Name: תאי T ללכוד חיידקים על ידי Transinfection מתאים דנדריטים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: חקור מנגנון לכידת חיידקים על ידי תאי T CD4+ מתאים דנדריטים נגועים במודל עכברים. השיטה מודדת טרנס-הדבקה חיידקית ומעריכה את יכולת ההרג של תאי T.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים BFU2011-29450, BFU2008-04342/BMC ממשרד המדע והחדשנות הספרדי ו-PIES201020I046 מ-Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas (CSIC).

הערה: נהלי ניסוי אושרו על ידי הוועדה לחקר אתיקה של Universidad de האוטונומית מדריד ונערכו בפיקוחו של Universidad de האוטונומי מדריד ראש רווחת בעלי החיים והבריאות בהתאם להנחיות ספרדיות ואירופאיות. עכברים גדלו בדיור ספציפי הפתוגן חופשי (SPF) והם מורדמים על ידי צוות מיומן ומוסמך באמצעות פחמן דו חמצני (CO 2) שיטת שאיפה. 1. עכבר מח עצם נגזר DCs בידול וזיהום הערה: איור 1 מסכם הצעד הראשון הזה. צריכה להתבצע כל הנהלים בברדס מנקודה זו ואילך, רק באמצעות תקשורת, מכשירים, טיפים פיפטה סטרילית ומנות תרבות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידול DCs נגזר מח עצם עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח tibias ועצמות ירך מאחד C57 / BL6 עכבר 22 ולהעביר לתוך צלחת פלסטיק עם 10 מיליליטר של מדיום RPMI. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך כל epiphysis את, עם מספריים סטרילי ולחשוף מח עצם, שבו יש צבע אדום בהיר אופייני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשרות את החלק הפנימי של העצם עם 10 מיליליטר של פוספט שנאגרו מלוח (PBS) המכיל 0.5% אלבומין בסרום שור (BSA) וחומצת 5 מ&quot;מ ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (חיץ / BSA / EDTA PBS) באמצעות מזרק סטרילי על פטרי סטרילי צַלַחַת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את ההשעיה תא צנטריפוגות בצינור ב 600 XG בצנטריפוגה בקירור (4 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי 1 מיליליטר של אמוניום-כלוריד-אשלגן חיץ (ACK) lysing (0.15 מ &#39;4 Cl NH, 10 מ&quot;מ KHCO 3 ו 0.1 mM EDTA) דגירה במשך 30 שניות בRT כדי לחסל תאי דם אדומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיליליטר של מדיום RPMI 1640 עם 10% בסרום שור עוברי (FBS) ולסנן דרך מסננת תא (70 מיקרומטר) כדי להסיר שברי עצמות וגושי תא לפני צנטריפוגה באותה המהירות (600 XG) כי גושים בוטלו על ידי סינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאיםד להתאים ל5 x 10 5 תאים / מיליליטר עם RPMI 10% FBS (B-mercaptoethanol 50 מיקרומטר המכיל, פירובט נתרן 1 מ&quot;מ) ולהוסיף 20 ng / ml גורם רקומביננטי עכברי granulocyte-מקרופאג שולט בקולוניה- גירוי (RM-GM-CSF) כריכוז סופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף השעיה זו לאיכות סטרילי, מיקרוביולוגים, 15 סנטימטר צלחת פטרי, ותרבות בחממה CO 2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל שלושה ימים, ספין למטה שני תאים שאינם חסיד ותאים מנותקים עם 5 מ&quot;מ EDTA ב PBS וגלול בשעת 5 x 10 5 תאים / מיליליטר של צפיפות תאים, עם מדיום טרי המכיל 20 ng / ml RM-GM-CSF. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התבגרות של טעינת DCs וAntigen <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 9, resuspend התאים בשעת 5 x 10 5 תאים / מיליליטר של צפיפות במדיום המכיל 20 ng / ml RM-GM-CSF. ואז להוסיף 20 ng / ml של lipopolysaccharide (LPS) כדי לאפשר ביטוי גבוה MHC-II בתאי דגירה בצלחת שטופלה תרבות הלא-רקמת סטרילי 15 סנטימטר פטרי במשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אחדיום של LPS-גירוי, להכתים כמה תאי DC עם נוגדנים נגד CD11c עכבר, MHCII וGr-1 כדי לבדוק בידול DCs על ידי cytometry זרימה. דוגמא לניתוח cytometry הזרימה של DCs מוצגת באיור 3 א ו3B. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה DCS (5 x 10 5 תאים / מדגם) עם נוגדנים חד שבטיים נגד העכבר-CD16 / CD32 על 2.5 מיקרוגרם / מיליליטר של ריכוז סופי ב -50 μl PBS / BSA EDTA חיץ / לדגימה. לאחר מכן, להוסיף 50 μl של הנוגדנים נגד MHCII (IA / IE), CD11c וGr-1 מצומדות עם fluorochromes שונה ב1: 100, 1: 200 ו- 1: 500 ב- PBS / BSA / חיץ EDTA בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, לשטוף DCs עם PBS / BSA / חיץ EDTA ולנתח ידי cytometry זרימה על פי הפרוטוקול של היצרן. הערה: אם התאים מובחנים היטב, תאים מוכנים לטעינת אנטיגן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף DCs עם RPMI 10% FBS (ללא אנטיביוטיקה) דגירה אותם עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר OTII OVAp (OVA 323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) בצינור פלסטיק 1 מיליליטר של RMPI 10% בינוניים FBS לכל 5 x 10 6 DCs עבור שעה 1 המינימום ב 37 מעלות צלזיוס. כביקורת שלילית, לעזוב DCs ללא דוגרים עם OVAp. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהום של DCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק DCs על ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 10 חיידקים (10 חיידקים לDC) לשעה 1 בחממה CO 2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את תאי DC פי 3 ב- PBS ו1x בFBS 10% RMPI צנטריפוגות ב 450 XG כדי לשטוף את רוב החיידקים תאיים. לבסוף, תאים גלולים ב 10% בינוניים RMPI FBS (ללא אנטיביוטיקה) בשעת 20 x 10 6 תאים / מיליליטר. </li></ol></li></ol> 2. בידוד של CD4 + T לימפוציטים מעכברים הטרנסגניים OTII הערה: איור 1 מסכם שלב שני זה. יש להשתמש בבלוטות הלימפה במקום טחול לבודד תאי CD4 + T, כי חלקם של לימפוציטים מסוג CD4 + בבלוטה לימפהs (~ 50%) הוא גדול יותר מאשר בטחול (~ 25%) ולכן הטיהור תהיה יעילה יותר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך השעיה תא בודד של בלוטות לימפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מפשעתי, בבית השחי, זרוע, צוואר רחם וימפה mesenteric צמתים 23 מעכברים מהונדסים OTII ולהעביר לתוך צלחת פלסטיק עם 10 מיליליטר של 10% בינוניים FBS RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוטות לימפה לטחון מתחת למכסת מנוע סטרילי באמצעות שתי שקופיות מיקרוסקופ חלבית. הנח בלוטות לימפה בצד חלבית של שקופית מיקרוסקופ אחד, ולשפשף עם צד חלבית של השקופית השנייה ועד איברים היו קרקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף השעיה תא בודדת במאגר PBS / BSA / EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את התאים למרות מסננת תא (70 מיקרומטר) כדי להסיר רקמות חיבור ולשטוף עם PBS / BSA / חיץ EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי 1 מיליליטר של חיץ תמוגה ACK דגירה דקות 1 ב RT כדי לחסל תאי דם אדומים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של תאי CD4 + T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שוב כמו בשלב 2.1.3 וספירהתאי resuspend אותם ב 100 x 10 6 תאים / מיליליטר PBS / BSA / חיץ EDTA. להוסיף נוגדני biotinylated נגד CD8, IgM, B220, CD19, MHC class II (I-Ab), CD11b, CD11c וDX5 ב 1: 250 במשך 30 דקות על קרח לבחירה מאוחר יותר שלילית של תאי CD4 + T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים בPBS / BSA / חיץ EDTA דגירה התאים (100 x 10 6 תאים / מיליליטר) עם microbeads streptavidin בריכוז מומלץ בפרוטוקול של היצרן במשך 15 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים בPBS / BSA / חיץ EDTA ולסנן אותם למרות שמסננת תא (30 מיקרומטר) לפני הבידוד של תאי CD4 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד תאי CD4 + T על ידי סלקציה שלילית באמצעות מכונה הפרדת תא מגנטית על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים ולהתאים עד 4 x 10 6 תאים / מיליליטר עם 10% בינוניים RPMI FBS (ללא אנטיביוטיקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתקן ולשמור על תאי קרח מבודד CD4 + T (3 x 10 5 תאים) כדי לבדוק את טוהר על ידי זרימהcytometer כמתואר 24. דוגמא לטיהור תאי CD4 + T מוצגת באיור 3 ג. </li></ol></li></ol> 3. תא T Transinfection מדידה על ידי assay הגנת גנטמיצין הערה: איור 2 מסכם שלב שלישי זה של הפרוטוקול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transinfection תא T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאי CD4 + T מבודדים עם תאים נגועים DC (1: 1) (חיידקים חופשיים DCs נדבקו לשעת 1 ורחץ לחסל) למשך 30 דקות כדי לאפשר היווצרות הסינפסה חיסונית בחממה CO 2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מיליליטר של תאים מבודדים CD4 + T (2 x 10 6 תאים) ושל 0.1 מיליליטר של DCs הנגוע (2 x 10 6 תאים) על צלחת תרבות 24 גם. כביקורת שלילית, להדביק ישירות 0.5 מיליליטר של תאי CD4 + T במשרד פנים של 10 חיידקים למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כולל בקרות נוספות הפרדת DCs נגוע מתאי T באמצעותמחסום transwell פוליקרבונט (עם 3 מיקרומטר של גודל נקבובית), מונע מגע פיזי DC-T. להוסיף 0.1 מיליליטר של DCs בתוך transwell ו 0.5 מיליליטר של תאי CD4 + T לתא התחתון של הקידוח (24 גם צלחת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, להשלים עם מדיום RMPI עד שיש 0.6 מיליליטר בכל טוב לעשות כמויות שווה בכל הדגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות של היווצרות הסינפסה חיסונית, להוסיף 100 מיקרוגרם / מיליליטר של גנטמיצין ודגירה עבור שעה 1 לפני איסוף תאים בחממה CO 2 (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-הבידוד של תאי CD4 + T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים שאינם חסיד וresuspend אותם במאגר PBS / BSA / EDTA. רוב DCs נשאר צמוד לצלחת תרבות הפלסטיק. צינורות מערבולת בעדינות כדי להבטיח disaggregation תא. שמור 500 μl של supernatant תא בקרה כדי להראות שגנטמיצין עבד היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד-מחדש תאי CD4 + T מדגימות המכילות DCs ותאי T יחד כמו בשלב 2.2, אם כי רוב DCs צריך מצורף על הצלחת. שמור את דגימות שליטה על קרח. קח בחשבון רק ניסויים עם זיהום פחות מ -2%. דוגמא לסוג CD4 + T טיהור תאים לאחר transinfection מוצגת באיור 3D. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי T Lyse וזרעם על חיידקים צלחות בינוניים-אגר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את תאי CD4 + T פעמיים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאי resuspend אותם ב 2 x 10 6 תאים / מיליליטר ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של 0.1% Triton X-100 ב -500 μl של תאי T לlyse ב1 x 10 6 תאים / מיליליטר, משחרר את החיידקים מחוץ לתאי T תאיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות 3 דילולים עשרוניים סידוריים של תאי lysed וזרע 50 μl של כל דילול על צלחות אגר בינוניות חיידקים. לחלק צלחות ל -4 חלקים וזרע דילולים השונים של תאי lysed בכל חלק. תוצאות נציגים מוצגות באיור 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כביקורת, גם צלחתsupernatant מאוחסן תא של conjugates על אגר, כדי להבטיח גנטמיצין שעבד היטב. גם צלחת DCs הנגוע כבקרה נוספת. במקרה זיהום DCs נמוך מתרחש (&lt;2%), להפחית את יחידות המושבה להרכיב (CFUs) המתאימות לזיהום DC נמוך. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. כימות Transinfection תא T על ידי cytometry הזרימה הערה: איור 2 מסכם את הצעד הזה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transinfection תא T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק BMDCs כמו בשלב 1.3, אבל להשתמש בחיידקי GFP להביע במקרה זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי CD4 + T הכתם (מבודדים מבלוטות לימפה בשלב 2.2) עם aminocoumarin chloromethyl גשש תא (CMAC) למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את תאי CD4 + T שכותרתו פעמיים עם FBS RMPI 10% (ללא אנטיביוטיקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה DCs הנגוע (לאחר דגירה 1 שעות עם חיידקים) עם CD4 + כותרתתאי T למשך 30 דקות כדי לאפשר היווצרות הסינפסה חיסונית על 37 מעלות צלזיוס כולל את כל הבקרות והסבירו בשלב 3.1.1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צביעת תאי CD4 + T נגועים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות של היווצרות הסינפסה חיסונית DC-T, לאסוף תאים ולשטוף אותם בPBS / BSA / EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שתי שטיפות עם PBS חיץ / BSA / EDTA, תאים מצטברים נפרדים בעדינות על ידי vortexing הצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הדגימות ב0.2 מיליליטר / שפופרת של PBS המכיל 3% PFA במשך 15 דקות ב RT. לאחר מכן לשטוף אותם בPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדן אנטי עכבר CD16 / CD32 חד שבטי (2.5 מיקרוגרם / מיליליטר) ב -50 μl / מדגם של PBS / BSA / EDTA במשך 15 דקות על קרח כדי לחסום קולטני Fc של תאים דנדריטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ארנב נגד חיידקי נוגדן (10 מיקרוגרם / מיליליטר כריכוז סופי) ב -50 μl / מדגם של PBS / BSA / EDTA במשך 30 דקות על קרח להכתים חיידקים תאיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים עם PBS / BSA / EDTA ודגירה עם נוגדן נגד CD11c עכבר מצומדות עם Phycoerythrin (PE) וseנוגדן condary נגד ארנב מצומדות עם fluorochrome אחר כמו Alexa-פלואוריד 647 ב 1: 200 ב100 μl / מדגם של PBS / BSA / EDTA במשך 30 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים ולנתח דגימות על ידי cytometry זרימה. אל תשכח לכלול מדגם של תאי T transinfected באמצעות חיידקים הלא ניאון שליטה שלילית וכדגימות שכותרתו עם רק אחד מכל fluorochrome השתמש בניסוי כדי לפצות את הדגימות ולהתאים את הזרימה cytometry הגדרות 25. ניתוח נציג מוצג באיור 5. הערה: אם חיידקים אינם מבטאים GFP, להבחין תאית וחיידקים תאיים, חיידקים תאיים תווית, לתקן, וpermeabilize דגימות עם טריטון X-100 ברמה של 0.5% ב- PBS במשך 5 דקות. לאחר מכן כתם חיידקים כולל (תאית + תאי) עם fluorochrome שונה. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+microorganisms+and+activation+of+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recognition of microorganisms and activation of the immune response.</a> Nature. 449 (7164), 819-826 (2007).</li>
<li>Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlberts%2C+B+%22Molecular+biology+of+the+cell%22">Molecular biology of the cell</a>. , Garland Science. New York. (1989).</li>
<li>Pancer, Z., Cooper, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The evolution of adaptive immunity.</a> Annual Review of Immunology. 24, 497-518 (2006).</li>
<li>Rhoades, R. A., Bell, D. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRhoades%2C+RA+%22Medical+Phisiology%22">Medical Phisiology</a>. , Lippincott Williams & Wilkins. (2012).</li>
<li>Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Invasion%3A+The+Paradigms+of+Enteroinvasive+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Invasion: The Paradigms of Enteroinvasive Pathogens.</a> Science. 304 (5668), 242-248 (2004).</li>
<li>Kaufmann, S. H., Schaible, U. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+presentation+and+recognition+in+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen presentation and recognition in bacterial infections.</a> Current Opinion in Immunology. 17 (1), 79-87 (2005).</li>
<li>Pizarro-Cerdá, J., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Adhesion+and+Entry+into+Host+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Bacterial Adhesion and Entry into Host Cells.</a> Cell. 124 (4), 715-727 (2006).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+activation+through+immunological+synapses+and+kinapses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">T-cell activation through immunological synapses and kinapses.</a> Immunological Reviews. 221, 77-89 (2008).</li>
<li>Calabia-Linares, C., Robles-Valero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+clathrin+drives+actin+accumulation+at+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Endosomal clathrin drives actin accumulation at the immunological synapse.</a> Journal of Cell Science. 124 (5), 820-830 (2011).</li>
<li>Westcott, M. M., Henry, C. J., Cook, A. S., Grant, K. W., Hiltbold, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+susceptibility+of+bone+marrow-derived+dendritic+cells+and+macrophages+to+productive+infection+with+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Differential susceptibility of bone marrow-derived dendritic cells and macrophages to productive infection with Listeria monocytogenes.</a> Cellular Microbiology. 9 (6), 1397-1411 (2007).</li>
<li>Geijtenbeek, T. B., Kwon, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC-SIGN%2C+a+dendritic+cell-specific+HIV-1-binding+protein+that+enhances+trans-infection+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells.</a> Cell. 100 (5), 587-597 (2000).</li>
<li>Izquierdo-Useros, N., Naranjo-Gòmez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+and+mature+dendritic+cells%3A+Trojan+exosomes+riding+the+Trojan+horse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">HIV and mature dendritic cells: Trojan exosomes riding the Trojan horse.</a> PLoS Pathogens. 6 (3), e1000740(2010).</li>
<li>Mittelbrunn, M., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+communication%3A+diverse+structures+for+exchange+of+genetic+information%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Intercellular communication: diverse structures for exchange of genetic information.</a> Nature Reviews. Molecular cell biology. 13 (5), 328-335 (2012).</li>
<li>McElroy, D. S., Ashley, T. J., D'Orazio, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytes+serve+as+a+reservoir+for+Listeria+monocytogenes+growth+during+infection+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Lymphocytes serve as a reservoir for Listeria monocytogenes growth during infection of mice.</a> Microbial Pathogenesis. 46 (4), 214-221 (2009).</li>
<li>Salgado-Pabon, W., Celli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+impairs+T+lymphocyte+dynamics+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Shigella impairs T lymphocyte dynamics in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (12), 4458-4463 (2013).</li>
<li>Cruz Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+kill+bacteria+captured+by+transinfection+from+dendritic+cells+and+confer+protection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">T cells kill bacteria captured by transinfection from dendritic cells and confer protection in mice.</a> Cell Host and Microbe. 15 (5), 611-622 (2014).</li>
<li>Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+TCR+expression+in+transgenic+mice+constructed+using+cDNA-based+alpha-+and+beta-chain+genes+under+the+control+of+heterologous+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements.</a> Immunology and Cell Biology. 76 (1), 34-40 (1998).</li>
<li>Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bone+marrow+derived+murine+dendritic+cells+for+use+in+2-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (17), (2008).</li>
<li>Inaba, K., Inaba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li>
<li>Thöne, F., Schwanhäusser, B., Becker, D., Ballmaier, M., Bumann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-isolation+of+Salmonella-infected+cells+with+defined+bacterial+load+from+mouse+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">FACS-isolation of Salmonella-infected cells with defined bacterial load from mouse spleen.</a> Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 220-224 (2007).</li>
<li>Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gentamicin+antibacterial+activity+in+the+presence+of+human+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 16 (6), 743-749 (1979).</li>
<li>Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M., et al. Chapter 14, The isolation and characterization of murine macrophages. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhang%2C+X+%22Current+protocols+in+immunology%22">Current protocols in immunology</a>. Coligan, J. E., et al. , Unit 14.1(2008).</li>
<li>Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+th17+differentiation+of+na%C3%AFve+CD4+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50765(2013).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).</li>
<li>Foucar, K., Chen, I. M., Crago, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+operation+of+a+flow+cytometric+immunophenotyping+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+diagnostic+pathology%22%5BJournal%5D)">Organization and operation of a flow cytometric immunophenotyping laboratory.</a> Seminars in diagnostic pathology. 6 (1), 13-36 (1989).</li>
<li>Itano, A. A., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+presentation+to+naive+CD4+T+cells+in+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node.</a> Nature Immunology. 4 (8), 733-739 (2003).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

תאי T או התאים T הם סוג של כדוריות דם לבנות שתפקיד מרכזי בחסינות תא בתיווך ושייך לתגובה החיסונית אדפטיבית 26. תאי T הם עקשן ללהידבק במבחנה אבל כמה דיווחים מצביעים על כך שהם יכולים להיות נגועים בvivo 14,15. הקשר האינטימי של תאי APC ו- T בסינפסה החיסונית לשמש פלטפורמות להחלפת חומר ביולוגי 13, כוללים כמה וירוסים כגון HIV 11. לאחרונה הוצגו כי בניגוד לדוגמא, תאי T, את הפרדיגמה של תאים של חסינות אדפטיבית, הם גם מסוגל ללכוד בי...

כאשר הפתוגן מדביק המארח שלה, בדרך כלל יש הפעלה של המערכת החיסונית המולדת ובעלי כושר הסתגלות, הכרחי לקבלת אישור בקטריאלי. חסינות מולדת היא קו הגנה הראשון המונע הזיהומים ביותר. חסינות מולדת להבחין באלמנטים מדויקים דרך שהשתמרו בקרב קבוצות רחבות של מיקרואורגניזמים (הקשורים דפוסים מולקולריים הפתוגן, PAMPS) 1. המנגנונים של מערכת חיסון מולדת כוללים מחסומים פיזיים כגון עור, מחסומי כימיקלים (פפטידים מיקרוביאלית, יזוזים) וכדוריות דם לבנות המולדים, הכוללים את phagocytes (מקרופאגים, נויטרופילים, ותאים דנדריטים), תאי פיטום, אאוזינופילים, בזופילים, ותאי הרג טבעיים 2. תאים אלה לזהות ולחסל פתוגנים, בין אם על ידי תוקף אותם באמצעות מגע או באמצעות phagocytosis, הכולל מחולל האופפת והרג. מערכת זו אינה מאפשרת הגנה לכל החיים, בניגוד לחסינות אדפטיבית, המעניק זיכרון חיסוני כנגד עמ &#39;athogens. המערכת החיסונית אדפטיבית היא קו הגנה השני, והוא מסוגל לזהות ולהגיב לאנטיגנים ספציפיים של חיידקים מרובים וחומרים שאינם חיידקים 3. המרכיבים העיקריים של המערכת החיסונית אדפטיבית הם לימפוציטים, הכוללים תאי B ו- T. תאי B מעורבים בתגובת הלחות, מפריש נוגדנים נגד פתוגנים או חלבונים אקסוגניים. עם זאת, תאי T מייצגים את חסינות התא בתיווך, ויסות התגובה החיסונית עם הפרשת ציטוקינים או תאים נגועים בפתוגן הרג 4. תאי הצגת אנטיגן (נגמ&quot;שים) כוללים תאים דנדריטים או מקרופאגים, מרכיבים של מערכת החיסון המולדת, יכול לזהות פתוגנים phagocytose ורכיבי חיידקי תהליך לאנטיגנים, המוצגים על פני התא על ידי histocompatibility סרן מורכב (MHC) 5-7. לאחר נגמ&quot;שים שphagocytized פתוגנים, הם בדרך כלל להעביר לבלוטות הלימפה ניקוז, שבו הם מתקשרים עם Tתאים. לימפוציטים מסוג T יכול לזהות מתחמי פפטיד-MHC ספציפיים על ידי קולטני תאי T שלהם. סינפסה החיסונית (IS) מתרחשת בממשק שבין APC-עמוס אנטיגן והלימפוציטים במהלך מצגת אנטיגן 8,9. חיידקים מסוימים יכולים לשרוד phagocytosis ולהפיץ באופן שיטתי בתוך נגמ&quot;שים. בתצוגה זו, נגמ&quot;שים נגועים לשמש כמאגרי חיידקים או &quot;סוסים טרויאניים&quot; המאפשרים התפשטות חיידקי 10. קשר האינטימי בין נגמ&quot;שים וימפוציטים שיתקיימו במהלך ההיווצרות גם לתפקד כפלטפורמה להחלפה של חלק מקרומים, חומר גנטי וexosomes ויכול להיות שנחטף לכמה וירוסים להדביק תאי T; תהליך זה נקרא transinfection 11-13. כמה חיידקים פתוגניים (חיידקי ליסטריה, סלמונלה enterica וflexneri Shigella) יכולים לפלוש לימפוציטים מסוג T in vivo ולשנות את ההתנהגות שלהם 14-16. יש לנותאר לאחרונה כי לימפוציטים מסוג T הוא גם מסוגל לתפוס חיידקים על ידי transinfection מהתאים דנדריטים נגועים בעבר (DCS) במהלך הצגת אנטיגן 16. תא T ללכוד חיידקים על ידי transinfection מאוד יעיל יותר (1,000-4,000x) מאשר זיהומים ישירים. הפתוגן T ללכוד תאים וחיידקים שאינם פתוגן המציין מ transinfection הוא תהליך מונע על ידי תאי T. באופן מפתיע, transinfected T (ציצי) תאים נהרגו במהירות את החיידקים שנתפסו ועשו זאת בצורה יעילה יותר מאשר phagocytes המקצועי 16. תוצאות אלו, שתשבורנה דוגמה לאימונולוגיה, מראות כי התאים של חסינות אדפטיבית יכולים לבצע פעולות שהיו כביכול בלעדיים של החסינות המולדת. בנוסף, הראינו כי תאי ציצי מפרישים כמויות גדולות של ציטוקינים פרו-דלקתיים ולהגן מפני זיהומים חיידקיים בvivo. כאן אנו מציגים את הפרוטוקולים השונים המשמשים ללימוד תהליך transinfection חיידקים במודל עכבר. מודל זה מבוסס על השימוש בתאים מסוג CD4 + T מעכברים מהונדסים OTII, אשר נושאים ספציפי TCR לפפטיד 323-339 של OVA (OVAp) בהקשר של I-17 Ab כי אינטראקציה ספציפית עם עצם חיידקים נגוע מארו DCs נגזר (BMDCs) 18,19 עמוס OVAp, יוצר סינפסות חיסוני יציבה. transinfection תא T ניתן דמיין ומעקב באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בנוסף, cytometry הזרימה יכול לשמש לזיהוי תאים נגועים על ידי ניצול של הקרינה הנפלטת ידי חיידקים לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) 16,20. יתר על כן, transinfection תא T ניתן לכמת על ידי גישה רגישה יותר, assay הישרדות גנטמיצין המאפשר מדידה של מספר גדול של אירועים. גנטמיצין הוא אנטיביוטיקה שלא יכול לחדור תאים האיקריוטים. לכן, שימוש באנטיביוטיקה זו מאפשרת בידול של חיידקים תאיים ששרד את fr בנוסף לאנטיביוטיקהאלה תאיים אום שנהרגו 21.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td></td></tr><tr><td>r-GMCSF</td><td>Peprotech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>SIGMA</td><td>L2630-10mg</td><td></td></tr><tr><td>ו-Pyruvate</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3023901</td><td></td></tr><tr><td>2-ME</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>OVAp OTII (323&ndash; 339)</td> <td>מסננת תאים GenScript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70uM</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 30 uM מזרק Filcons סטרילי</td><td>BD</td><td>340598</td><td></td></tr><tr><td>AutoMacs קלאסי</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-088-887</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Normon</td><td>624601.6</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Costar</td><td>3415</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>Pronadisa</td><td>1231</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Pronadisa</td><td>1800</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16%</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD8 biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553029</td><td></td></tr><tr><td>IgM Biot</td><td>ImmunoStep</td><td>Clone RMM-1</td><td></td></tr><tr><td>B220 Biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553086</td><td></td></tr><tr><td>CD19 biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553784</td><td></td></tr><tr><td>MHC-II Biot (I-A/I-E)</td><td>BD Biosciences</td><td>553622</td><td></td></tr><tr><td>CD11b biot</td><td>Immunostep</td><td>11BB-01mg</td><td></td></tr><tr><td>CD11c biot</td><td>Immunostep</td><td>11CB3-01mg</td><td></td></tr><tr><td>DX5 biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553856</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1 biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553125</td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32</td><td>ImmunoStep</td><td>M16PU-05MG</td><td></td></tr><tr><td>אנטי סלמונלה</td><td>ABD Serotec</td><td>8209-4006</td><td></td></tr><tr><td>CD11cPE</td><td>BD Biosciences</td><td>553802</td><td></td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>20-0041-U100</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>553129</td><td></td></tr><tr><td>MHC-II (I-A/I-E) FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>553623</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 647 נוגדן IgG (H+L) נגד ארנב עזים,</td><td>Invitrogen</td> <td>נספג מאודA-21245</td><td></td></tr><tr><td>CMAC (7-אמינו-4-כלורומתילקומרין)</td> <td>טכנולוגיות חיים</td><td>C2110</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA</td><td>A7030-100G</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטווידין מיקרו-חרוזים</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

תאי t ללכוד חיידקים על ידי transinfection מתאים דנדריטים

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

לאחרונה, הראנו, בניגוד למה שמתואר, שתאי CD4+ T, הפרדיגמה של תאי חיסון נרכשים, לוכדים חיידקים מתאים דנדריטיים נגועים (DCs) בתהליך הנקרא טרנס-זיהום. כאן, אנו מתארים את הניתוח של תהליך הזיהום, המתרחש במהלך הצגת האנטיגן. תהליך זה נחשף על ידי שימוש בתאי CD4+ T מעכברי OTII טרנסגניים, הנושאים קולטן תאי T (TCR) ספציפי לפפטיד של אובולאבומין (OVAp), ולכן יכול ליצור קומפלקסים חיסוניים יציבים עם תאים דנדריטיים נגועים טעונים ב-OVAp הספציפי הזה. ניתן לנטר את הדינמיקה של חיידקים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) במהלך העברת תאי DC-T על ידי הדמיית תאים חיים וכימות זיהום חיידקי יכול להתבצע על ידי ציטומטריית זרימה. בנוסף, ניתן לכמת זיהום טרנס-הדבקה בשיטה רגישה יותר המבוססת על שימוש בגנטמיצין, אנטיביוטיקה אמינוגליקוזיד לא חדירה שהורגת חיידקים חוץ-תאיים אך לא תוך-תאיים. שיטה קלאסית זו שימשה בעבר במיקרוביולוגיה כדי לחקור את יעילותם של זיהומים חיידקיים. אנו מסבירים בזאת את הפרוטוקול של התהליך השלם, מבידוד התאים הראשוניים ועד לכימות זיהום טרנס.

במסמך שתארנו כיצד לבצע transinfection חיידקי תא T עכברי ממח עצם נגוע נגזר DCs ואיך למדוד transinfection חיידקים באמצעות שתי גישות שונות: cytometry הזרימה וגנטמיצין הישרדות assay איור 1 מסכם את ההליך כדי לקבל את התאים.. DCs מופקים על ידי דגירה של תאי מח עצם עם GM-CSF ל9 ימים. אז, DCS הם maturated עם LPS להגדיל MHCII על קרומו כדי לטעון אותם מאוחר יותר על עם פפטיד ספציפי של OVA (OVAp). כביקורת, כמה DCs אינם עמוס OVAp. DCs שני (OVAp-הט...

הנה פרוטוקול מוצג למדוד לכידת חיידקים על ידי תאי CD4 + T אשר מתרחש במהלך מצגת אנטיגן באמצעות transinfection מהתאים נגועים מראש דנדריטים (DC). אנו מראים כיצד לבצע את הצעדים הדרושים: בידוד של תאים ראשוניים, של היווצרות זיהום המצומד תא DC, DC / T, ומדידה של transfection תא T חיידקים.

תאי T ללכוד חיידקים על ידי Transinfection מתאים דנדריטים

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לכמת טרנס-אינפקציה של תאי CD4+T על ידי חיידקים, תוך שימוש במודל של תאי עכבר. In vivo, חיידקים פתוגניים מסוימים כגון Listeria monocytogenes ו-Salmonella enteritidis מסוגלים להדביק לימפוציטים מסוג T ולשנות את התנהגותם. עם זאת, in vitro, תאי T אינם ניתנים להדבקה בקלות.בהתבסס על תצפית זו, בדקנו האם תאי T יכולים ללכוד חיידקים מתאי דנדריטיים נגועים במהלך הצגת אנטיגן, כפי שקורה בזיהומים ויראליים. מצאנו כי תאי T לוכדים חיידקים ולאחר מכן הורגים אותם. למעשה, מצאנו כי תאי T עושים זאת ביעילות רבה יותר מפגוציטים מקצועיים.תוצאות אלו סותרות עיקרון מרכזי באימונולוגיה, ומראות כי תאים מהחסינות הנרכשת יכולים לבצע פונקציות שנחשבו כבלעדיות לחסינות המולדת. היום נציג את הפרוטוקול ששימש לחקר תהליך התעתוק הבקטריאלי (transinfection) במודל עכבר. אסטבן וייגה ואני נדגים את ההליך זה יחד עם גיירמו רמירז-סנטיאגו, ראקאל גרסיה-פרראס, שני סטודנטים לתארים מתקדמים, ומוניקה טורס-טורסאנו, טכנאית.שימו לב כי יש לבצע את כל הפרוצדורות המתוארות בסרטון זה תחת מነት, תוך שימוש במדיום, מכשירים, טיפים לפ pipette וצלחות תרבית סטריליים בלבד. לצלחת Petri סטרילית בנפח 15 סנטימטר שלא עברה טיפול לתרביות רקמה, הוסיפו 1 µL של 1 mg/mL lipopolysaccharide לתאי דנדריטיים המופקים ממח עצם של עכבר בודד. דגרו את התאים למשך 24 שעות כדי להגביר את ביטויו של קומפלקס התאימות הראשית II, או MHC II.לאחר הדגירה, בצעו ציטומטריה של זרימה כדי לאשש את ביטויו של MHC II ואת הדיפרנציאציה. לאחר שביטוי MHC II אושש, כפי שמוצג כאן, העבירו את התאים לשפופרת פוליפרופילן סטרילית של 50 milliliter. הוסיפו 10 milliliters של PBS המכיל 5 millimolar EDTA, ולאחר מכן סבבו את התאים בצנטריפוגה במהירות של 600 x g.בסיום הסבוב, בצעו שטיפה על ידי השעיה מחדש של התאים ב-RPMI עם 10%FBS, ולאחר מכן צנטריפוגה פעם נוספת. לאחר השטיפה, הוסיפו מיליליטר אחד של RPMI 10%FBS עבור כל חמישה כפול 10 בחזקת 6 תאי דנדריטיים, ובצעו פיפטאזה (pipette up and down) כדי להשעותם מחדש. לאחר מכן, חלקו את התאים הדנדריטיים המושעים לשתי מבחנות בנפחים שווים.אל מבחנה אחת, הוסף 10 micrograms per milliliter OT-II OVAp. השאר את המבחנה השנייה ללא טיפול. היא תשמש כביקורת שלילית להעמסת אנטיגן.דגרו את המבחנות למשך שעה אחת לפחות כדי להטעין את מולקולות ה-MHC II של התאים הדנדריטיים בפפטיד OVA. במקביל, הכינו את ה-Salmonella enteritidis לזיהום על ידי שטיפתם בתמיסת PBS שלוש פעמים. ביצעו סנטריפוגה בין שטיפה לשטיפה ב-1800 x g כדי להסיר את מצע ה-LB וכל רעלן שהופרש.לאחר מכן, השהו מחדש את החיידקים ב-RPMI. בעקבות הדגירה, הדביקו כל מבחנה של תאים דנדריטיים בריבוי הדבקה, או MOI, של 10, ולאחר מכן דגרו את התאים למשך שעה אחת. לאחר הדבקת התאים, שטפו אותם שלוש פעמים ב-PBS, ולאחר מכן פעם אחת ב-RPMI 10%FBS.בצעו סבב צנטריפוגה בין השטיפות ב-450 x g כדי לשטוף את מרבית החיידקים החוץ-תאיים ב-OVAp המסיס. לאחר הסבב האחרון של הצנטריפוגה, השעיו את התאים ב-RPMI 10%FBS בריכוז של 20 times 10 to the sixth תאים למיליליטר. לצלחת תרבית של 24 בארות, הוסיפו שני מיליון תאי CD4+T בנפח של 0.5 מיליליטר לכל אחת מחמש הבארות.בשלב הבא, כדי לשלוט במגע פיזי, מקמו מחסומי trans-well מפוליקרבונט בעלי גודל נקבוביות של 3 µm בבאר השלישית והרביעית. לבאר הראשונה, הוסיפו 0.1 ml של תאי דנדריטים מעומסים שנדבקו. לבאר השנייה, הוסיפו 0.1 ml של תאי דנדריטים לא-מעומסים שנדבקו.הוסף 0.1 milliliters של תאי דנדריטיים מוטענים שהודבקו לבאר אחת, ו-0.1 milliliters של תאי דנדריטיים לא מוטענים שהודבקו לבאר השנייה. לבסוף, כביקורת שלילית, הדבק ישירות את הבאר החמישית של תאי CD4+T ב-MOI של 10. לאחר מכן, השלם את הנפח הכולל של הבאר ל-0.6 milliliters באמצעות RPMI.דגרו את הצלחת למשך 30 דקות כדי לאפשר היווצרות של סינפסים חיסוניים. לאחר הדגירה, הוסיפו לכל באר 100 micrograms של Gentamicin לכל milliliter של מצע, ודגרו למשך שעה אחת. Gentamicin הוא אנטיביוטיקה מקבוצת האמינוגליקוזידים שאינה מסוגלת לחדור לתאים איקריוטים.לפיכך, בשלב זה, האמינוגליקוזיד יהרוג חיידקים חוץ-תאיים אך לא חיידקים תוך-תאיים. לאחר הדגירה, אספו את התאים שאינם נצמדים לשפופרות של 15 milliliter, ותלהו אותם מחדש ב-10 milliliters של בופר PBS BSA EDTA. השליכו את פלטת התרבית מפלסטיק שאליה נותרים רוב התאים הדנדריטיים צמודים.בשלב הבא, ערבבו את המבחנות בעזרת וורטקס בעדינות כדי להבטיח פירוק של תגשישי התאים. צנטריפוגו את המבחנות ב-600 x g. לאחר מכן, שאבו מכל מבחנה 500 µL מהעליון של התאים והעבירו אותו בעזרת פיפט למבחנה חדשה.דגימה זו תשמש כביקורת כדי להראות שהטיפול ב-Gentamicin היה יעיל. יש להניח את כל הדגימות על קרח. בשלב זה, ישנן שש מבחנות: ארבע מבחנות של דגימות לבדיקה ושתי ביקורות.למרות שרוב התאים הדנדריטיים נשלחו יחד עם הפלטה, הדגימות שלא הופרדו על ידי מחסומי ה-trans-well עשויות עדיין להכיל חלק מהם. כדי להפחית זיהום, השתמש בבידוד תאים מגנטי או במיון תאים כדי לבודד מחדש את תאי ה-CD4+T מהדגימות שלא הופרדו על ידי מחסומי ה-trans-well. הבידוד הסופי צריך להכיל פחות מ-2% תאים דנדריטיים.שמרו את שאר הדגימות על קרח. לאחר טהרת תאי ה-CD4+T, יש להכין את הדגימות להדבקה במעמדי חיידקים. ניתן לבצע זאת באמצעות ספירת מושבות או באמצעות ציטומטריה עם זרימה.כאן נראה לכם כיצד לבצע ספירת מושבות. שטפו את תאי ה-CD4+T שעברו טרנס-אינפקציה פעמיים ב-PBS. סבבו בצנטריפוגה במהירות של 600 x g בין השטיפות.לאחר מכן ספרו את התאים והשעיקו אותם ב-PBS בריכוז של 2×10⁶ תאים למילליליטר. ל-500 µL של תאי T, הוסיפו 500 µL של 0.1% Triton X-100 כדי לבצע ליזה של התאים. פעולה זו משחררת את החיידקים התוך-תאיים מתאי ה-T.עבור כל דגימה של תאים שעברו ליזיס, הכין שלושה דילולות סדרתיות. לאחר מכן, חלק את פלטת ה-LB agar לארבעה רבעים ופרוס 50 µL מכל דילול, כולל התרחופף שאינו מדולל, על כל חלק בפלטה. על פלטת LB agar נפרדת, פרוס את העליון (supernatant) של התאים המאוחסנים כביקורת ליעילות ה-Gentamicin.לאחר מכן, בצלחת אחרת, פזרו את תאי ה-T שהודבקו באופן ישיר כבקרת נוספת. דגרו למשך לילה. למחרת, ספרו את המושבות בכל חלק של הצלחת וחשבו את מספר היחידות יוצרות המושבות (colony-forming units) עבור כל דגימה.במקרה של זיהום ברמה נמוכה של תאי דנדריטיים, המוגדר כפחות מ-2%, יש להפחית את יחידות יוצרות המושבות (colony-forming units) המתאימות לזיהום נמוך בתאים דנדריטיים. התעתוק (transinfection) של תאי T בוצע באמצעות Salmonella enteritidis ונמדד על ידי בדיקת הישרדות גנטמיצין (Gentamicin survival assay) כפי שמתואר בסרטון זה. כאשר תאי T שהודבקו ישירות נזרעו בצלחות, כפי שמוצג בצד שמאל, לא נצפתה צמיחה של מושבות, מה שמעיד על כך שתאי T עמידים להדבקות חיידקיות ישירות.כאשר תרבית על מניסויי טרנס-אינפקציה נזרעה על מצע, כפי שמוצג מימין, לא נצפו מושבות, מה שמעיד על כך שה-Gentamicin פעל כראוי. כאן מוצגים תוצאות מניסויי טרנס-אינפקציה שבוצעו בנוכחות מחסומי trans-well. רק שלוש מושבות נצפו בתמיסה הבלתי מהולה הן בדגימות הטעונות ב-OVA והן בדגימות שלא נטענו.לעומת זאת, נראות מושבות רבות כאשר ישנו מגע ישיר של תאי T עם תאים דנדריטיים נגועים. יתרה מכך, כאשר תאים דנדריטיים הטעונים ב-OVAp הודגרו עם תאי T, ספיגת החיידקים גברה בכשבעה פעמים. יחד, נתונים אלו מעידים כי מגע ישיר של תאים דנדריטיים נגועים עם תאי T מקל על ספיגת החיידקים, וכי התהליך של התעדה חוצת-תאים (transinfection) מוגבר במהלך זיהוי האנטיגן.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן כימות הטרנס-אינפקציה (transinfection) באמצעות תאי T ימיים. היתרון של כימות טרנס-אינפקציה באמצעות הישרדות גנטמיצין הוא הרגישות הגבוהה שלו. אנו מסוגלים לזהות חיידק זיהומי בודד.חשוב לזכור ששלב הטיהור בפרוצדורה זו הוא קריטי. רמת הניקיון חייבת להיות גבוהה מאוד אם ייעשה שימוש בספירת מושבות כדי לקבוע את קצב הטרנס-אינפקציה (transinfection). כמותיות באמצעות ציטומטריית זרימה אינן סובלות ממגבלה זו, כיוון שניתן להבחין בקלות בין תאי דנדריטיים לתאי T, אך המגבלה היא שהחיידקים המבטאים GFP חייבים להיות בהירים מספיק כדי לזהות את התאים המודבקים על רקע הפלואורסצנציה החיצונית.אין לשכוח כי עבודה עם פתוגנים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש להקפיד תמיד על נקיטת אמצעי הבטיחות המתאימים בעת ביצוע הליך זה.

t-cells-capture-bacteria-by-transinfection-from-dendritic-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

המידור של חלבונים גם בתוך קרום פלזמה או אל מקומות תאיים הוא אחד מנגנון רגולטורי כי יכול מאוד להשפיע על התוצאות איתות, ולכן, כדי להבין איתות חשוב ללמוד את התנהגות במרחב ובזמן של חלבונים המעורבים. המתואר כאן מערכת מבוססת מיקרוסקופיה TIRF ללמוד התמרה האות בתאי T, אבל הוא החלים רחב.

טכניקה מיקרוסקופית TIRF הדמיה בזמן אמת סימולטני של TCR וחלבונים הקשורים אליו לשידור אותות

מקור: Cruz-Adalia, A., et al. תאי T לוכדים חיידקים על ידי זיהום מתאים דנדריטיים. J. Vis. Exp. (2016).סרטון זה מדגים טרנס-זיהום חיידקי באמצעות אינטראקציות ספציפיות לאנטיגן בין תאי T לתאים דנדריטיים. תאים דנדריטיים נגועים בחיידקים המציגים פפטיד אובאלבומין מודגרים עם תאי T, ישירות או מופרדים על ידי ממברנה. מגע ישיר מאפשר היווצרות סינפסות אימונולוגיות, המאפשרת העברת חיידקים, בעוד הממברנה מונעת אינטראקציה. לאחר מכן נעשה טיפול בגנטמיצין כדי לחסל חיידקים חוץ-תאיים.

זיהום חיידקי במבחנה של תאי T באמצעות היווצרות סינפסה אימונולוגית

סרטון זה מדגים שיטה להמרת תאים דנדריטיים (DCs) ל-DCs סובלרוגניים (TolDCs) באמצעות סוכן תרופתי אימונומודולטורי. המרה זו מאושרת על ידי הערכת הפונקציה TolDC באמצעות ההשפעה החיסונית שלהם על תאי CD4+ T.

השפעת סוכן פרמקולוגי אימונומודולטורי על האינטראקציה בין תאים דנדריטיים ותאי T CD4+

כאן, אנו משתמשים התמרה retroviral וtransfection concatemeric כדי ליצור שורת תאים שיכולים לבטא את הרכיבים של וקטור lentiviral (LV) בהיעדר טטרציקלין. זה LV מקודד GFP וPseudotyped עם גליקופרוטאין, SVGmu, שהוא ספציפי לקולטן על תאים דנדריטים.

שורת תאי טטרציקלין מוסדר מייצרת וקטורי lentiviral גבוה כייל שמתמקדים תאי דנדריטים

בניגוד לחלקיקים HIV-1 ללא סלולריים, תאי CD4 + T נגוע הם חשו ביעילות על ידי תאים דנדריטים plasmacytoid (PDC). כתב יד זה מתאר שיטה שבה תאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) או pDCs המבודד הם שיתוף תרבותיים עם HIV-1 תאי T נגועים כדי להעריך חישה מולדת על ידי pDCs כפי שהוערכו על ידי שחרורו של הסוג-אני IFN.

הערכת חישה המולדת של CD4 הנגוע ב- HIV-1<sup&gt; +</sup&gt; T תאים על ידי תאים דנדריטים Plasmacytoid שימוש<em&gt; Ex vivo</em&gt; עמית תרבות מערכת.

כאן אנו מתארים מבחן כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם (HPLC-MS/MS) בעל ביצועים גבוהים לכימות הטקרולימוס המדכא את מערכת החיסון בכתמי דם מיובשים באמצעות שלב ידני פשוט של משקעי חלבון וחילוץ עמודות מקוון.

כימות של Tacrolimus לדיכוי מערכת החיסון בכתמי דם יבש באמצעות LC-MS / MS

בפרוטוקול זה מתואר מודל קוליטיס אימוץ של תאי T ספציפיים למיקרוביוטה במעיים. תאי CD4+ T מבודדים מעכברים מהונדסים CBir1 TCR. אלה הם ספציפיים עבור מיקרוביוטה המעי immunodominant אנטיגן CBir1 flagellin, אשר מועבר לתוך המטופל Rag1-/- עכברים, המוביל דלקת מעיים.

אינדוקציה של דלקת מעיים על ידי העברה מאמצת של CBir1 TCR תאי CD4 + TCR מהונדסים לעכברים חיסוניים

אנו מתארים הליך להערכת היכולת של חומרים פרמקולוגיים לייצר תאים דנדריטיים טולרוגניים מתאים דנדריטיים נאיביים שמקורם במונוציטים במבחנה ולאמת את עוצמתם על ידי יצירת תאי T רגולטוריים אוטולוגיים.

שיטה פשוטה ויעילה לבדיקת חומרים אימונומודולטוריים ליצירת תאים דנדריטיים טולרוגניים ממונוציטים CD14+ אנושיים

פרוטוקול זה מתאר תכנות מחדש in vivo של תאי סרטן עכבר לתאים דמויי דנדריטי מסוג 1 בתוך מיקרו-סביבת הגידול באמצעות ביטוי מאולץ של גורמי השעתוק PU.1, IRF8 ו-BATF3.

תכנות מחדש של תאי גידול לתאים דמויי תאים דנדריטיים קונבנציונליים מסוג 1

מאמר זה מתאר את התהליך להכנת גרסה מתויגת-fluorescently של bacteriophage מבדה, זיהום...

בעקבות Cell-גורל ב<em&gt; א coli</em&gt; לאחר זיהום על ידי phage מבדה

חקור מנגנון לכידת חיידקים על ידי תאי T CD4+ מתאים דנדריטים נגועים במודל עכברים. השיטה מודדת טרנס-הדבקה חיידקית ומעריכה את יכולת ההרג של תאי T.

תאי T ללכוד חיידקים על ידי Transinfection מתאים דנדריטים

גלה סרטונים נוספים