות מערבל וורטקס והניחו את המבחנה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות. הניחו את ההתקנים המיקרופלואידיים המנוקים כאשר הצד התכנוני פונה כלפי מטה על כל כיסוי. החליקו אותם אחד אחד.לחצו בחוזקה על המכשירים כדי להבטיח איטום הדוק ללוחיות הכיסוי המצופות ב-PDMS. הניחו במהירות טיפה של 70% ethanol בכניסה של כל מכשיר לצורך הטרייה (priming) של המכשיר. לאחר חמש עד 10 דקות, שאבו בזהירות את עודפי ה-ethanol מהכניסה והחליפו אותם מיד בכ-100 microliters של PBS.השתמשו בואקום כדי להזרים PBS אל מוצא המכשירים כדי לשטוף את האתנול. הפסיקו כאשר נותרת כמות קטנה בלבד של PBS בכניסה. לאחר מכן, הניחו 60 µL של תמיסת גנין בריכוז 5 mg/mL בכל כניסה, והזרים את תמיסת הגנין דרך המכשירים באמצעות החלפת טיפ של שואב ואקום במוצא.הפסיקו את השאיבה כאשר נותרת כמות קטנה בלבד של תמיסה בפתח הכניסה. לאחר מכן, טפטפו PBS הן בפתח הכניסה והן בפתח היציאה כדי למנוע את התייבשות התמיסה. במהלך האינקובציה, העבירו את הצלחת המכילה את המכשירים לתנור לח או לאינקובטור המכוון ל-37 degrees Celsius והדגירה תימשך ארבע שעות.במהלך הדגירה, השהו מחדש את הפיברונקטין לריכוז של 50 µg/mL במים מזוקקים כפולים סטריליים והניחו אותו על קרח למשך 30 דקות לפחות לאחר הדגירה עם Jin. העבירו כמות מינימלית של PBS דרך פתח הכניסה. לאחר מכן, העבירו 100 µL של תמיסת פיברונקטין בריכוז 50 µg/mL.בכל פתח כניסה, משוך את התמיסה דרך ההתקנים באמצעות קצה של שואב ואקום. בפתח היציאה, העבר את הצלחת הפתוחה המכילה את ההתקנים לתנור או למדגרה המכוון ל-37 degrees Celsius והדגר למשך 24 שעות. לאחר ההדגרה, הסר בזהירות את ההתקנים מכיסי הזכוכית (cover slips) על ידי קילוף איטי של ההתקן בפינה, תוך כדי אחיזה קלה בכיסית הזכוכית ביד השנייה; הנח את כיסי הזכוכית לתוך צלחות סטריליות בעלות שישה בארות.הוסיפו לפחות חמישה מיליליטרים של תמיסת penicillin streptomycin לכל באר, ולאחר מכן הכניסו את הצלחות לאנקובטור סטרילי בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות לפחות. לאחר הסטריליזציה, שאבו את תמיסת ה-penicillin streptomycin והזרעו על הזרימות (cover slips) תאי שריר חלק של עורק טבילה אנושי (human umbilical artery vascular smooth muscle cells) בתרבית, בריכוז של 80,000 תאים לסמ"ר. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide למשך 24 שעות לפחות לפני הבדיקה.כדי להתחיל בבדיקה, הנח דגימת רקמה בצלחת של 100 millimeter. הוסף תמיסת tyro סטרילית שחוממה מראש ב-pH 7.4 עד לכיסוי הדגימה. באמצעות להב תער, בצע מספר חתכים מקבילים דרך שכבת התאים בניצב לקצה זרוע הצינור.בצעו חתכים שיניבו נתחי רקמה רחבים יותר בעובי של כ-two millimeters. אלו יהיו השכבות הדקות של השריר הכלי (vascular muscular thin films), המגומות ברצועות דקות שיוסרו מאוחר יותר. לאחר מכן, סובבו את הצלחת ב-90 מעלות ובצעו שני חתכים ישרים ומקבילים במרכז הרקמה, במקביל לרצועת ה-piam.הסר את הפסים הדקים שבין שכבות הדק הווסקולריות והשריריות כדי למנוע מגע בין השכבות הסמוכות. לאחר מכן, הנח את הצלחת על פלטפורמה בעלת בקרת טמפרטורה על במה של מיקרוסקופ סטריאואופטי, והתחל בלכידת תמונות time-lapse באור תמסורת ובאור פלואורסצנטי במרווחי זמן רצויים לאורך מהלך הבדיקה. טפל באופן סדרתי בשכבות הדק הווסקולריות-שריריות ב-50 nanomolar של endothelium, פעם אחת למשך 20 דקות כדי להשרות התכווצויות, ולאחר מכן ב-100 micromolar של HA 10 77 למשך 30 דקות כדי להשרות הרפיה לאחר קירור לטמפרטורה נמוכה מ-32 °C.ה-Piam נמס ומשחרר את שכבות הדקים השריריות של כלי הדם. מדידה של אורך ההיטל יכולה להמירה לרדיוס עקמומיות, המשמש לחישוב המאמץ הממוצע בשכבת התאים על גבי הדק, כפי שמוצג כאן בתמונות רצופות של אור תמסור מניסוי התכווצות מייצג. ניתן להמיר תמונות אלו לערכי מאמץ, שמהם מחושבים הטון הבסיסי וההתכווצות המושרה.בסרטון זה מוצג צילום רצף (time lapse) מייצג של בדיקת כיווצות מלאה. סרטי שריר דקים מגיעים לשיווי משקל כיווצית, ואז מתכווצים יותר עם הוספה של 50 nM אנדותל. אחד הסרטים נרפה לאחר הוספה של 100 µM ha 10 77.הירידה הקלה בטון הבסיסי ובכושר התכווצות הרקמה בסוף הבדיקה היא ככל הנראה תוצאה ישירה של המספר המופחת של התאים המרכיבים את הרקמה. מכיוון שתאי שריר חלק כלי דם המורעבים מסרום אינם מתחלקים, מוצגות כאן תמונות בניגודיות פאזה של תאי שריר חלק שגודלו על משטחים שעברו מודיפיקציה של גנין בנקודות זמן שונות של הקרבה, הנעות בין יום אחד לשבועיים. אימונוהיסטוכימיה שימשה כאן כדי להדגיש את ההתלכדות ואת היישור התאי של הרקמות על ידי צביעת פילמנטים של F actin בצבע ירוק לאחר יום אחד, ארבעה ימים ושבעה ימים של הרעבה מסרום.הערכה כמותית של התלכדות הרקמה (confluence) לאורך טווח זמן זה הראתה הידרדרות מינימלית על פני שטח אלו. הכיוון של סיבי ה-f actin נמדד כמותית ואושר כי הכיוון נשמר לאורך השבועיים. בתרבית, לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע ייצור רקמה in vitro זה ביומיים.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להתחיל את השיקוע המיקרופלואידי יום אחד לפני זריעת התאים המתוכננת, ולשמור על טמפרטורה פיזיולוגית קבועה במהלך ניסויי סרט ה-fin. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן להשתמש בשיטות ביוכימיות מסורתיות כגון Western blotting ו-PCR כדי לבחון שינויים בביטוי חלבונים וגנים, במטרה להקרין את הפנוטיפ של התאים עם ההתנהגות הפונקציונלית שלהם. טכניקה זו סוללת את הדרך עבור חוקרים לבחון את התקדמותן של הפרעות כלי דם המתפתחות לאט, כגון vasospasm מוחי, יתר לחץ דם ואתרוסקלרוזיס, וכן מודלים in vitro של דופן העורקים האנושית.

microfluidic-genipin-deposition-technique-for-extended-culture

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

בפרוטוקול זה, אנו מדגימים את ייצור של מערך microactuator מכלל הודעות העקורים אנכית שבו הטכנולוגיה מבוססת, ואיך הטכנולוגיה הזו בסיס ניתן לשנות לנהל תפוקה גבוהה תרבית תאים דינמי מכנית בתרבות הן דו מימדי ותלת מימדי פרדיגמות.

פלטפורמות microfabricated לתרבות Cell דינמי מכאני

טכניקות פשוטות מתוארים לייצור מהיר של microfabricated מערכות תרבות עצביים באמצעות מכשיר micromirror דיגיטלי ליתוגרפיה הקרנת דינמי מסכה על מצעים תרבות קבוע התא. אלה מערכות תרבות יכול להיות נציג נוסף של ארכיטקטורה ביולוגי טבעי, ואת הטכניקות המתוארות יכול להיות מותאם עבור יישומים רבים.

המצאה של הידרוג micropatterned למערכות התרבות עצבית באמצעות photolithography דינמי הקרנה מסכת

שיטת לתרבות monolayer תא האנדותל לאורך כל פני השטח הפנימי של המכשיר 3D microfluidic עם כלי הדם בגודל הערוצים (&lt;30 מיקרומטר) מתואר.

מיקרופלואידיקה Endothelialized לחקר אינטראקציות כלי הדם במחלות המטולוגיות

פלטפורמת microchannels-on-a-chip פותחה על ידי שילוב של טכניקת photolithographic reflowable photoresist, ליטוגרפיה הרכה, ומיקרופלואידיקה. פלטפורמת microchannels endothelialized מחקה את הגיאומטריה (3D) תלת ממדית של in vivo microvessels, פועלת תחת זרימת זלוף רציפה מבוקרת, מאפשרת הדמיה באיכות גבוהה ובזמן אמת, ויכולה להיות מיושמת למחקר כלי הדם.

הליך הפיתוח של Multi-עגול עומק חתך Endothelialized microchannels-on-a-chip

יצירת מיקרו-רקמות פונקציונליות בתוך מכשירים מיקרופלואידיים דורשת ייצוב של פנוטיפים של תאים על ידי התאמת טכניקות תרבית תאים מסורתיות לממדים המרחביים המוגבלים במיקרו-מכשירים. שינוי הקולגן מאפשר שקיעה שכבה אחר שכבה של מכלולי קולגן דקים במיוחד שיכולים לייצב תאים ראשוניים, כגון הפטוציטים, כמודלים של רקמות מיקרופלואידיות.

קולגן שכבת הפקדת-ידי שכבה במכשירי microfluidic לMicrotissue ייצוב

כתב יד זה מציג שיטת הזרקה להנדס microvessels כי לשחזר מאפיינים פיסיולוגיים של האנדותל. תהליך microfluidic המבוסס יוצר רשתות כלי דם 3D פטנט עם תנאי tailorable, כגון זרימה, רכב הסלולר, גיאומטריה, והדרגות ביוכימיים. תהליך ייצור ודוגמאות של יישומים פוטנציאליים מתוארים.

Micropatterning והרכבת 3D microvessels

פרוטוקול זה מתאר את היישום של פירוק הידרוג'ל מונחה תמונה ומבוסס לייזר לייצור רשתות מיקרופלואידיות ביו-נוזליות הנגזרות מכלי דם המוטמעות בהידרוג'לים פולי (אתילן גליקול) דיאקרילט (PEGDA). מערכות מיקרופלואידיות ביומימטיות אלו עשויות להיות שימושיות עבור יישומי הנדסת רקמות, יצירת מודלים של מחלות מבחנה וייצור מכשירים מתקדמים "על שבב".

תמונה מונחה, ייצור מבוסס-לייזר של רשתות Microfluidic הנגזרות דם

אנו מספקים פרוטוקול מוכללת המבוסס על אסטרטגיה bioprinting microfluidic הנדסה מיטה microfibrous בכלי הדם, שבו סוג התא משני יכול להיות עוד יותר נזרע לתוך מרחב ביניים של מבנה זה microfibrous ליצירת רקמות vascularized ו- organoids.

Vascularized Microfluidic Bioprinting עבור הנדסת רקמות, Organoids

הפרוטוקול מתאר כיצד מהנדס רשת כלי הדם perfusable ב ספרואיד. Microenvironment שמסביב של ספרואיד הוא פיתח כדי לגרום אנגיוגנזה ולהתחבר ספרואיד של microchannels את התקן microfluidic. השיטה מאפשרת את זלוף של ספרואיד, אשר היא טכניקה המיוחל בתרבויות תלת מימדי.

רשת כלי הדם perfusable עם דגם רקמה במכשיר Microfluidic

כאן, אנו מספקים שבב microfluidic ומערכת מיקרופלואידית במחזור מבוקרת ויעילה מאוד באופן אוטומטי, כי מסכם את microenvironment הראשונית של neovascularization, המאפשר לתאי אנדותל (ECs) להיות מגורה על ידי מתח גזירה זוהר גבוה, רמה פיזיולוגית של זרימה transendothelial, גורם צמיחה אנדותל כלי דם שונים (VEGF) הפצה בו זמנית.

מודל מיקרופלואידי לחקות אירוע ראשוני של ניאו-סקולריזציה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת מודל עור תלת מימדי פשוט ובלתי מופרע באמצעות פלטפורמה מיקרופלואידית מיקרו-מכונות. גישת זרימה מקבילה מאפשרת תצהיר במקום של תא עורי לזרוע של תאי אפיתל על גבי, כל נשלט על ידי משאבות מזרק.

יצירת דגם תלת מימדי תלת מימדי של עור על שבב בפלטפורמה מיקרופלואידית מיקרו-מכונות

למד טכניקת microfluidic להפקדת genipin ו-fibronectin על רקמות שרירי כלי דם דקים לחקירת תפקוד התכווצות שריר חלק לאורך זמן. השיטה שומרת על שלמות הרקמה עד שבועיים.

טכניקת microfluidic Genipin הפקדת לתרבות מורחבת של כלי דם micropatterned השרירים Thin Films

גלה סרטונים נוספים