בידוד תא Kupffer לNanoparticle בדיקת רעילות
August 18th, 2015
מקרופאגים בכבד, הנקראים תאי קופפר, אחראים ללכידת ננו-חלקיקים במחזור הדם. אנו מתארים כאן שיטה, של טוהר תאים ותפוקה גבוהים, לבידוד תאי קופפר. בדיקת ה-LDH המותאמת משמשת כאן למדידת הרעילות הנגרמת על ידי ננו-צינורות פחמן בתאי קופפר.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבודד ולטהר עכבר לתאים במספר גבוה כדי לחקור רעילות ננו-חלקיקים. זה מושג על ידי החדרת כבד עכבר בתמיסת H-B-S-S-E-G-T-A וקולגן, תמיסה לעיכול עדין של רקמת הכבד. לאחר מכן, תאי הכבד מטוהרים על ידי צפיפות, צנטריפוגה והדבקה סלקטיבית כדי לקבל תרבית של מטוהרת לתאים.
לאחר מכן מבוצע ניתוח ציטומטריית זרימה על מנת לאשר את הטוהר והתכונות החומציות F של לתאים. מתקבלות תוצאות המראות כי ניתן למדוד רעילות ננו צינור פחמן פונקציונלי בכוס לתאים. בהתבסס על ה-L-D-H-S-A המותאם התומך בכך שניתן ליישם מודל זה לבדיקת רעילות ננו-חלקיקים.
השיטה שאנו שואפים להראות לכם היום יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הננו-טוקסיקולוגיה, כגון הערכת הרעילות של נשאי תרופות שפותחו לאחרונה, זה די חשוב מכיוון שרוב קווי התאים האימורטליים בהם נעשה שימוש, מראים תכונות שונות באופן משמעותי מהרקמות שמהן הם נגזרו. הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית. אם השיטה תבוצע בהצלחה, היא תביא להשגת תפוקה וטוהר גבוהים של תאי ke, אשר לאחר מכן יכולים לשמש כמודל לסינון מגוון של ננו-חלקיקים לרעילות זו.
לאחר הכנה טרייה של כל הריאגנטים המפורטים בטבלת החומרים והריאגנטים שנמצאו עם פרוטוקול הטקסט הנלווה, יש לחמם את תמיסת E-G-T-A-H-B-S-S ואת תמיסת הקולגנאז ב-40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, השתמש ב-70% אתנול כדי לשטוף את הצינורות הגמישים של המשאבה. לאחר מכן שפכו 40 מיליליטר של תמיסת E-G-T-A-H-B-S-S לתוך צינור צנטריפוגה שקוע באמבט המים והשתמשו ב-E-G-T-A-H-B-S-S המחמם מראש כדי לשטוף את הצינור הגמיש של המשאבה. לאחר המתת חסד של CD עכבר אחד, על פי פרוטוקול הטקסט, מגלח את שערות הבטן ומשתמש באתנול 70% לחיטוי פני הבטן.
אשר את ההרדמה על ידי צביטה בבוהן. חותכים את חלל הבטן וחושפים את וריד השער ואת הווריד הנבוב התחתון על ידי הזזת המעי לרוחב משמאל לבטן. הפעל את המשאבה במהירות של 1 עד 3 מיליליטר לדקה עם תמיסת E-G-T-A-H-B-S-S ועם מחט פרפר בגודל 23 קנול את וריד הפורטל מהדק את החלק הקנולטי של וריד הפורטל ולאחר מכן הפוך את מלקחיים הסינוס על פני בטן העכבר הפתוחה.
הכבד צריך להיות חיוור תוך 30 השניות הראשונות של הזלוף, לחתוך במהירות את החלק התחתון של הווריד הנבוב התחתון כדי למנוע הצטברות לחץ עודף בכבד ולהגדיל את קצב הזרימה בהדרגה לשבעה מיליליטר לדקה במהלך הדקה הראשונה של הזלוף. כאשר נותרו פחות מחמישה מיליליטר של תמיסת E-G-T-A-H-B-S-S בצינור הצנטריפוגה. הוסף 40 עד 50 מיליליטר קולגן לתמיסה, ולאחר מכן הגדל את קצב הזרימה בהדרגה ל-10 מיליליטר לדקה במשך 30 שניות.
גרמו לכבד להתנפח על ידי שימוש בפינצטה כדי להפעיל מעת לעת לחץ על הווריד הנבוב התחתון למשך 10 עד 32 מרווחים. זה ישפר את הדיסוציאציה של התאים ויפחית את זמן הזלוף עם קולגנאז. כאשר נותרו פחות מ-10 מיליליטר של תמיסת קולגנאז בתוך צינור הצנטריפוגה, הוסיפו לצינור 40 עד 50 מיליליטר נוספים של תמיסת קולגנאז חמה מראש.
לאחר מכן, לאחר ש-70 עד 80 מיליליטר הוחדרו, השתמש במלקחיים כדי להפעיל לחץ קל על פני השטח. סימן דיכאון מצביע על כך שתאי הכבד מנותקים. הוציאו את הכבד מחלל הבטן כמקשה אחת והניחו אותו בצינור צנטריפוגה המכיל 20 עד 30 מיליליטר לבידוד תאים. בינוני.
שמור את תאי הכבד על קרח עד שלוש שעות ואגר עד שלושה כבדים לטיהור כדי לטהר את הכוס לתאים. מניחים כבד אחד מפוזר בצלחת פטרי עם 15 מיליליטר לבידוד תאים, בינוני עם מספריים או פינצטה. לקרוע את הקפסולה הנוצצת ולשחרר את כל תאי הכבד לתווך.
מסננים את התמיסה דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה. לאחר מכן צנטריפוגה את תרחיף התא ב-50 GS בארבע מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. תאים פרנכימליים יהיו בגלולה ותאים שאינם פרנכימליים יהיו בסופרנטנט.
אספו את הסופרנטנט בצינור צנטריפוגה נקי וצנטריפוגה במשקל של 50 גרם למשך שתי דקות. חזור על הפעולה בסך הכל ארבע העברות וסיבובים. הצנטריפוגה הבאה.
הסופרנאט ב-1,350 GS למשך 15 דקות. כדי לגלול את התאים הלא פרנכימליים, השליכו את הסופרנט והשעו מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר למדיום בידוד התאים, הוסיפו את תמיסת התאים הלא פרנכימלית לשיפוע האיזוטוני הלא רציף של 25 50% שהוכן בעבר על פי פרוטוקול הטקסט והצנטריפוגה ב-850 GS למשך 15 דקות ללא האצה או הפסקה. באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר שאבו כ-12 מיליליטר מהכוס המועשרת לשבר התא שנראה עכור בתוך שבר ה-SIP של 25% קרוב לממשק ה-SIP של 25% 50%.
העבירו את התאים לצינור צנטריפוגה המכיל 35 עד 40 מיליליטר לבידוד תאים, בינוניים וערבבו בעדינות ואז צנטריפוגה ב-1, 350 GS וארבע מעלות צלזיוס כדי לגלול את התאים השליכו את שם העל והשתמשו בחמישה עד 10 מיליליטר של מדיום טרום חם כדי להשעות את התאים עם ציטומטר המו. ספרו את התאים והשתמשו בכתמים כחולים טריאן כדי למדוד את לוחית הכדאיות. התאים הלא פרנכימליים המטוהרים ב-24 צלחות באר בצפיפות של חמש פעמים 10 עד התאים החמישיים לבאר.
דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 30 דקות. ואז הסר בעדינות את המדיום. השתמש ב-HBSS חם מראש כדי לשטוף את התאים ולהחליף אותו ב-500 מיקרוליטר לבאר טרייה חמה מראש למדיום תרבית תאים.
החזר את התאים ל-37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות כדי לאפשר לתאים להיצמד לפני הטיפול בחלקיקי ננו-חלקיקים. לאחר אפיון הטוהר והפעילות הפגוציטית של ה-C לתאים ודגירה עם ננו-צינורות פחמן פונקציונליים או fcts כמתואר בפרוטוקול הטקסט, השליכו את הסופרנטנט והוסיפו 200 מיקרוליטר לבאר של מאגר ליזיס. דגרו על טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 60 דקות, בצעו פיפטינג נמרץ ואספו את הכוס המונחת לתאים בצינורות מיקרו צנטריפוגה.
ואז צנטריפוגה ב-20,000 GS למשך 10 דקות כדי לשלוף את ה-fcn ts שנקלטו על ידי התאים על פסולת התא. אספו את הסופרנטנט לתוך צינורות מיקרו צנטריפוגות ואחסנו אותו בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס. לחלופין, העבירו 50 מיקרוליטר לצלחת של 96 בארות והוסיפו נפח שווה של תמיסת תערובת מצע מערכת הלקטט דהידרוגנאז.
כלול משולשים של בארות ריקות המכילות 50 מיקרוליטר של מאגר ליזה ו-50 מיקרוליטר של תמיסת תערובת מצע. לאחר מכן מכסים את הצלחת ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לפני הוספת 50 מיקרוליטר תמיסת עצירה. לבסוף, קרא את הספיגה ב-490 ננומטר בקורא מיקרו-פלטות והשתמש בנוסחה הבאה כדי לחשב את אחוז כדאיות התא.
איור זה ממחיש כי מספר התאים הלא-פרנכימליים המטוהרים נע בין שמונה ל-14 כפול 10 לששת התאים לכל עכבר וטריאן. צביעה כחולה הדגימה כ-95% כדאיות התאים. דבקה לתאים אימצה צורה עגולה תוך 30 דקות מהדגירה ולאחר ארבע שעות התאים התפשטו ואשכולות החלו להיווצר כפי שניתן לראות כאן.
התאים נצבעו בנוגדנים F four 80 כדי להדגים את טוהר התא, שנמדד מעל 95% על ידי ציטומטריית זרימה. בנוסף, לאחר 12 שעות בתרבית, ניתוח ציטומטריה נמוך הראה כי 85% מהתאים היו מסוגלים לפעילות חומצית PHA על ידי יכולתם לקלוט חרוזים פלואורסצנטיים של מיקרומטר אחד. עם זאת, מספר זה ירד לאחר 72 שעות בתרבית כאשר רק 40% מהתאים היו פגוציטים המוצגים כאן.
לתאים שהודגרו עם ננו-צינורות פחמן פונקציונליים במשך 24 ו-72 שעות היו מורפולוגיות דומות בהשוואה לתאים נאיביים. לעומת זאת, לתאים שהודגרו עם 10% DMSO המשמשת כבקרה חיובית הציגה מורפולוגיה נמקית לאחר ניתוח בדיקת ה-LDH המותאמת לתאים שטופלו ב-10% DMSO במשך 24 ו-72 שעות הראתה רעילות גבוהה בהשוואה, fcts גרמו לירידה קלה אך משמעותית בכדאיות התאים רק כאשר התאים נחשפו ל-50 מיקרוגרם למיליליטר למשך 72 שעות. בעקבות שיטה זו, ניתן לבדוק SC אחרים מבוססי תאים וכל סוגי הננו-חלקיקים באמצעות תאי ke מבודדים.
זה מאפשר לאסוף נתונים אמינים תוך מזעור השימוש בבעלי חיים. אנו מקווים שטכניקה זו תוכל לעזור לחוקרים בתחום הפסיכולוגיה של ננו-טכנולוגיה לסנן את בטיחותם של נשאי הננו המבטיחים הרבים המפותחים יותר ויותר.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
המחקר הנוכחי מתמקד בבידוד וטיהור של תאי קופפר מעכברים כדי לחקור את הרעילות של ננו-חלקיקים. שיטה הכוללת השקיה של הכבד וצנטריפוגה לפי צפיפות משמשת כדי להשיג טוהר תאים ותשואה גבוהים.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירולוגיה
- ביולוגיה תאית
- טוקסיקולוגיה
רקע
- תאי קופפר הם מקרופאגים בכבד שלוכדים ננו-חלקיקים במחזור.
- הבנת רעילות ננו-חלקיקים חיונית ליישומים ביו-רפואיים.
- טכניקות בידוד תאים בטוהר גבוה חיוניות לבדיקות רעילות מדויקות.
- מבחן LDH המותאם הוא שיטה אמינה להערכת רעילות תאים.
מטרת המחקר
- לבודד ולטהר תאי קופפר מכבדי עכברים.
- לחקור את רעילות הננו-צינורות הפחמניים בתאים אלו.
- לאמת את השימוש בתאי קופפר בבדיקות רעילות של ננו-חלקיקים.
שיטות ששימשו
- השקיה של כבדי עכברים עם תמיסת H-B-S-S-E-G-T-A.
- שימוש בתמיסת קולגנאז לעיכול עדין של רקמת הכבד.
- צנטריפוגה לפי צפיפות לטיהור תאים.
- ניתוח ציטומטרי זרימה כדי לאשר את טוהר התאים ותפקודם.
תוצאות עיקריות
- הושגו תרבויות של תאי קופפר בטוהר גבוה.
- רעילות של ננו-צינורות פחמניים ניתנת למדידה בתאי קופפר.
- מבחן LDH המותאם הערך ביעילות את רעילות התאים.
- המודל הזה תומך בבדיקות נוספות של רעילות ננו-חלקיקים.
מסקנות
- שיטת הבידוד מספקת גישה אמינה לחקר תאי קופפר.
- ניתן לבדוק רעילות של ננו-צינורות פחמניים פונקציונליים במודל זה.
- הממצאים תורמים להבנת האינטראקציות של ננו-חלקיקים בכבד.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Isolating primary Kupffer cells addresses a key limitation in nanotoxicology where immortalized cell lines yield discrepant results, improving predictive confidence in nanoparticle safety assessment. This method supports target validation by providing a physiologically relevant model of liver macrophage function, critical for de-risking nanoparticle-based drug carriers. High-yield, high-purity isolation enables reproducible screening of nanomaterials, aligning with early discovery goals for translational biomarker alignment and mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by modeling nanoparticle-Kupffer cell interactions in a disease-relevant system.
- Operational Value: Provides a purified primary cell source (>95% purity) for consistent target engagement and pathway clarification studies.
- Predictive Value: Supports lead identification by measuring functional outcomes like phagocytic activity and viability after nanoparticle exposure.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers a standardized biological system for quantitative LDH-based toxicity readouts, enabling reliable compound evaluation.
- Operational Value: Uses accessible equipment (centrifuge, perfusion pump) to ensure scalability and cross-lab reproducibility.
- Assay Readiness: Generates sufficient cell yield (up to 14×10⁶ cells/mouse) for multi-well plate screening of nanoparticle libraries.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery and preclinical workflows by using primary cells that reflect human liver macrophage biology more closely than immortalized lines.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions through consistent toxicity measurement (e.g., LDH release) across nanoparticle doses and exposure times.
- Translational Continuity: Enables biomarker-aligned screening where Kupffer cell activation or dysfunction predicts in vivo nanoparticle clearance and safety.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, providing a reproducible assay for nanoparticle toxicity screening before preclinical commitment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on nanoparticle uptake and macrophage activation via flow cytometry confirmation of F4/80+ phagocytic cells.
- Screening: Enables assay standardization through density gradient purification and selective adhesion steps that yield homogeneous Kupffer cell populations.
- Analytics: Generates quantitative viability data via modified LDH assay, allowing dose-response modeling and cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling RES-mediated nanoparticle capture, a key determinant of biodistribution and clearance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform applicable to diverse nanomaterials (e.g., functionalized CNTs, drug carriers) across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by using primary cells that maintain native phagocytic and cytokine signaling functions.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized perfusion, digestion, and purification steps yielding >95% pure Kupffer cells.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early predictive confidence in nanoparticle biocompatibility, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of nanocarriers based on liver macrophage toxicity profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent surgery, perfusion techniques, and primary cell handling.
- Dependent on centrifugation equipment, cell strainers, and flow cytometry for validation.
- Necessitates standardization across teams for collagenase digestion times and gradient preparation to ensure consistency.
- Adaptation considerations include adjusting mouse weight (35-45 g) to optimize yield and cannulation success.
- Practical limitations include cell viability decline in culture (phagocytic activity drops from 85% to 40% over 72 hours), requiring timely assay execution.
