גירוי מבחן העין (EIT) לסיכוני זיהוי כימיקלים עיניים מעצבנים באמצעות אפיתל דגם רקמות כמו-קרנית משוחזר אדם (RHCE)

המטרה הכללית של בדיקת גירוי העין היא לסווג ולסמן חומרים ותערובות על פי פוטנציאל גירוי העין שלהם. נוהל זה משתמש במודל רקמה תלת-ממדי המשחזר קרנית. עם הגעתם, ערכות הבדיקה עוברות אינקובציה מוקדמת למשך לילה במדיום הבדיקה; למחרת, הרקמות עוברות הידרציה, ולאחר מכן מיושמים באופן טופיקלי הביקרות החיוביות והשליליות והכימיקלים הנבדקים על פני השטח של הרקמות, בשכפולים.

לאחר תקופה קבועה של חשיפה, מסירים את הכימיקלים הנבדקים על ידי שטיפה. הרקמות עוברות דגירה לאחר מכן בתווך בדיקה טרי, ולאחר מכן מוערכת הרעילות של הכימיקלים באמצעות בדיקת MTT. בסופו של דבר, ניתן להעריך את פוטנציאל הגירוי של החומרים הנבדקים על ידי השוואת החיוניות היחסית של הרקמות שטופלו בחומר הנבדק לרקמות שטופלו בביקורת שלילית.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקות גירוי מהירות של עקבות, הוא שאינה כרוכה בשימוש בבעלי חיים במעבדה. היא עושה שימוש במודל רקמה עינית דמוית קרנית השוחלרה במעבדה (in vitro), המורכב מתאי אדם נורמליים. היא ישימה לכל סוגי החומרים והתערובות, ויכולה להבחין בין כימיקלים הגורמים לגירוי עיני או לנזק עיני חמור לבין חומרים שאינם גורמים לכך.

חומרים שאינם גורמים לגירוי שאינם דורשים סיווג ותיוג. רקמת אפיתל אנושית משוחזרת דמוית קרנית או epi. Ocular מוכנה בתוך תבניות (inserts) בעלות ממברנה נקבובית שדרכה עוברים החומרי המזינים אל התאים.

רקמה משוחזרת יוצרת אפיתל לא קרטיני המדמה את אפיתל הקרנית עם תאים בעלי שכבות הולכות וגדלות אך שאינם קרנפיים. עם קבלת ערכה לאפיתל דמוי קרנית אנושית, יש להמתין עד שהרקמות במכל המשלוח בעל 24 הבארות יגיעו לטמפרטורת החדר. לאחר 15 דקות, פתח את השק המכיל את פלטת הרקמות בעלת 24 הבארות בתנאים סטריליים ובדוק את כל הרקמות לאיתור בועות אוויר בין ה-agros gel לבין התבניות (inserts). חתוך. פתח את הסרט.

הסר את הכיסוי באמצעות גזה סטרילית ובדוק את פני הרקמה. לאחר מכן, העבר מנה של 1 mL של תוצאת מדיה מהערכה בטמפרטורה של 37 °C לתוך הבארות של פלטות שש בארות שסומנו מראש. לאחר מכן, השתמש בפינצטה סטרילית כדי לספוג בעדינות את התבניות המכילות את הרקמה על גזה סטרילית לצורך הסרת שאריות של נוזל השילוח, והנח אותן בבארות נפרדות בפלטות שש הבארות.

לאחר שעה, החליפו את המצע במילליטר אחד של מצע בדיקה טרי בטמפרטורה של 37 °C, והדגירו את הרקמות בתנאי תרבית סטנדרטיים למשך הלילה. למחרת, טפטפו 20 µL של DPBS נטול סידן ומגנזיום על פני השטח האפיקליים של כל רקמה. אם ה-DPBS אינו מתפשט על פני הרקמות, החזיקו בעדינות את התבנית (insert) בעזרת פינצטה והקישו על הפלטה כדי להבטיח שהסלין מרטיב את כל שטח פני הרקמה.

דגרו את הצלחות למשך 30 דקות. לאחר מכן, כדי לטפל ברקמות באמצעות חומרי בדיקה נוזליים, מרחו 50 µL של הבקרה השלילית, הבקרה החיובית וחומרי הבדיקה המתאימים בשכפולים, בהתאם ללוח הזמנים. הקפידו לוודא שהטיפולים מכסים את כל שטחי הרקמה, ולאחר מכן דגרו את התבניות (inserts) למשך 30 דקות כדי לטפל ברקמות באמצעות חומרי בדיקה מוצקים.

ראשית, העבירו את התבניות למשטח סטרילי. השאירו את הפלטה מכוסה כדי למנוע זיהום מחלקיקים מוצקים הנישאים באוויר. לאחר מכן, בעזרת כף מפולסת, מרחו באופן טופולוגי 50 milligrams של חומר הבדיקה על הרקמות הכפולות בהתאם ללוח הזמנים, תוך הקפדה שהטיפול יכסה את כל שטח פני הרקמה.

לחלופין, ניתן להשתמש במזרק של מיליליטר אחד שמולא מראש וראשו נגזז. כדי להניח את האבקות ישירות על התרבית, לחצו על הבוכנה להחלת האבקה מיד לאחר החלת חומרי הבדיקה המוצקים, החזירו את התבניות לפלטות בעלות שש בארות והדגירו את הרקמות למשך שש שעות כדי לשטוף אותן.

לאחר הטיפול, מלאו 3 כוסות כימית של 150 milliliter עבור כל חומר בדיקה ב-100 milliliters של DPBS בסיום דגירת החשיפה. אחזו בשפה העליונה של המבליטים בעזרת פינצטה מעוקלת כדי להוציאם מהבארים. לאחר מכן, בעזרת פינצטה, הרימו שני מבליטים מאותו טיפול על ידי השפות העליונות שלהם ושפכו את חומרי הטיפול על חומר סופג נקי.

בשלב הבא, טבלו את התבניות (inserts) לכלי הביקר הראשון המכיל DPBS, ושטפו את הרקמות בתנועת סיבוב מעגלית למשך שתי שניות. לאחר מכן, הרימו את התבניות כך שיהיו מלאות ברובן ב-DPBS ושפכו את הנוזל חזרה לכלי הביקר. חזרו על השטיפה פעמיים נוספות בכלי הביקר הראשון.

לאחר מכן, שטפו את התבניות בביקרים השני והשלישי של DPB S שלוש פעמים כל אחת באותו אופן כפי שבוצע בשטיפה האחרונה. סובבו כל תבנית לזווית של כ-45 מעלות כאשר הקצה הפתוח פונה כלפי מטה, והבקיאו את השפה העליונה בחומר סופג כדי לנקז שאריות של DPBS. לאחר מכן, טבלו מיד את הרקמות בחמישה מיליליטר של תווך בדיקה בטמפרטורת החדר.

בפלטת 12 בארות שסומנה מראש, ובסיום תקופת הטבילה שלאחר ההשריה, שפכו את מצע הבדיקה וייבשו את התבתיות (inserts) על חומר סופג. לאחר מכן, העבירו את התבתיות לפלטת שש בארות חדשה המכילה 1 ml של מצע בדיקה חמים בכל בארה, והכניסו את הפלטות לאינקובטור כדי להתחיל את בדיקת החיותיות MTT. העבירו את התבתיות לפלטת 24 בארות המכילה 0.3 ml של תמיסת MTT שהוכנה טרי.

טפחו על ההכנסות (inserts) עם חומר סופג לפני ההעברה. שחררו בועות אוויר כלשהן שנלכדו מתחת להכנסות והחזירו את הרקמות לאינקובטור לאחר שלוש שעות, כאשר תחתית ההכנסות מונחת על החומר הסופג. לאחר מכן, עבור מיצוי שקוע של פריטי בדיקה נוזליים שאינם חומרי צבע, טבלו את ההכנסות בתוך פלטת 24 בארות מסומנת מראש המכילה 2 mL של תמיסות המיצוי המתאימה לכל בארה, עבור מיצוי לא שקוע של חומרי צבע מוצקים או נוזליים.

העבירו את התבניות (inserts) לפלטה של שש בארות המסומנת מראש, המכילה מיליליטר אחד של תמיסת מיצוי לכל בארה. לאחר מכן, אטמו את הפלטות באמצעות טבעת איטום תרמית או פאראפילם כדי למנוע התאיידות, ובצעו מיצוי על שייקר אורביטלי למשך שעתיים עד שלוש שעות בטמפרטורה של החדר, עם ניעור עדין בסיום המיצוי בטבילה. דקרו את הרקמות ולאחר מכן שפכו את הנוזל מכל תבנית חזרה אל הבארה, ואז השליכו את התבניות יחד עם הרקמות.

ערבבו את תמיסת התמצית בכל באר והעבירו שתי מנות של 200 microliter מכל דגימה לבארי המתאימים בלוח 96 בארות שסומן מראש, כפי שמוצג בסכימה שבסוף תהליך המיצוי שאינו שקוע. השליכו את המבובות והרקמות ללא דקירה והוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת מיצוי לכל אחת. ערבבו היטב את תמיסת המיצוי בבארים והעבירו שתי מנות של 200 microliter מכל דגימה לבארי המתאימים בלוח 96 בארות שסומן מראש, כפי שהודגם זה עתה.

לבסוף, קראו את הצפיפות האופטית של הדגימות בספקטרופוטומטר של 96 בארות באורך גל של 570 nanometer ללא שימוש במסנן ייחוס, והזינו את התוצאות לגיליון אלקטרוני כדי לחשב את החיוניות של הרקמות בהתאמה. בצעו תיקונים עקב הפרעה של החומר הנבדק כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט כאן; בניסוי זה מוצגות תוצאות מייצגות של מבחן גירוי עיני שבוצע עם 10 חומרים נבדקים וביקורות שליליות וחיוביות. נצפתה צפיפות אופטית ממוצעת של 1.31 עבור הביקורת השלילית, המקבילה ל-100% חיוניות רקמה, עם חיוניות רקמה יחסית של 31.2% עבור הביקורת החיובית. החומרים הנבדקים 1, 2, 4, 7 ו-8 הראו חיוניות רקמה הגבוהה מ-60%, מה שמסווג חומרים אלו כלא מגרים; החומרים הנבדקים 3, 5, 6, 9 ו-10.

מצד שני, נצפתה שונות ברקמות של 60% או פחות, מה שהוביל לסיווגן כחומרים גרמיים לגירוי. ההבדל בחיוניות הרקמות בין דגימות כפולות של רקמות בניסוי זה היה פחות מ-20% עבור כל הפריטים שנבדקו, למעט פריט בדיקה שניים. לפיכך, התוצאות עבור כל פריטי הבדיקה, למעט פריט בדיקה שניים, נחשבו למכשירות מכיוון שעמדו בכל קריטריוני הקבלה של בדיקת גירוי העין.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו להבין כיצד לבצע את בדיקת ה-DICATION, תוך שימוש במודל רקמה משוחזרת במבחנה הדומה לקרנית אנושית מסוג 4, לצורך סימון זיהוי סכנות של כימיקלים. הליך זה הוטמע בהנחיות בדיקת ה-EOC D כחלק מאסטרטגיית בדיקת השכבות (tier testing strategy).