Name: דגם שבץ טרומבוטיים בהתבסס על היפוקסיה-איסכמיה מוחית חולפת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: למדו כיצד ליצור מודל שבץ טרומבוטי בעכברים באמצעות היפוקסיה-איסכמיה מוחית חולפת. השיטה מאפשרת הערכת יעילות טיפול tPA ומחקר מנגנוני שבץ וטיפולים תרופתיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי NS074559 המענקים של ה-NIH (ל-C. K.). אנו מודים לכל משתפי הפעולה שתרמו למאמרי המחקר שלנו שעליהם מבוסס דוח המתודולוגיה הנוכחי.

פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) מאוניברסיטת אמורי ועוקב המכונים הלאומי לבריאות קו מנחה לטיפול ושימוש בחי מעבדה. 1. התקנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המיטה כירורגית על כרית החימום מחוברת עם משאבת חום על 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 15 דקות לפני הניתוח. מניחים גליל צוואר באמצעות החבית של 3 מיליליטר מזרק על מיטת הניתוחים. הכן את גז ההרדמה עם isoflurane 2% באוויר רפואי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מלקחיים autoclaved, מספריים, מחזיקי מחט מיקרו, hemostat, צמר גפן ותפרים. הכן דבק רקמות ומשחת עיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר את מערכת היפוקסיה ובקרי טמפרטורה עם מנורת חימום ובדיקה רקטלית. הכן גז היפוקסיה עם isoflurane 2% ב- 7.5% O 2 מאוזנת 92.5% N 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שעה אחת לפני הניתוח, עכברים analgesized על ידי הזרקה תת עורית של שחרור איטי Meloxicam (4.0 מ&quot;ג / קילוגרם). </li></ol> &lt;class = &quot;jove_title&quot; p&gt; 2. חלוף מוחין היפוקסיה-איסכמיה (איור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי C57BL זכר 10-13 שבוע ישן / 6 עכברים במשקל 22 עד 30 גר &#39;בחדר האינדוקציה ההרדמה עם 3% isoflurane עד שהחיה אינה מגיבה ללחיצת רגל, ולאחר מכן להסיר את השיער על צוואר נכון באמצעות מכונת גילוח חשמלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים עכברים על המיטה כירורגית מחוברת עם 2% isoflurane באוויר רפואי בקצב זרימה של 2 ליטר / דקה. forelimbs המאובטח נמתח לאורך גליל צוואר בצדדים באמצעות קלטת רפואית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את האתר כירורגית לחתך בבטאדין ואחריו אלכוהול ולאחר מכן צמר גפן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, לעשות חתך 0.5 סנטימטר ימני של צוואר הרחם באמצעות מלקחיים ישרים ומספרי מיקרו כ -0.2 סנטימטר לרוחב מעור קו האמצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זוג מלקחיים משוננים בסדר לפרק fascia ורקמה לחשוף את עורק התרדמה המשותף הימני (RCCA). להפריד את RCCA זהירות מעצב מחנק באמצעות זוג מלקחיים חלקים בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חי לקשור את שני חתוך 5-0 תפר משי (releasable) על RCCA, ולאחר מכן לתפור את העור באמצעות תפר 4-0 ניילון monofilament (איור 1 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל משחה עין על שני העיניים כדי למנוע יובש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות להעביר את העכברים למערכת היפוקסיה ולשים האף ופה במסכת פנים עם 2% isoflurane ב7.5% O 2 בקצב זרימה של 0.5-1 ליטר / דקה למשך 30 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך היפוקסיה, להשתמש בקרי טמפרטורה עם מנורות חימום לשלוט על הטמפרטורה רקטלית ב37.5 ± 0.5 מעלות צלזיוס. צג קצב הנשימה ב80-120 נשימות / דקה. התחזוקה של טמפרטורת הגוף מעל 37 מעלות צלזיוס במהלך היפוקסיה חשובה ליצור אוטם מוחי עולה בקנה אחד. קצב נשימה נמוך בדרך כלל קורה אחרי היפוקסיה 20 דקות. הסר את מסכת הפנים ולאפשר אספקת אוויר נורמלית אם קצב הנשימה יורד מתחת לגיל 40. זה לוקח 1-2 דקות ולא נחשב לזמן היפוקסיה 30 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר היפוקסיה, להעבירעכברים למיטת ניתוח ולשחרר את שני תפרים מRCCA. לסגור את הפצע באמצעות דבק רקמות, ולאחר מכן להחזיר עכברים לכלוב. תכלול בעלי החיים אם שניהם שני קשרים חיים משתחררים באופן בלתי צפוי לאחר היפוקסיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג העכברים למשך 5-10 דקות להתאושש מהיפוקסיה והרדמה. הנח את המזון הרטוב בכלוב ולהחזיר אותו למתקן טיפול בבעלי חיים. הערה: בעלי חיים מראים מתון עד חמורה התנהגות מלקחיים ב 24 שעות לאחר תי מתואמים עם עבירת המוח. רוב בעלי החיים עם תסמיני התקף למות לפני נקודת הזמן 24 שעות לאחר תי. </li></ol> הדמיה ניגודיות 3. לייזר רבב הערה: למרות שזה לא הליך חיוני של מודל תי, מערכת הדמיה ניגוד דו ממדי רבב לייזר 16 יכולה לשמש כדי לאפיין את השינויים בזרימת דם במוח (CBF) במהלך או לאחר היפוקסיה-איסכמיה החולפת. לתעד את השינויים של CBF תחת תי, שיא מייד לאחר stEP 2.6. לחלופין, כדי להשוות התאוששות CBF אחרי עלבון תי, ניתן לבצע הליכים אלה הבאים הצעד 2.10. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח עכבר הרדים במצב שכיבה ולבצע חתך קו האמצע 1 ס&quot;מ ארוך על הקרקפת עם הגולגולת החשופה אבל לא נפתחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג CBF בשני אונות המוח תחת תרמי זרימת דם על פי הפרוטוקול של היצרן ולהתחיל להקליט את זרימת דם במוח באופן מיידי לאחר ניתוח CCAO (שלב 2.6). המשך במשך 50 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצג תמונת CBF עם יחידות שרירותיות בלוח 16 צבעים ולנתח בזמן אמת האזורים הנבחרים באמצעות תוכנת MoorFLPI הבאה הוראות היצרן (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקלטת תמונת CBF, לסגור את הקרקפת עם דבק רקמות ולהחזיר את בעלי החיים לכלוב. </li></ol> מנהל 4. tPA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק בעלי חיים בוריד הזנב עם הממס או 10 מ&quot;ג / קילוגרם רקומביננטי tPA (220-300 ו# 956; L של 1 מ&quot;ג / מ &#39;tPA) ברמה של 0.5, 1, או 4 שעות לאחר tCCAo תוספת היפוקסיה (איור 4). </li></ol> איתור נזק 5. מוח עם מספר אפשרויות שונות הערה: כדי לאסוף דגימות מוח, להרדים את העכברים בבית 1, 4 או 24 שעות לאחר תי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיטה לבצע כימות של נפח אוטם על ידי in vivo כלוריד 2,3,5-Triphenyltetrazolium (TTC) בשעה 24 שעות לאחר עלבון תי כמתואר קודם. 17 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Intraperitoneally להזריק חיות עם 1.4 M פתרון מניטול (~ משקל גוף 0.1 מיליליטר / g) 30 דקות לפני זלוף transcardial. עכברי Perfuse Transcardial עם PBS ואחריו 10 מיליליטר של TTC 2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח של בעלי חיים עם מכשירי ניתוח לאחר 10 דקות ומניח לparaformaldehyde 4% לקיבעון הלילה וסעיף לעובי 1 מ&quot;מ עם vibratome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד סדרה של ארבע שקופיות מוח מחולקות על ידי מיקרוסקופ וקוואנט הדיגיטלייםify נפח האוטם כיחס בין שטח אוטם השריר (אזור לבן בצד ימין) לאזור של חצי הכדור ניזוק, הנגדי באמצעות תוכנת ImageJ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לבצע היווצרות פקקת ידי immunofluorescence בשעה 1 לאחר עלבון תי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את המוח הקבוע במתחם OCT וסעיף המוח בגיל 12 מיקרומטר עובי באמצעות cryostat. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שקופיות המוח עם נוגדן ארנב נגד פיברינוגן (1: 100) הבא על ידי הצבע עז נגד הארנב Alexa Fluro 488 (1: 200) כדי לבחון את הקרינה במיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לבצע חסימת כלי על ידי הזרקה לוריד זנב של 100 μl 2% צבע הכחול אוונס ב 4 שעות לאחר עלבון תי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברים ובמהירות לחתוך את הראש כדי להסיר את המוח לתוך 4 paraformaldehyde% לאחר הזרקה הכחולה אוונס. הערה: זה לוקח 5-10 דקות למחזור כחול אוונס עם צבע כחול של שני קדמיים ואחורי גפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sectiעל מוח הקבוע ב 100 עובי מיקרומטר באמצעות microtome הזזה ולבחון את הקרינה באמצעות מסנן פליטה 680 ננומטר במיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Broderick, J. P., Hacke, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+acute+ischemic+stroke%3A+Part+I%3A+recanalization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Treatment of acute ischemic stroke: Part I: recanalization strategies.</a> Circulation. 106 (12), 1563-1569 (2002).</li>
<li>Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+basis+of+translational+stroke+research%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological basis of translational stroke research.</a> Folia Neuropathol. 47 (3), 213-227 (2009).</li>
<li>Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+pathophysiologies+of+focal+brain+ischemia%3A+implications+for+translational+stroke+research%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 32 (7), 1310-1316 (2012).</li>
<li>Macrae, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+stroke+research--advantages+and+disadvantages+of+the+most+common+rodent+models+of+focal+ischaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Preclinical stroke research--advantages and disadvantages of the most common rodent models of focal ischaemia.</a> Br. J. Pharmacol. 164 (4), 1062-1078 (2011).</li>
<li>Niessen, F., Hilger, T., Hoehn, M., Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+clot+preparation+determine+outcome+of+recombinant+tissue+plasminogen+activator+treatment+in+experimental+thromboembolic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Differences in clot preparation determine outcome of recombinant tissue plasminogen activator treatment in experimental thromboembolic stroke.</a> Stroke. 34 (8), 2019-2024 (2003).</li>
<li>Orset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+in+situ+thromboembolic+stroke+and+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion.</a> Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).</li>
<li>Watson, B. D., Dietrich, W. D., Prado, R., Ginsberg, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argon+laser-induced+arterial+photothrombosis.+Characterization+and+possible+application+to+therapy+of+arteriovenous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Argon laser-induced arterial photothrombosis. Characterization and possible application to therapy of arteriovenous malformations.</a> J. Neurosurgery. 66 (5), 748-754 (1987).</li>
<li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+of+combined+tPA-edaravone+therapy+in+experimental+thrombotic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Synergy of combined tPA-edaravone therapy in experimental thrombotic stroke.</a> PLoS One. 9, e98807(2014).</li>
<li>Levine, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoxic-ischemic+encephalopathy+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Anoxic-ischemic encephalopathy in rats.</a> Am. J. Pathol. 36, 1-17 (1960).</li>
<li>Rice, J. E. 3rd, Vannucci, R. C., Brierley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+immaturity+on+hypoxic-ischemic+brain+damage+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+Neurol%22%5BJournal%5D)">The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat.</a> Annals Neurol. 9 (2), 131-141 (1981).</li>
<li>Vannucci, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+stroke+in+the+female+diabetic%2C+db%2Fdb%2C+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 21 (2), 52-60 (2001).</li>
<li>Adhami, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+ischemia-hypoxia+induces+intravascular+coagulation+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cerebral ischemia-hypoxia induces intravascular coagulation and autophagy.</a> Am. J. Pathol. 169 (2), 566-583 (2006).</li>
<li>Shereen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+diffusion+tensor+imaging+and+neuropathological+correlation+in+a+murine+model+of+hypoxia-ischemia-induced+thrombotic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Ex vivo diffusion tensor imaging and neuropathological correlation in a murine model of hypoxia-ischemia-induced thrombotic stroke.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31 (4), 1155-1169 (2011).</li>
<li>Michaud, J. P., Pimentel-Coelho, P. M., Tremblay, Y., Rivest, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+Ly6C+low+monocytes+after+cerebral+hypoxia-ischemia+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">The impact of Ly6C low monocytes after cerebral hypoxia-ischemia in adult mice.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 34 (7), e1-e9 (2014).</li>
<li>Zoppo, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virchow%27s+triad%3A+the+vascular+basis+of+cerebral+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Neurol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Virchow's triad: the vascular basis of cerebral injury.</a> Rev. Neurol. Dis. 5, 12-21 (2008).</li>
<li>Dunn, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+speckle+contrast+imaging+of+cerebral+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Laser speckle contrast imaging of cerebral blood flow.</a> Annals Biomed. Eng. 40 (2), 367-377 (2012).</li>
<li>Sun, Y. Y., Yang, D., Kuan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mannitol-facilitated+perfusion+staining+with+2%2C3%2C5-triphenyltetrazolium+chloride+%28TTC%29+for+detection+of+experimental+cerebral+infarction+and+biochemical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Mannitol-facilitated perfusion staining with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) for detection of experimental cerebral infarction and biochemical analysis.</a> J. Neurosci. Methods. 203 (1), 122-129 (2012).</li>
<li>Lozano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+regional+mortality+from+235+causes+of+death+for+20+age+groups+in+1990+and+2010%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2010).</li>
<li>Murray, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disability-adjusted+life+years+%28DALYs%29+for+291+diseases+and+injuries+in+21+regions%2C+1990-2010%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> Lancet. 380 (9859), 2197-2223 (2012).</li>
<li>Dirnagl, U., Macleod, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroke+research+at+a+road+block%3A+the+streets+from+adversity+should+be+paved+with+meta-analysis+and+good+laboratory+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Stroke research at a road block: the streets from adversity should be paved with meta-analysis and good laboratory practice.</a> Br. J. Pharm. 157 (7), 1154-1156 (2009).</li>
<li>Dirnagl, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+concerted+appeal+for+international+cooperation+in+preclinical+stroke+research%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research.</a> Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).</li>
<li>Khatri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revascularization+end+points+in+stroke+interventional+trials%3A+recanalization+versus+reperfusion+in+IMS-I%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Revascularization end points in stroke interventional trials: recanalization versus reperfusion in IMS-I.</a> Stroke. 36 (11), 2400-2403 (2005).</li>
<li>Rosenberg, R. D., Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular-bed--specific+hemostasis+and+hypercoagulable+states%5BTitle%5D)+AND+%22New+Eng.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Vascular-bed--specific hemostasis and hypercoagulable states.</a> New Eng. J. Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).</li>
<li>Majid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+vulnerability+to+permanent+focal+cerebral+ischemia+among+3+common+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains.</a> Stroke. 31 (11), 2707-2714 (2000).</li>
</ol>

שבץ הוא בעיה בריאותית משמעותית של גידול משמעות לכל חברה עם אוכלוסייה מזדקנת. בעולם, שבץ הוא הגורם מוביל השני של מוות עם 5.9 מיליון אירועים משוערים קטלניים בשנת 2010, שווה ערך ל 11.1% מכל מקרי המוות 18. שבץ הוא גם הגורם מוביל השלישי של שנות חיים מותאמות לנכות (DALYs) איבד ברחבי העולם בשינה 2010, עולה מהעמדה החמישית בשינה 1990 19. נתונים אפידמיולוגיים אלה מדגישים את הצורך של טיפולים יעילים יותר של שבץ חריף (איסכמי). עם זאת, למרות מחקר אינטנסיבי בטיפול נוירו פרה...

Thrombolysis וrecanalization הוא הטיפול היעיל ביותר של שבץ איסכמי חריף בפרקטיקה קלינית 1. ובכל זאת, רוב המחקר פרה-קליני neuroprotection בוצע במודל חולף מכונאי חסימה (חסימת intraluminal תפר האמצע מוחית עורק) שמייצר התאוששות מהירה של זרימת דם במוח על הסרת החסימה של כלי הדם ומראה לא מעט על מנת יתרונות על ידי thrombolysis tPA. זה כבר הציע כי הבחירה המפוקפקת של דגמי שבץ תרמה, לפחות בהחלק, לקושי בתרגום טיפול נוירו לחולי 2,3. לפיכך, יש שיחת הגדלת להעסקת דגמי שבץ תרומבואמבוליים tPA מגיבים במחקר פרה-קליני, אך מודלים כאלה צריכים גם בעיות טכניות (ראה דיון) 4-7. כאן אנו מתארים מודל שבץ טרומבוטיים חדש המבוסס על עלבון חד צדדי חולף חוסר חמצן-איסכמי (תי) והתגובות שלה לטיפול tPA לוריד 8. מודל שבץ תי פותח על בסיס הליך לוין (קשירת קבע של עורק תרדמה משותפת חד-צדדי ואחרי חשיפה להיפוקסיה החולפת בתא) שהומצא לניסויים בחולדות מבוגרות בשנת 1960 9. הליך לוין המקורי דהוי לתוך החושך כי זה רק מיוצר נזק מוחי משתנה, אבל באותו העלבון שנגרם נוירופתולוגיה עקבית בגורי מכרסמים כאשר הוא מחדש הוצג על ידי רוברט ואנוצ&#39;י ועמיתיו כמודל של אנצפלופתיה חוסר חמצן-איסכמי בילוד (hie) בשינה 1981 10. בשנים האחרונות, כמה חוקרים מחדש מותאמים מודל לוין-אנוצ&#39;י לעכברים בוגרים על ידי התאמת הטמפרטורה בתא חוסר חמצן 11. זה מתקבל על הדעת שהנגעים במוח עולים בקנה אחד בהליך לוין המקורי יכולים לנבוע מתנודות טמפרטורות גוף של מכרסמים מבוגרים בחדר חוסר חמצן. כדי לבדוק השערה זו, שינינו את הליך לוין ידי מתן גז חוסר חמצןדרך facemask, תוך שמירה על טמפרטורת הליבה של מכרסמים על 37 מעלות צלזיוס על השולחן כירורגית 12. כצפוי, בקרת טמפרטורת גוף מחמיר גדלה מאוד את שחזור של פתולוגיה המוח הנגרם על-HI. עלבון HI גם מפעיל קרישה, autophagy, ואפורה ולבן-עניין פציעה 13. גם חוקרים אחרים השתמשו במודל HI לחקור תגובות דלקתיות פעימות הודעה 14. תכונה ייחודית של מודל שבץ HI היא שזה כדלקמן השלישייה של Virchow של היווצרות קריש דם, כוללים הקיפאון של זרימת דם, פגיעת אנדותל (למשל עקב סטרס חמצוני המושרה HI), וhypercoagulability (הפעלת טסיות דם הנגרם על-HI) (בשיתוף פעולה הדוק איור 1 א) 15. ככזה, מודל HI יכול ללכוד כמה מנגנוני pathophysiological רלוונטיים לשבץ איסכמי בעולם האמיתי. עם הרעיון הזה בראש, אנחנו נוספים מעודנים מודל HI עם קשירה הפיכה של האו&quot;םעורק תרדמה משותף ilateral (ולכן כדי ליצור עלבון HI חולף), ונבדק תגובותיה לthrombolysis tPA עם או בלי Edaravone. Edaravone היא נבלות רדיקלים חופשיות שכבר אושרו ביפן לטיפול בשבץ איסכמי בתוך 24 שעות מהופעת 9. הניסויים שלנו הראו כי HI כקצר כ30 דקות חולפות מפעיל אוטם טרומבוטיים, וכי טיפול tPA-Edaravone שילוב מקנה 8 יתרונות סינרגטיים. כאן אנו מתארים ניתוחים מפורטים ושיקולים מתודולוגיים של מודל תי, אשר ניתן להשתמש בי כדי לייעל טיפולי reperfusion של שבץ איסכמי חריף.

<table><tbody><tr><td>עכברים זכרים בוגרים</td><td>צ'ארלס ריבר</td><td>C57BL/6&nbsp;</td><td>גיל 10-13 שבועות (22-30 גרם)</td></tr><tr><td>מערכת הרדמה לבעלי חיים במעבדה ניידת</td><td>VetEquip</td><td></td><td>901807 הרדמה</td></tr><tr><td>מיכל אוויר רפואי (דחוס) Airgas</td><td></td><td>UN1002</td><td>הרדמה</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Healthcare</td><td>NDC 66794-013-25</td><td>הרדמה</td></tr><tr><td>מעבדה מרובת תחנות מערכת הרדמה לבעלי חיים מערכת היפוקסיה</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>V703501 כירורגית7.5% O2 מאוזן על ידי 92.5% N2 מיכל</td><td>Airgas</td><td>UN1956</td><td>מערכת היפוקסיה</td></tr><tr><td>בקר טמפרטורה עם מנורת חימום&nbsp;</td><td>קול פארמר&nbsp;</td><td>בקרי טמפרטורה</td> <td>EW-89000-10</td></tr><tr><td>בדיקה רקטלית</td><td>קול פארמר&nbsp;</td><td>בקרי טמפרטורה</td> <td>NCI-00141PG</td></tr><tr><td>ניתוח מיקרוסקופ&nbsp;</td><td>אולימפוס&nbsp;</td><td>מערך כירורגי</td> <td>SZ40</td></tr><tr><td>משאבת חום עם כרית חימום</td><td>Gaymar&nbsp;</td><td>מערך כירורגי</td> <td>TP700</td></tr><tr><td>מלקחיים מעוקלים עדינים (משוננים)</td> <td>FST</td><td>11370-31</td><td>מכשיר כירורגי</td></tr><tr><td>מלקחיים מעוקלים עדינים (חלקים)</td> <td>FST</td><td>11373-12</td><td>מכשיר כירורגי</td></tr><tr><td>מספריים מיקרו</td><td>FST</td><td>15000-03</td><td>מכשיר כירורגי</td></tr><tr><td>מחזיקי מחט מיקרו</td><td>FST</td><td>12060-01</td><td>מכשיר כירורגי</td></tr><tr><td>Halsted-Mosquito המוסטטים</td><td>FST</td><td>13008-12</td><td>מכשיר כירורגי</td></tr><tr><td>5-0 תפר משי&nbsp;</td><td>מכשירי הרווארד</td><td>624143</td><td>ציוד כירורגי</td></tr><tr><td>4-0 תפר מונופילמנט ניילון</td><td>LOOK</td><td>766B</td><td>ציוד כירורגי</td></tr><tr><td>דבק רקמות</td><td>מעבדות אבוט</td><td>NC9855218</td><td>ציוד כירורגי</td></tr><tr><td>משחה וטרינרית Puralube</td><td>פישר</td><td>NC0138063&nbsp;</td><td>מניעת יובש בעיניים&nbsp;</td></tr><tr><td>צילום זרימת דם MoorFLPI-2</td> מקור לייזר <td>Moor</td><td>780-nm</td><td>הדמיית ניגודיות כתמי לייזר</td></tr><tr><td>מניטול</td><td>סיגמא</td><td>M4125</td><td>in vivo TTC</td></tr><tr><td>2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T8877</td><td>in vivo TTC</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Stoelting</td><td>51425</td><td>קטע מוח עבור in vivo TTC&nbsp;</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיגיטלי</td><td>Dino-Lite</td><td>AM2111</td><td>הדמיית מוח שלם</td></tr><tr><td>תרכובת O.C.T</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>עז אנטי-ארנב Alexa Fluro 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>אימונוהיסטוכימיה</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Vibratome</td><td>ultrapro 5000</td><td>קטע מוח עבור IHC</td></tr><tr><td>אוונס כחול</td><td>Sigma</td><td>E2129</td><td>זיהוי כלי דם מיקרוטום</td></tr><tr><td>מיקרוטום</td><td>אלקטרונים מדעי</td><td>5000</td><td>מדור מוח להיסטולוגיה</td></tr><tr><td>אברטין (2, 2, 2-טריברומו-אתנול)</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td>המתת חסד</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>אולימפוס</td><td>DP73</td><td></td></tr><tr><td>מלוקסיקם SR</td><td>ZooPharm</td><td></td><td>NSAID משככי כאבים</td></tr></tbody></table>

דגם שבץ טרומבוטיים בהתבסס על היפוקסיה-איסכמיה מוחית חולפת

A Thrombotic Stroke Model Based On Transient Cerebral Hypoxia-ischemia

מחקר שבץ סבל עיכובים רבים בתרגום טיפולי נוירו לתוך פרקטיקה קלינית. לעומת זאת, הטיפול בעולם האמיתי (thrombolysis tPA) לעתים רחוקות מייצר יתרונות בדגמים ניסיוניים המבוסס על חסימה מכאני, אשר שולטים מחקר פרה-קליני שבץ. פיצול זה בין הספסל והמיטה מרמז על הצורך להעסיק דגמי tPA מגיבים במחקר פרה-קליני שבץ. לשם כך, מודל שבץ טרומבוטיים פשוט וtPA-reactive הוא המציא ושתואר כאן. מודל זה מורכב מחסימה הזמנית של עורק תרדמה המשותף חד-צדדי ואספקה ​​של חמצן 7.5% באמצעות מסכת פנים בעכברים בוגרים למשך 30 דקות, תוך שמירה על הטמפרטורה רקטלית של בעלי החיים ב37.5 ± 0.5 מעלות צלזיוס. למרות קשירה הפיכה של עורק תרדמה חד-צדדי או היפוקסיה כל מודחקת זרימת דם במוח רק זמני, השילוב של שניהם העלבונות שנגרם נמשך גירעונות reperfusion, הפיברין ותצהיר של טסיות דם, וinfar הגדולct בשטח המסופק עורק המוח האמצעי. חשוב לציין, הזרקה של רקומביננטי tPA ברמה של 0.5, 1, או 4 שעות שלאחר תי (10 מ&quot;ג / קילוגרם) וריד זנב סיפק הפחתה של גודל שיעור תמותה ואוטם תלוי זמן. מודל השבץ חדש זו הוא פשוט ויכול להיות טופל בכל מעבדות להשוות את תוצאות ניסוי. יתר על כן, זה גורם פקקת ללא craniectomy או החדרת תסחיפים מראש יצר. בהתחשב ביתרונות הייחודיים אלה, מודל תי הוא תוספת שימושית לרפרטואר של מחקר פרה-קליני שבץ.

הדמיה ניגוד רבב לייזר דו-ממדית (LSCI) 16 שימשה כדי להשוות את השינויים בזרימת דם במוח (CBF) על ידי חסימת 30 דקות חולפות תרדמה חד-צדדית (tCCAO), חשיפת 30 דקות להיפוקסיה (חמצן 7.5%), ו -30 דקות חד-צדדית תרדמה קשירה תחת היפוקסיה (תי). ניסוי זה גילה כי tCCAO תחת normoxia דיכא את CBF על חצי הכדור התרדמה ligated ל~ 50% מהערך הבסיסי, שהתאושש במהירות למעל 85% לאחר שחרורו של חסימת עורק התרדמה (R באיור 2 א). חשיפה להיפוקסיה המערכתית לבד מופחתת CBF לכ -75% מהערך הב...

מודלים של שבץ טרומבואמבולי הם כלים חיוניים לאופטימיזציה של הטיפול בתיעול מחדש. כאן אנו מדווחים על מודל שבץ מוחי פקקתי המבוסס על עלבון מוחי היפוקסי-איסכמי חולף (tHI), המעורר פקקת ואוטם, ומגיב בחיוב לפיברינוליזה בתיווך מפעיל פלסמינוגן רקמות (tPA) בחלון טיפולי הדומה לאלו בחולי שבץ מוחי.

Stroke research has endured many setbacks in translating neuroprotective therapies into clinical practice. In contrast, the real-world therapy (tPA ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבסס מודל פשוט לשבץ תרומבואי עם אוטם מוחי יציב ולהעריך את ההשפעות המגנות של טיפול במפעיל פלסמינוגן רקומתי, או TPA. ראשית, הודגאת השראת היפוקסיה-איסכמיה מוחית חולפת, או THI, באמצעות קשירה כפולה של העורק התהומי המשותף הימני, או RCCA, וחשיפת בעל החיים הקשור לתנאי היפוקסיה להשראת תרומבוזה. לאחר 30 דקות של תנאי היפוקסיה, שני הקשרים שעל העורק התהומי משוחררים.בשלב האחרון, מוצגים מתן הטיפול ב-TPA והערכת השפעותיו. לחלופין, ניתן לבחון הקלטה בזמן אמת של זרימת הדם המוחית, היווצרות התרומבוזה ומידת חסימת כלי הדם. פרוטוקול זה מאפשר להשרות שבץ תרומבוטי בעכברים בוגרים תוך שימוש במערכת הקרישה העצמית שלהם.אנו מעוניינים להשתמש במודל זה כדי לחקור כיצד המוח מווסת את זרימת הדם שלו תחת תנאי היפותסיה ואיסכמיה. כמו כן, נשתמש בו כדי לבחון כיצד ניתן לשפר טיפולים תרומבוטיים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן עשוי להיות קשה לשמור על טמפרטורת גוף נכונה ועל נשימה חלקה במהלך הזרקה למוח.שלבי ההשראה לפחות 15 דקות לפני תחילת הפרוצדורה. הניחו את מצע הניתוח על משטח חימום, הגדירו טמפרטורה של 37 degrees Celsius והניחו על המצע גליל לצוואר העשוי מגוף של מזרק של three milliliter. הגדירו את מערכת ההיפוקסיה להגשת 2% isof fluorine ב-7.5% oxygen מאוזן על ידי 92.5% nitrogen, וכוונו את בקרי הטמפרטורה.הנח עכבר זכר מגזע C 57 black six, בן 10 עד 13 שבועות ושוקלו 22 עד 30 גרם, על מיטת הניתוח. לאחר וידוא ההרדמה באמצעות צביטה של בהונות הרגל, מרח משחה על עיני החיה. קרב את ארבע הגפיים לאורך הצוואר, גלגל אותן והדבק אותן באמצעות סרט דביק רפואי.לאחר מכן, הסר באמצעות קרם להסרת שיער את הפרווה מעורף החיה ונקה את אזור הניתוח. כעת, העבר את שולחן הניתוח תחת מיקרוסקופ דיסקציה ובצע חתך צווארי ימני באורך 0.5 סנטימטר בעור לאורך קו האמצע. בעזרת פינצטה עדינה, הרחק את הקנה והשרירים כדי לחשוף את העורקי השותף הפנימי הימני (right common carotid artery), והנח שתי תפרים מmsilk 5-0 חתוכים מראש מתחת לעורק.הקפידו להפריד בין העורק הקרוטידי לבין עצב הוואגוס; קשרו שתי תפרים של משי 5-0 שניתן לשחרר אותם ב-RCCA. לאחר מכן, השתמשו בתפרים של מונופילמנט ניילון 4-0 כדי לסגור את העור והעבירו במהירות את העכבר למערכת ההיפוקסיה. הניחו את מסיכת הפנים על אפו ופיו של בעל החיים ואת הגשש הרקטלי כדי ששמירה על טמפרטורת גוף של 37.5 °C תובטח לאורך כל אספקת ההיפוקסיה.כוון את מנורות החום לאחר 30 דקות. העבר את העכבר בחזרה למיטת הניתוח ושחרר את שתי התפרים. לאחר מכן, סגור את הפצע באמצעות דבק רקמות והחזר את העכבר לכלובו, תוך ניטור בעל החיים עד להחלמתו המלאה.לחלופין, ניתן להשתמש בדימיון ניגודיות של נקטי לייזר (laser speckle contrast imaging) כדי לבחון את זרימת הדם המוחית במהלך ולאחר היפוקסיה-איסכמיה. מקמו את בעל החיים במנח שכיבה על הבטן. לאחר מכן, פתחו את הקרקפת באמצעות חתך קו אמצע באורך של סנטימטר אחד כדי לחשוף את הגולגולת, אך מבלי לפתוח אותה.לאחר מכן, העבירו מיד את החיה למדמה זרימת הדם והתחילו בהקלטת זרימת הדם המוחיים. צפו בתמונות זרימת הדם המוחיים בהתאם להוראות היצרן באמצעות תוכנת ה-FLPI כדי לנתח את האזורים הנבחרים בזמן אמת. כדי להעריך את השפעות הטיפול ב-TPA, מזריקו לחיות תוך-ורידית דרך וריד הזנב במועד המתאים, לאחר חסימה חד-צדדית זמנית של העורק הגרוני והיפוקסיה.לאחר מכן, כמת את נפח האינפקט באמצעות TTC in vivo כ-24 שעות לאחר האיסכמיה ההיפוקסית המוחית החולפת. למחרת, השתמש במכשיר vibram כדי להוציא חתכים בעובי של מילימטר אחד. לבסוף, השג סדרה של ארבע תמונות של חתכי מוח באמצעות מיקרוסקופיה דיגיטלית, והשתמש בתוכנת דימות מתאימה כדי לכמת את נפח האינפקט כיחס בין שטח האינפקט הלבן לבין השטח של ההמיספירה הקונטרלטרלית שאינה פגועה.עבור הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות תרומבוליזה אחרות כדי להעריך את השפעותיהן ואת הפוטנציאל הקליני שלהן. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום השבץ האיסכמי לבחון טיפול תרומבוליטי במוח.

a-thrombotic-stroke-model-based-on-transient-cerebral-hypoxia-ischemia

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

המודל עכברוש הלידה לפגיעה hypoxic-איסכמי המוח הוא מודל ומבוססת של אנצפלופתיה הילוד האנושי איסכמי היפוקסי (HIE). במאמר זה, אנו מתארים את המודל של HIE ב שלאחר הלידה גורי חולדה.

מודל hypoxic אנצפלופתיה איסכמי של איסכמיה הלידה

סרטון זה מדגים את ההליך של שכפול שבץ טרומבוטי במודל עכבר על ידי חסימת עורק הצוואר המשותף הימני וחשיפת העכבר לסביבה דלת חמצן. תהליך זה מפחית את זרימת הדם והחמצן למוח, וגורם להיווצרות קרישי דם ולנזק מוחי.

גרימת שבץ טרומבוטי באמצעות היפוקסיה ואיסכמיה במודל עכבר

Photothrombosis היא טכניקה מהירה, מינימאלי פולשנית לגרימת אוטם קטן ומופרד היטב בתחומי העניין באופן מאוד לשחזור. זה מתאים במיוחד ללימוד תגובות תאיות ומולקולריים שבבסיס פלסטיות מוח בעכברים מהונדסים.

איסכמיה Photothrombotic: דגם נגע פולשנית לשעתק פוטו קליפתיים לעכבר מחקרי שבץ

מודלים עכבריים שונים של חסימת עורק המוח אמצעית (MCAO) נמצאים בשימוש נרחב בחקר המוח ניסיוני. הנה, אנחנו מדגימים את המודל של MCAO דיסטלי הקבוע transcranial אשר מייצר אוטם קליפת המוח עקבי של גודל המתאים לנזק שהוטל על ידי הרוב המכריע של מקרי שבץ איסכמי אנושיים.

דוגמנות שבץ בעכברים: קרישה קבועה של עורקי דיסטלי התיכון מוחין

שבץ יילודים הוא גורם משמעותי לפגיעה מוחית מוקדמת הדורש מודל תרגומי עם דפוסי פגיעה מוקדית עקביים ויכולת שחזור גבוהה על מנת לאפשר מחקר. מחקר זה מתאר את ההליך הכירורגי המפורט ליצירת פגיעת איסכמיה-רפרפרפוזיה מוקדית חד-צדדית שאינה דימומית במכרסמים בעלי ערך לטווח מלא.

עורקי חלוף דגם ספיג תיכון שיתוק של שבץ ילודים אצל חולדות P10

מתואר כאן מודל שבץ פוטוטרומבוטי, שבו שבץ מיוצר דרך הגולגולת שלם על ידי גרימת איסור מיקרווסקולרי קבוע באמצעות תאורת לייזר לאחר מתן צבע רגיש לאור.

שבץ דוגמנות בעכברים: נגעים קליפת המוח מוקד על ידי פוטוטרומבוזיס

מודלים שונים של אומת עורק המוח האמצעי (MCAo) משמשים במחקר שבץ ניסיוני. כאן, מודל שבץ ניסיוני של MCAo חולף דרך העורק הראשי החיצוני (ECA) מתואר, שמטרתו לחקות שבץ אנושי, שבו פקקת המוח מוסרת עקב תמוגה קריש ספונטני או טיפול.

שבץ דוגמנות בעכברים: אומת עורק מוחי אמצעי חולף דרך העורק הראשי החיצוני

פרוטוקול זה מתאר את המודל של איסכמיה מוחית מוקדית חולפת בעכברים באמצעות חסימה תוך לומינלית של עורק המוח האמצעי. בנוסף, דוגמאות להערכת תוצאות מוצגות באמצעות הדמיית תהודה מגנטית ומבחני התנהגות.

מודל חולף של חסימת עורק מוחי אמצעי חולף

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביסוס מודל חסימת עורק מוחי אמצעי דיסטלי (dMCAO) באמצעות אלקטרוקואגולציה טרנס-גולגולתית בעכברי C57BL/6J ומעריכים את ההתנהגות הנוירולוגית והתכונות ההיסטופתולוגיות שלאחר מכן.

השראת שבץ איסכמי חריף בעכברים באמצעות טכניקת חסימת העורק האמצעי הדיסטלי

מחקר זה מציג פרוטוקול לביסוס מודל בעלי חיים בעל יכולת שחזור גבוהה של טרנספורמציה דימומית (HT) באמצעות חסימה/רפרפוזיה של עורק המוח האמצעי (MCAO/R) בעכברי C57BL/6 עם היפרגליקמיה חריפה.

מודל עכבר של טרנספורמציה דימומית הנגרמת על ידי היפרגליקמיה חריפה בשילוב עם איסכמיה מוקדית חולפת

למדו כיצד ליצור מודל שבץ טרומבוטי בעכברים באמצעות היפוקסיה-איסכמיה מוחית חולפת. השיטה מאפשרת הערכת יעילות טיפול tPA ומחקר מנגנוני שבץ וטיפולים תרופתיים.

דגם שבץ טרומבוטיים בהתבסס על היפוקסיה-איסכמיה מוחית חולפת

גלה סרטונים נוספים