Name: דלדול סלקטיבית של Microglia מתא תרבויות המוח הקטן גרגיר שימוש L-לאוצין התיל אסתר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: חקור שיטת דלדול סלקטיבית של תאי מיקרוגליה מתרביות תאי גרגיר המוח הקטן באמצעות L-לאוצין התיל אסתר. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לבחון אינטראקציות בין מיקרוגליה לנוירונים בהקשר של מחלות נוירודגנרטיביות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי Aims2Cure, בריטניה ופרס UCL Impact Award לדוקטורט ל-JMP ודוקטורט לבניית יכולת MRC בדמנציה ל-JMP.

כל הניסויים המתוארים במסמך זה בוצעו בהתאם לבעלי חיים בריטניה (הליכים מדעיים) Act of 1986. 1. הכנה של מכשירים, תרבות מדיה, ומנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שני מספריים מעבדה הנירוסטה לנתח ושני מלקחיים מעבדה נירוסטה. החיטוי כל המכשירים והמקום בO מכסה המנוע התרבות / N תחת אור אור (UV) אולטרה סגול לעיקור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 500 מיליליטר של תקשורת חיונית בינוני מינימום (ממ) תרבות (10% עובריים שור [FBS] סרום, 20 מ&quot;מ KCl, 25 מ&quot;מ NaHCO 3, 30 מ&quot;מ D-גלוקוז, L-גלוטמין 2 מ&quot;מ, 100 U / פניצילין מיליליטר, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין ו -6 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין) ולסנן לעקר. חנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 24 צלחות תרבות היטב המכילות 14 מ&quot;מ, עובי coverslips מספר 1. החיטוי coverslips ומעיל ב/ L 100 מ&quot;ג פולי-ד-ליזין (PDL) כפי שתואר קודם לכן 3. אור UV לעקר O / N. </li></ol> 2. הכנת פתרונות CGC תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן &#39;פתרון&#39; (100 מיליליטר) בautoclaved אור UV, טופל, סטרילי DH 2 O המכיל 250 מ&quot;ג של גלוקוז, 300 מ&quot;ג של סרום שור אלבומין [BSA], 955 מ&quot;ג של בופר פוספט [PBS] (Ca 2 + ו Mg + חינם), ו 1 מיליליטר של 3.8% MgSO 4 · 7H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן &#39;פתרון ב&#39; (10 מיליליטר) מכיל 1 מיליליטר של 5 מ&quot;ג / מיליליטר טריפסין המדולל ב9 מיליליטר של א &#39;הפתרון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן &#39;C פתרון &quot;(10 מיליליטר) מכיל DNase 1,000 יחידות, 0.5 מ&quot;ג של מעכבי טריפסין הסויה, של 3.8% MgSO 4 · 7H 2 O 100 μl, בדילול מלא עד 10 מיליליטר עם א&#39; הפתרון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן &#39;D פתרון &quot;(20 מיליליטר) מכיל 3.2 מיליליטר של C פתרון, בדילול מלא עד 20 מיליליטר עם א&#39; הפתרון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הפתרון מאוזן של BSA / ארל תמיסת מלח (EBSS) המכיל EBSS, 25 מ&quot;מ NaHCO 3, 3 מ&quot;מ MgSO 4 · 7H 2 O, ו4 BSA%, pH 7.4, כפי שתואר לעיל 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן LME ידי הוספת LME הטהור לתוך 5 מיליליטר של מדיום תרבות ממ לתת ריכוז סופי של 150 מ&quot;מ LME, להחזיר את הפתרון לpH 7.4 באמצעות מד pH benchtop, ומסנן לעקר באמצעות sulfone 28 מ&quot;מ polyether (PES) 0.2 מיקרומטר מזרק מסנן. </li></ol> 3. Culturing CGCs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף cerebella מגורי חולדה ישנים 4-7 יום כפי שתואר בעבר 3. הנח מייד בצלחת פטרי המכילה 5 מיליליטר פתרון על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את הפתרון עודף מרקמת המוח קטנה ומקום במכסה צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קוצצים דק רקמה עם סכין גילוח בערה היטב בלפחות שלושה כיוונים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף רקמה קצוצה לפתרון B (לשטוף צלחת פטרי עם פתרון כדי להבטיח רקמה מוגבלת אבד) ומקום באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. ללחוץ בעדינות כל כמה דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף D פתרון (20 מיליליטר) לצינור כדי לנטרל את טריפסין, לרעוד ואחוזיםrifuge ב 65 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend ב 4 מיליליטר של תמיסת ג Triturate היטב (כ 10 פעמים כל אחד) עם שלוש טפטפות זכוכית הלוהבת של הפחתת קוטר, עד ההשעיה היא הומוגנית ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט ובעדינות להוסיף כמה טיפות של homogenate זה על גבי BSA / EBSS. אם זה מתחיל לשקוע דרך BSA / EBSS, triturate יותר ו / או להוסיף פתרון יותר קטן ג homogenate צריך לשבת בשכבה על גבי BSA / EBSS. לא לרעוד. ספין ב 100 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant וגלול גלולים (רך) ב 1 מיליליטר של מדיום ממ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות haemocytometer וצלחת ב800,000 תאים / coverslip ב500 μl של מדיום ממ. מקום בחממה על 37 מעלות צלזיוס עם 6% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את המדיום למחרת (24-36 שעות לאחר ההכנה). הפוך פתרון של מדיום ממ המכיל 10 מיקרומטר של cytidine מחזור התא arabinofuranosyl המעכב (ARAÇ). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל אחדcoverslip, לשמור על 250 μl של המדיום הישן בצלחת גם טרי 24, לשאוב את השאר, להוסיף 250 μl של מדיום ממ הנורמלי ולשאוב זה לשטוף את התאים, ולאחר מכן להוסיף 250 μl של מדיום ישן חזרה לתאים והעליונים עד עם 250 μl של מדיום המכיל ARAÇ. הערה: ניתן להשתמש בתאים מ6 ימים במבחנה (DIV). </li></ol></li></ol> 4. סלקטיבי וכלת Microglia (הנערכת בשעה 6 DIV) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף LME הטהור עד 5 מיליליטר של aliquot נפרד של מדיום ממ לתת ריכוז סופי של 150 מ&quot;מ LME. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את הפתרון לpH 7.4 ומסנן לעקר באמצעות sulfone 28 מ&quot;מ polyether (PES) מסנן 0.2 מיקרומטר מזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל פתרון לריכוז של 50 מ&quot;מ (2 x LME) במדיום ממ ומקום באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות יחד עם מדיום ממ רגיל לתרבויות שליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מחצית (250 μl) בינוני ממ מתרבויות CGC ולשמור על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי פינוקעם מדיום ממ המכיל 2 x LME (250 μl), כלומר דילול 1: 1 נותן ריכוז טוב של 25 מ&quot;מ, או עם מדיום מראש חימם ממ ללא LME (250 μl) לתרבויות שליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified עם 6% CO 2 עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את תאי פעמיים במדיום ממ טרי מראש חימם להסיר תקשורת LME המכיל, ולאחר מכן להחליף את מדיום התרבות נשמרת ונפח שווה של מדיום ממ הטרי מראש חימם לבארות המקבילות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור תרבויות לחממה (humidified עם 6% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס) ולהשאיר למנוחה למשך 24 שעות לפני כל טיפול נוסף. </li></ol>

<ol><li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+remarkable%2C+yet+not+extraordinary%2C+human+brain+as+a+scaled-up+primate+brain+and+its+associated+cost%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost.</a> PNAS. 26 (109), 10661-10668 (2012).</li>
<li>Evans, G. J., &Pocock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+neurotransmitter+release+by+dihydropyridine-sensitive+calcium+channels+involves+tyrosine+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neuro%22%5BJournal%5D)">Modulation of neurotransmitter release by dihydropyridine-sensitive calcium channels involves tyrosine phosphorylation.</a> Eur J Neuro. 11 (1), 279-292 (1999).</li>
<li>Kingham, P. J., Cuzner, M. L., Pocock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+pathways+mobilized+in+microglia+and+neurones+as+a+consequence+of+chromogranin+A-induced+microglial+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Apoptotic pathways mobilized in microglia and neurones as a consequence of chromogranin A-induced microglial activation.</a> J Neurochem. 73 (2), 538-547 (1999).</li>
<li>Contestabile, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+granule+cells+as+a+model+to+study+mechanisms+of+neuronal+apoptosis+or+survival+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebellum%22%5BJournal%5D)">Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro.</a> Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).</li>
<li>Kramer, D., Minichiello, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+of+primary+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell culture of primary cerebellar granule cells.</a> Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).</li>
<li>Facci, L., Skaper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+rat+cerebellar+granule+neurons+and+application+to+identify+neuroprotective+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Culture of rat cerebellar granule neurons and application to identify neuroprotective agents.</a> Methods Mol Biol. 846, 23-37 (2012).</li>
<li>Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+of+the+accessory+cell+necessary+for+mitogen-stimulated+T+and+B+cell+responses+in+human+peripheral+blood%3A+delineation+by+its+sensitivity+to+the+lysosomotropic+agent%2C+L-leucine+methyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunology%22%5BJournal%5D)">Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester.</a> J Immunology. 131 (5), 2282-2290 (1983).</li>
<li>Giulian, D., Vaca, K., Corpuz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+glia+release+factors+with+opposing+actions+upon+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Brain glia release factors with opposing actions upon neuronal survival.</a> J Neurosci. 13 (1), 29-37 (1993).</li>
<li>Guillemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtention+and+characterization+of+primary+astrocyte+and+microglial+cultures+from+adult+monkey+brains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Obtention and characterization of primary astrocyte and microglial cultures from adult monkey brains.</a> J Neurosci Res. 49 (5), 576-591 (1997).</li>
<li>Hewett, J. A., Hewett SJ,, Winkler, S., Pfeiffer SE, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+nitric+oxide+synthase+expression+in+cultures+enriched+for+mature+oligodendrocytes+is+due+to+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Inducible nitric oxide synthase expression in cultures enriched for mature oligodendrocytes is due to microglia.</a> J Neurosci Res. 56 (2), 189-198 (1999).</li>
<li>Jebelli, J., Hooper, C., &Pocock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+p53+activation+is+detrimental+to+neuronal+sysnapses+during+activaton-induced+inflammation%3A+implications+for+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Microglial p53 activation is detrimental to neuronal sysnapses during activaton-induced inflammation: implications for neurodegeneration.</a> Neurosci Lett. 7 (583), 92-97 (2014).</li>
<li>Frade, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+induces+release+of+glutathione+from+cultured+rats+astrocytes+%E2%80%93+a+possible+neuroprotective+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Glutamate induces release of glutathione from cultured rats astrocytes – a possible neuroprotective mechanism.</a> J Neurochem. 105 (4), 1144-1152 (2008).</li>
<li>Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+improved+procedure+for+the+removal+of+microglia+from+confluent+monolayers+of+primary+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes.</a> J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).</li>
<li>Morgan, S. C., Taylor, D. L., Pocock, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+release+activators+of+neuronal+proliferation+mediated+by+activation+of+mitogen-activated+protein+kinase%2C+phosphatidylinositol-3-kinase%2FAkt+and+delta-Notch+signalling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Microglia release activators of neuronal proliferation mediated by activation of mitogen-activated protein kinase, phosphatidylinositol-3-kinase/Akt and delta-Notch signalling cascades.</a> J Neurochem. 90 (1), 89-101 (2004).</li>
<li>Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+establish+microglia-free+astrocyte+cultures%3A+comparison+of+matrix+metalloproteinase+expression+profiles+in+pure+cultures+of+astrocytes+and+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia.</a> Glia. 56 (11), 1187-1198 (2008).</li>
<li>Kumamaru, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+clodronate+selectively+eliminates+microglia+from+primary+astrocyte+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflamm%22%5BJournal%5D)">Liposomal clodronate selectively eliminates microglia from primary astrocyte cultures.</a> J Neuroinflamm. 9, 116(2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

הצעדים החשובים ביותר כדי להבטיח את הסילוק בררני המוצלח של מיקרוגלים מCGC ו / או תרבויות מעורבות הן: 1) שמירה על תרבות CGC סטרילי ובריאה; 2) מסנן חיטוי הבינוני LME המכיל וחוזר הפתרון לpH 7.4; 3) שמירה על תקשורת CGC נשמרת וLME המכיל תקשורת ב 37 ° C כדי למנוע הלם חום; ו 4) עובד במהירות כדי לצמצם את זמן תאים נשמרים מחוץ לחממה. אנחנו השתמשנו 25 מ&quot;מ LME לרוקן מיקרוגלים מתרבויות CGC - ריכוז מותאם בעבר ...

המוח האנושי מורכב 85 מליארד נוירונים משוערים ותאים שאינם עצביים 85 מיליארדים נוספים כוללים גליה 1. לחלק הגדול יותר של 100 השנים האחרונות מדעני המוח התמקדו בעיקר באוכלוסיית התאים העצבית, תאי גליה להאמין להיות קצת יותר מאשר תאים פסיביים תמיכה שספקו תמיכה מבנית לנוירונים - ומכאן האטימולוגיה היוונית של &quot;גליה&quot; תורגמה לאנגלית כ &quot;דבק&quot;. לאחרונה, עם זאת, זה הפך להיות ברור יותר ויותר כי אינטראקציות עצביות-גליה עשויות להיות הרבה יותר בסיסיות להיבטים בסיסיים של נוירוביולוגיה, נוירופיזיולוגיה, והראשית וההתקדמות של מחלות ניווניות רבות. תאי המוח הקטן גרגיר (CGCs), האוכלוסייה הומוגנית העצבית הנפוצה ביותר במוח האנושי, שולטים במוח הקטן ומהווים יותר מ -90% מהבוחרים הסלולריים שלה. כתוצאה מכך, תאים אלה היו בשימוש נרחב במבחנה כמערכת מודל לtהוא חקר התפתחות עצבית, פונקציה, ופתולוגיה 2-6. עם זאת, תרבויות CGC עדיין מכילות מיקרוגלים וגליה אחרות בפרופורציות לטעון משמעותיות. כתוצאה מכך, נתוני CGC putatively מוצגות תגובות עצביות ישירות לטיפולי תאים שונים עשויים למעשה מתעוררים - בחלקו או בסך הכל - מהתגובה המשנית העקיפה של השכן גליה בתרבות. כדי להעריך את זה, אנחנו סלקטיבי בוטלו microglial מתרבויות עצביות CGC עם הסיוע של אסתר L-לאוצין תיל (LME). LME הוא סוכן lysomotropic שימש במקור כדי להרוס באופן סלקטיבי מקרופאגים 7, ומאז משמש לרוקן גם באופן סלקטיבי מיקרוגלים מעצביים, astrocyte, ותרבויות גליה מעורבות 8,9,10. LME מופנם על ידי מקרופאגים ומיקרוגליה, שבו היא גורמת להפרעת lysosomal ואפופטוזיס לאחר מכן 13,14. המקרופאגים ומיקרוגליה הם אופייני עשירים בlysosomes, גורמים להם להיות particularly פגיע בחשיפה לטיפול LME. פרוטוקול זה מספק דרך רבת עוצמה, אך פשוטה וקלה לברר את התרומה של מיקרוגליה בניסויי ניצול CGC ומערכות אחרות עצביות / גליה תרבות.

<table><tbody><tr><td>מלקחיים&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F4142</td><td>הקצה המעוקל מקל על הסרת המוח הקטן&nbsp;</td></tr><tr><td>מספריים מיקרו-חיתוכים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3146</td><td>נקודה ישרה וחדה מקלה על דיסקציה של מכרסמים P4-7&nbsp;</td></tr><tr><td>L-לאוצין מתיל אסטר הידרוכלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>7517-19-3</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת EBSS&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7510-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>פולי-D-ליזין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27964-99-4</td><td>כיסויי מעיל יום אחד לפני השימוש&nbsp;</td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>מעכב טריפסין פולי סויה&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6414</td><td></td></tr><tr><td>עכבר נוגדן נגד ED1&nbsp;</td><td>אבקם</td><td>ab31630</td><td></td></tr></tbody></table>

דלדול סלקטיבית של microglia מתא תרבויות המוח הקטן גרגיר שימוש l-לאוצין התיל אסתר

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

מיקרוגליה, התאים החיסוניים של מערכת העצבים המרכזית, ממלאים תפקידים רב-פנים בוויסות ובקרה של תפקוד עצבי, כמו גם בתיווך חסינות מולדת. מודלים ראשוניים של תרביות תאי מכרסמים קידמו מאוד את הבנתנו את האינטראקציות העצביות-גליה, אך רק לאחרונה נעשה שימוש בשיטות לסילוק ספציפי של מיקרוגליה מתרביות מעורבות. טכניקה אחת כזו - המתוארת כאן - היא השימוש ב-L-לאוצין מתיל אסטר, חומר ליזומטרופי המופנם על ידי מקרופאגים ומיקרוגליה, שבו הוא גורם להפרעה ליזוזומלית ובהמשך לאפופטוזיס13,14. ניסויים המשתמשים ב-L-לאוצין מתיל אסטר יכולים לזהות את תרומת המיקרוגליה לסביבה התאית הסובבת בתנאי תרבית מגוונים. באמצעות פרוטוקול המותאם במעבדה שלנו, אנו מתארים כיצד לחסל מיקרוגליה מתרבית תאי גרגירי מוח קטן של מכרסמים P5. גישה זו מאפשרת להעריך את ההשפעה היחסית של מיקרוגליה על נתונים ניסיוניים, כמו גם לקבוע אם מיקרוגליה ממלאת תפקיד נוירו-פרוטקטיבי או נוירוטוקסיק במודלים תרביים של מצבים נוירולוגיים, כגון שבץ מוחי, אלצהיימר או מחלת פרקינסון.

היכולת של טכניקה זו כדי לחסל באופן סלקטיבי מיקרוגלים מCGC ו / או תרבויות מעורבות מסתמכת על היכולת העתידית של החוקר לזהות בצורה מדויקת ולהבדיל מיקרוגלים מהתאים המקיפים אותם. זה יכול להיות מושגים באמצעות יצרנית תא microglial הספציפי, כגון isolectin-B4, כפי שמודגם באיור 1. כפי שהודגם באיור 2, לא חל שינויים נצפים לastrocyte וצפיפות עצבית ומורפולוגיה נרשמו ביחס לכל אחת מקבוצות הטיפול העיקריות. חשוב לציין, לא חל שינוי משמעותי במורפולוגיה עצבית או astroc...

מיקרוגליה יכולה להשפיע על נוירונים וגליה אחרת בתרבית על ידי מנגנונים אוטונומיים שונים שאינם תאים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לדלדול סלקטיבי של מיקרוגליה מתרביות עצביות ראשוניות. לשיטה זו יש פוטנציאל להבהיר את תפקידן של אינטראקציות מיקרוגליאליות-עצביות, עם השלכות על מצבים ניווניים שבהם דלקת עצבית היא מאפיין סימן היכר.

דלדול סלקטיבית של Microglia מתא תרבויות המוח הקטן גרגיר שימוש L-לאוצין התיל אסתר

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להסיר באופן סלקטיבי תאי מיקרוגליה מתרביות של תאי גרנטול של הסלה. הדבר מושג תחילה על ידי גידול של אוכלוסיית cgcs ואחסון שלהם באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 6% פחמן דו-חמצני. השלב השני הוא הכנת תמיסה של LME במדיום MEM כדי להגיע לריכוז סופי של 150 millimolar LME.לאחר מכן, מחצית מהתווך מסוג MEM מתרביות ה-CGC מוסרת ונשמרת באינקובטור, ולאחר מכן מחליפים את תרביות ה-CGC בנפח שווה של LME המכיל תווך MEM, ומניחים אותן באינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עם 6% carbon dioxide למשך שעה אחת. השלב הסופי הוא שטיפה של תרביות ה-CGC פעמיים עם תווך MEM טרי שחומם מראש.החליפו את מצע התרבית הקיים בנפח שווה של מצע טרי, ולאחר מכן החזירו את התאים לאינקובטור למשך 24 שעות לפני כל טיפול נוסף. לבסוף, נעשה שימוש באימונוכימיה ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי להראות את הדילול הספציפי של תאי מיקרוגליה מתרביות של תאי גרנול של המוחדב (cerebellar granule cell cultures). שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה, כגון אילו השפעות יש למיקרוגליה על נוירונים בתנאים שונים, ומהי המשמעות של השפעות אלו להבנתנו מחלות נוירודגנרטיביות כגון מחלת אלצהיימר ומחלת פרקינסון.בדרך כלל, אנשים שאינם בקיאים בטכניקה זו יתקשו בביצועה, שכן עבודה עם תרביות ראשוניות דורשת דיוק ומהירות. התחל את הפרוצדורה על ידי איסוף המוחון מגורי חולדה בני ארבעה עד שבעה ימים. העבר אותם מיד לפטריית פטרי המכילה 5 mL מתמיסה A על קרח.לאחר מכן, הסירו את עודפי התמיסה מהמוח הקטן (cerebella) והניחו את הרקמה במכסה של פטריית הצמחת (Petri dish). כעת, קצצו את הרקמה דק בעזרת להב תער תקיף לפחות בשלושה כיוונים שונים. לאחר מכן, הוסיפו את הרקמה הקצוצה לתמיסה B. מקמו אותה במקבץ מים בטמפרטורה של 37 °C למשך חמש דקות, ונערו אותה בעדינות מדי כמה דקות.לאחר מכן, יש להוסיף לשפופרת 20 milliliters של תמיסה D כדי לנטרל את ה-trypsin, לנער ולסובב בצנטריפוגה במהירות 60 5G למשך חמש דקות. לאחר מכן, יש לשפוך את ה-S supernatant ולבצע resuspension ב-four milliliters של תמיסה CT tri. יש לדלל את הדגימה 10 פעמים באמצעות כל אחת משלוש פיפטות זכוכית שעברו שריפה, בקטרים יורדים, עד שהסספנסיה תהיה הומוגנית ככל האפשר.בשלב הבא, הוסיפו לאט ובזהירות מספר טיפות מהומוגנאט זה על גבי ה-B-S-A-E-B-S-S; אם הוא מתחיל לשקוע דרך ה-B-S-A-E-B-S-S-T, בצעו טריטראציה נוספת והוסיפו מעט יותר מתמיסה C. ההומוגנאט צריך להישאר כשכבה על גבי ה-B-S-A-E-B-S-S. סובבו במהירות של 100 G במשך חמש דקות והימנעו מניעור. לאחר מכן, הסירו את העלייה (supernatant) ותלו את המשקע (pellet).במיליליטר אחד של מצע MEM, ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר והעבירו אותם לתרבית בריכוז של 800,000 תאים לכיסוי. לאחר מכן, הוסיפו 500 µL של מצע MEM והניחו את הדגימה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 6% carbon dioxide. לאחר מכן, הכינו תמיסת מצע MEM המכילה 10 µM של מעכב מחזור התאים RC. עבור כל כיסוי, השאירו 250 µL מהמצע הישן בתוך פלטת 24 בארות חדשה ושאבו את השאר.הוסף 250 µL של מצע MEM רגיל כדי לשטוף את התאים. לאחר מכן, הוסף 250 µL של מצע ישן בחזרה לתאים והשלם עם 250 µL של מצע המכיל RSE. בהליך זה, הוסף LME טהור לחמישה מיליליטר של מצע MEM כדי להגיע לריכוז סופי של 150 mM LME.החזירו את התמיסה ל-pH 7.4 באמצעות תמיסה חומצית. לאחר מכן, סננו אותה באופן סטרילי באמצעות מסנן מזרק PES של 28 מילימטרים עם נקבים של 0.2 מיקרומטר. לאחר מכן, דללו את תמיסת ה-LME לריכוז של 50 millimolar בתוך מצע MEM.לאחר מכן, הנח אותו במקלחת מים בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות, יחד עם מצע MEM רגיל עבור תרביות ביקורת. לאחר 10 דקות, הוצא 250 µL ממצע ה-MEM מכל תרבית CGC. לאחר מכן, שמור את המצעים בטמפרטורה של 37 °C.בשלב הבא, טפלו בתאים באמצעות מצע MEM המכיל פי שניים LME או באמצעות מצע MEM מחומם מראש ללא LME. עבור תרביות ביקורת, דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה לחה עם 6% carbon dioxide למשך שעה אחת. לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים במצע MEM טרי ומחומם מראש כדי להסיר את המצע המכיל LME. לאחר מכן, החליפו את מצע התרבית שנותר בכמות שווה של מצע MEM טרי ומחומם מראש.לבסוף, דגרו את התרביות ב-6% carbon dioxide בלחות ב-37 degrees Celsius למשך 24 שעות לפני כל טיפול נוסף. איור זה מציג תמונות מייצגות מהניסויים שבוצעו בתרביות CGC לאחר טיפול ב-25 עד 75 millimolar LME למשך שעה אחת, ולאחריו שטיפה. אימונוכימיה בוצעה עם DPI לצורך כימות של מספר התאים הכולל ואלו המציגים מורפולוגיה אפופטוטית, ועם ISO lectin B four לזיהוי וכימות של מיקרוגליה. גרף זה מציג את הכימות של תאים המציגים מורפולוגיה אפופטוטית; מוצגות כאן התמונות המייצגות מהניסויים שבוצעו בתרביות CGC לאחר טיפול ב-25 millimolar LME למשך שעה אחת.בוצע אימונוכימיה עם DAPI ונוגדן anti beta three tubulin לזיהוי שינויים בצפיפות העצבית, ונוגדן anti GFAP לזיהוי שינויים בצפיפות ובמורפולוגיה של האסטרוציטים. תמונות הביקורת השלילית מייצגות תרביות CGC שבהן הושמטו הנוגדנים הראשוניים. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצעה בערך בשעתיים אם היא מבוצעת כראוי.

selective-depletion-microglia-from-cerebellar-granule-cell-cultures

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הסרטון מדגים טכניקה לבידוד תאי מיקרוגליה מקליפת המוח של מוח עכבר בוגר. ראשית, קליפת המוח עוברת סגמנטציה והומוגניזציה כדי להסיר תאי עצב ותאי גלייה אחרים, תוך שמירה על תאי מיקרוגליה. לאחר מכן, תרחיף התא נחשף למיקרו-כדוריות מגנטיות אנטי-מיאלין ולשדה מגנטי, המפריד ביעילות תאי מיקרוגליה ומיאלואיד מפסולת המיאלין ותאים המכילים מיאלין.

בידוד תאי מיקרוגליה מקליפת המוח של מוח עכבר בוגר

סרטון זה מדגים את הטכניקה לבידוד וטיפוח נוירונים ראשוניים של גרגרי המוח הקטן בעכבר. תאים מטופלים עם antimetabolite לחסל תאי גליה מתרבים ולייצר תרבות טהורה של נוירונים גרגיר cerebellar.

בידוד ותרבית של נוירונים גרגיריים צרבלריים ראשוניים של עכבר

סרטון זה מדגים טכניקה להסרה סלקטיבית של תאי מיקרוגליה מתרבית עצבית ראשונית של חולדות. נוירונים גרגירים cerebellar מטופלים עם antimetabolite לחסל תאי גלייה מתרבים. בנוסף, הם מטופלים בחומרים ממוקדי ליזוזום כדי לרוקן מיקרוגליה מהתרבית.

הסרה סלקטיבית של תאי מיקרוגליה מתרבית נוירונים של גרגיר המוח הקטן של חולדה

סרטון זה מדגים את הבידוד והטיפוח של תאי אב עצביים במוח הקטן של גור עכברים. אבות נוירון גרגיר המוח הקטן מבודדים ומטוהרים באמצעות הידבקות דיפרנציאלית, ומסירים ביעילות אסטרוציטים. אבות מתורבתים אלה מתמיינים לאחר מכן לנוירונים גרגיריים צרבלריים.

בידוד וטיפוח אבות נוירונים גרעיניים של המוח הקטן מורין

סרטון זה מדגים פרוטוקול לחילוץ תאי מיקרוגליאה מנגעים דה-מיאלינציה במוחות עכברים באמצעות מיון תאים מגנטיים. הפרוטוקול כולל ניתוח רקמת המוח הפגועה המכילה תאי מיקרוגליה, טיפול ברקמה עם אנזימים ספציפיים לקבלת תרחיף חד-תאי, ושימוש בחרוזים מגנטיים ספציפיים לקולטן מיקרוגליה כדי לבודד את תאי המיקרוגליה.

בידוד מיקרוגליה מנגעי דה-מיאלינציה במוח עכבר באמצעות מיון תאים מופעל מגנטי

סרטון זה מתאר את היצירה של מודל פגיעה עצבית באמצעות מיני חמצן תגובתי (ROS) בנוירונים גרגיריים צרבלריים ראשוניים של עכברים. הוא מפרט את התהליך של גרימת עקה חמצונית על ידי הוספת ריכוזים גבוהים של מי חמצן. חשיפה ל-ROS גורמת לשברים בגדילי הדנ"א ולחוסר יציבות גנומית. בנוסף, חמצון חלבונים תאיים פוגע בתפקודם, בעוד חמצון שומנים פוגע בשלמות הממברנה. מפל זה מוביל לשחרור ציטוכרום c והפעלת קספז, וכתוצאה מכך אפופטוזיס עצבי.

מידול מוות עצבי של חמצן תגובתי בתאי עצב של גרגרי המוח הקטן בעכבר

מפתח אחד לחקירה מוצלחת של הביולוגיה microglial הוא שימור immunofunction microglial vivo לשעבר במנותק מרקמת מערכת העצבים המרכזית. בידוד מיקרוגליה דרך תוצאות רועדות סיבוביות בתרביות תאים טהורות וimmunofunctional מאוד כפי שהוערך על ידי הדמיה ניאון, immunocytochemistry, והפעלת מיקרוגליה הבאות ELISA עם lipopolysaccharide מעודדי דלקת הגירויים (LPS) ופאם 3 צסק"א 4 (פאם).

בידוד של קליפת המוח Microglia עם immunophenotype משומר ופונקציונאלי מילודי Murine

פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד במדויק הכדאיות העצבית באמצעות fluorescein diacetate (FDA) ו Propidium Iodide (PI) מכתים פעמיים בתרבית נוירונים גרגר cerebellar, התרבות העצבית הראשית המשמשת במודל חוץ גופית בתחום מדעי המוח ומחקר neuropharmacology.

הערכת הכדאיות העצבית באמצעות פלואורסצין Diacetate-Propidium יודיד מכתים פעמיים Cerebellar גרגר Neuron תרבות

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה עבור בידוד ואת culturing נוירונים גרגר מוחי העכבר הראשי (CGNs) מן הגורים בת 6-7 יום, התמרה חושית יעילה של CGNs להפסד ורווח של תפקוד לימודי, דגמי NMDA-induced excitotoxicity עצביים, מוות של תאים נמוך-אשלגן-induced נזק לדנ א, לחץ חימצוני באמצעות המודל באותה תרבות.

מידול מוות עצביים והתנוונות בנוירונים גרגר אסטרוציטומה העיקרי העכבר

אנו מספקים פרוטוקול עבור בידוד של מיקרוגלייה מאזורים בגזור שונים של המוח העכבר באמצע המחצית, ואחריו הכנה חצי אוטומטי הספריה לרצף העמוק של RNA תא בודד של טרנססקריפט באורך מלא. שיטה זו תסייע להבהיר טרוגניות תפקודית של מיקרוגלייה בריאות ומחלות.

בידוד של אזור-מיקרוגליה ספציפי מתוך חצי הכדור השני של המוח העכבר עבור רצפי RNA של תא יחיד בודד

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד וטיהור מיקרוגליה ראשונית במודלים של בעלי חיים של מחלות דה-מיאלינציה, תוך שימוש במיון תאים המופעלים על ידי מגנטים.

בידוד של מיקרוגליה ראשונית של עכבר על ידי מיון תאים המופעלים מגנטית במודלים של בעלי חיים של Demyelination

חקור שיטת דלדול סלקטיבית של תאי מיקרוגליה מתרביות תאי גרגיר המוח הקטן באמצעות L-לאוצין התיל אסתר. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לבחון אינטראקציות בין מיקרוגליה לנוירונים בהקשר של מחלות נוירודגנרטיביות.

דלדול סלקטיבית של Microglia מתא תרבויות המוח הקטן גרגיר שימוש L-לאוצין התיל אסתר

גלה סרטונים נוספים