גירוי מבחן העין (EIT) לסיכוני זיהוי כימיקלים עיניים מעצבנים באמצעות אפיתל דגם רקמות כמו-קרנית משוחזר אדם (RHCE)

המטרה הכוללת של בדיקת גירוי בעיניים היא לסווג ולתייג חומרים ותערובות לפי פוטנציאל הגירוי בעיניים שלהם. הליך זה משתמש במודל רקמה משוחזר תלת מימדי דמוי קרנית. עם ההגעה, ערכת הבדיקה מודגרת מראש למשך הלילה במדיום הבדיקה למחרת, הרקמות עוברות לחות, ולאחר מכן מריחה מקומית של הבקרות החיוביות והשליליות וכימיקלים הבדיקה המעניינים על משטחי הרקמות בשכפול.

לאחר תקופה קבועה של חשיפה, כימיקלים לבדיקה מוסרים על ידי כביסה. הרקמות מודגרות לאחר מדיום בדיקה טרי ולאחר מכן מעריכים את רעילות הכימיקלים על ידי בדיקת MTT. בסופו של דבר, ניתן להעריך את הפוטנציאל המעצבן של מאמרי הבדיקה על ידי השוואת הכדאיות היחסית של הרקמות המטופלות בפריט הבדיקה לרקמות המטופלות בביקורת שלילית.

היתרון העיקרי של טכניקה זו של שיטות קיימות כמו בדיקות גירוי עקבות מהירות, הוא שהיא אינה מערבת חיות מעבדה. הוא משתמש במבחנה במודל רקמה דמוי רקמה, המורכב מתאים אנושיים רגילים. זה ישים לכל סוגי החומרים והתערובות ויכול להבחין בין כימיקלים הגורמים לגירוי בעיניים או נזק חמור לעיניים מחומרים.

חומרים שאינם מגרים שאינם דורשים סיווג ותיוג. הקרנית האנושית המשוחזרת כמו רקמת אפיתל או אפי. העין מוכנה בתוספות עם קרום נקבובי שדרכו עברו החומרים המזינים לתאים.

רקמה משוחזרת יוצרת אפיתל לא קרטיני המדגמן את אפיתל הקרנית עם תאים מרובדים בהדרגה אך לא קורניים. עם קבלת ערכת האפיתל דמוית הקרנית האנושית יש לאזן את הרקמות במיכל המשלוח של 24 הבארות לטמפרטורת החדר לאחר 15 דקות, פתח את השקית המכילה את צלחת הרקמה של 24 הבארות בתנאים סטריליים ובדוק את כל הרקמות לאיתור בועות אוויר בין ג'ל האגרוס לתוספות. חתך. פתח את הקלטת.

הסר את הכיסוי בעזרת גזה סטרילית ובדוק את משטח הרקמה. לאחר מכן יש לצטט מיליליטר אחד של ערכת 37 מעלות צלזיוס לתוך הבארות של שש לוחות באר מסומנים מראש. לאחר מכן השתמש במלקחיים סטריליים כדי למחוק בעדינות את הרקמה המכילה תוספות על גזה סטרילית כדי להסיר את כל שאריות המשלוח ולהניח אותן בבארות בודדות של שש צלחות הבאר.

לאחר שעה, החלף את המדיום במיליליטר אחד של מדיום בדיקה טרי של 37 מעלות צלזיוס, ודגר את הרקמות בתנאי תרבית סטנדרטיים למשך הלילה. למחרת אני מלטף 20 מיקרוליטר של DPBS ללא סידן ומגנזיום על פני השטח האפיקליים של כל רקמה. אם ה-DPBS אינו מתפשט על פני הרקמות, החזק בעדינות את התוספת בעזרת מלקחיים והקש על הצלחת כדי להבטיח שהמלח מרטיב את כל משטח הרקמה.

דגרו את הצלחות למשך 30 דקות. לאחר מכן כדי לטפל ברקמות עם מאמרי בדיקה נוזליים, יש למרוח 50 מיקרוליטר של הבקרה השלילית, הבקרה החיובית ומאמרי הבדיקה המתאימים בשכפול בהתאם ללוח הזמנים. הקפד לוודא שהטיפולים מכסים את כל משטחי הרקמה ולאחר מכן לדגור את התוספות למשך 30 דקות כדי לטפל ברקמות עם פריטי בדיקה מוצקים.

ראשית, העבירו את התוספות למשטח סטרילי. שמור את הצלחת מכוסה כדי למנוע זיהום בחלקיקים מוצקים הנישאים באוויר. לאחר מכן, בעזרת כף מפולסת, יש למרוח באופן מקומי 50 מיליגרם מחומר הבדיקה על הרקמות המשוכפלות בהתאם ללוח הזמנים, תוך הקפדה על כך שהטיפול יכסה את כל שטח הרקמה.

לחלופין, השתמש במזרק מיליליטר אחד מלא מראש כשהראש חתוך. להניח את האבקות ישירות על התרבית. לחץ על הבוכנה כדי למרוח את האבקה מיד לאחר מריחת פריטי הבדיקה המוצקים, החזר את התוספות לשש צלחות הבאר שלהן ודגר את הרקמות למשך שש שעות כדי לשטוף את הרקמות.

לאחר הטיפול, מלאו 3 כוסות של 150 מיליליטר למאמר בדיקה ב-100 מיליליטר DPBS בתום דגירה של החשיפה. אחוז בקצה העליון של התוספות בעזרת מלקחיים מעוקלים כדי להוציא אותם מהבארות. לאחר מכן בעזרת מלקחיים, הרם שתי תוספות מאותו טיפול בקצוות העליונים שלהן ושפך את הטיפולים על חומר סופג נקי.

לאחר מכן, טבלו את התוספות בכוס הראשונה של DPBS ושטפו את הרקמות בתנועה סיבובית למשך שתי שניות. לאחר מכן הרם את התוספות כך שהן יתמלאו בעיקר ב-DPBS ושפכו את הנוזל בחזרה לתוך הכוס. חזור על הכביסה פעמיים בכוס הראשונה.

לאחר מכן שטפו את התוספות בכוסות השנייה והשלישית של DPB S3 פעמים כל אחת באותו אופן לאחר הכביסה האחרונה. סובב כל תוספת לזווית של כ-45 מעלות כשהקצה הפתוח פונה כלפי מטה וגע בשפה העליונה בחומר הסופג כדי לשפוך את כל ה-DPBS שנותר. לאחר מכן טבלו מיד את הרקמות בחמישה מיליליטר של מדיום בדיקה בטמפרטורת החדר.

בצלחת 12 בארות מסומנת מראש בסוף תקופת הטבילה שלאחר ההשריה, יש לשפוך את מדיום הבדיקה ולמחוק את התוספות על חומר סופג. לאחר מכן העבירו את התוספות לצלחת חדשה של שש בארות המכילה מיליליטר אחד של מדיום בדיקה חם לכל באר, והניחו את הצלחות בחממה כדי להתחיל את בדיקת הכדאיות של MTT. העבירו את התוספות לצלחת 24 בארות המכילה 0.3 מיליליטר תמיסת MTT טרייה.

טפחו את התוספות על החומר הסופג לפני ההעברה. שחררו את כל בועות האוויר הכלואות מתחת לתוספות והחזירו את הרקמות לאינקובטור לאחר שלוש שעות, חתכו את תחתית התוספות על החומר הסופג. לאחר מכן, למיצוי שקוע של מאמרי בדיקה נוזליים שאינם צבעוניים, טבלו את התוספות בצלחת 24 בארות מסומנת מראש המכילה שני מיליליטר של תמיסת המיצוי המתאימה לכל באר למיצוי לא שקוע של חומרי צבע מוצקים או נוזליים.

העבירו את התוספות לצלחת שש בארות מסומנת מראש המכילה מיליליטר אחד של תמיסת מיצוי לכל באר. לאחר מכן אטמו את הצלחות עם אוטם חום או פרפורם כדי לעכב את האידוי וחילצו על שייקר אורביטלי למשך שעתיים-שלוש בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין בסוף המיצוי השקוע. חודרים את הרקמות ואז שופכים את הנוזל בתוך כל תוספת בחזרה לתוך הרקמות, ובכן ואז זורקים את התוספות עם הרקמות.

מערבבים את תמיסת התמצית בכל באר ומעבירים שתי כמות של 200 מיקרוליטר מכל דגימה לבארות המתאימות של צלחת 96 בארות מסומנת מראש כפי שמוצג בסכימה בסוף המיצוי השקוע. השליכו את התוספות והרקמות ללא פירסינג והוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת מיצוי לכל אחד. מערבבים היטב את תמיסת החילוץ בבארות ומעבירים שני ליטרים של 200 מיקרוליטר מכל דגימה לבארות המתאימות של צלחת 96 בארות מסומנת מראש כפי שהודגם זה עתה.

לבסוף, קרא את הצפיפות האופטית של הדגימות בספקטרופוטומטר של 96 בארות באורך גל של 570 ננומטר ללא שימוש במסנן ייחוס והזן את התוצאות לגיליון אלקטרוני כדי לחשב את התחייבויות הרקמות המתאימות. קחו בחשבון תיקונים עקב הפרעות כימיות לבדיקה כפי שמצוין בפרוטוקול הטקסט כאן, תוצאות בדיקת גירוי עיניים מייצגות שנערכו עם 10 מאמרי בדיקה ובקרות שליליות וחיוביות מוצגות בניסוי זה. צפיפות אופטית ממוצעת של 1.31 לבקרה השלילית המתאימה ל-100% כדאיות רקמה נצפתה עם כדאיות רקמה יחסית של 31.2% עבור בדיקת הבקרה החיובית סעיפים 1, 2, 4, 7 ו-8 הציגו שונות ברקמות של יותר מ-60% וסיווגו פריטים אלה כמאמרים שאינם מגרים 3, 5, 6, 9 ו-10.

מצד שני, הוצגו שונות ברקמות של פחות או שווה ל-60% וכתוצאה מכך סיווגו כמגרים. ההבדל בכדאיות הרקמות בין רקמות משוכפלות בניסוי זה היה פחות מ-20% עבור כל המאמרים שנבדקו למעט מאמר הבדיקה השני. לכן, התוצאות של כל מאמרי הבדיקה למעט מאמר הבדיקה השני נחשבו מוסמכות מכיוון שעמדו בכל הקריטריונים לקבלה לבדיקת גירוי בעיניים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד עליו לבצע את בדיקת ה- DICATION, תוך שימוש בקרנית אנושית משחזרת במבחנה כמו מודל רקמה ארבע, תיוג זיהוי סכנות של כימיקלים. הליך זה יושם בהנחיות הבדיקה של EOC D כחלק מאסטרטגיית בדיקת השכבות.