תצפית של תנועת ריסי תאי אפיתל דמית העין מקלעת Ex Vivo

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לנתח את התנועה של תא אפיתל מקלעת כורואיד, Celia ex vivo. זה מושג על ידי כריתת המוח מעובר עכבר או גור כדי לבודד את רקמת מקלעת הכורואיד. התנועה הרירית מודגמת על ידי ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות, או מיקרוסקופ DIC, ולאחר מכן נרכש סרט דיגיטלי של קצות הריסים למעקב ידני אחר מיקומי קצות הריסים.

בסופו של דבר, תנועות הקצה המשוחזרות של הסיליה מסווגות ומכומתות על סמך דפוסי התנועות שלהן. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה של התא, כגון כיצד נשלטת תמותת סיליה במהלך ההתפתחות, וכיצד דפוס הניידות משתנה עם הזמן? ההשלכה של טכניקות אלה הייתה ניתוח ואבחון פיזיולוגי של הנתיב.

סוריה קשורה למחלות כמו ההבנות הבסיסיות שלנו לגבי סוריה קינטית עדיין דורבנות. התחל בהנחת עכבר יילוד שטוף אתנול 70%, ראש ב-liebovitz L 15 קר כקרח, בינוני בצלחת סטרילית של 10 ס"מ מיד לאחר עריפת הראש. לאחר מכן, השתמש בזוג מלקחיים של שען כדי להסיר את הקרקפת מהגולגולת.

לאחר מכן חתכו את הגולגולת בחתך חציוני לאורך התפר האורכי כדי לחשוף את המוח, ולאחר מכן חתכו את עצבי הגולגולת כדי לקצור את כל האיבר. העבירו את המוח המבודד לצלחת חדשה מלאה בקרח טרי, מדיום קר, כשההיבט הגבי פונה כלפי מעלה והניחו את המנה מתחת למיקרוסקופ סטריאו. לאחר מכן כוונו את הרקמה כך שפקעות הריח ימוקמו בשעה שלוש, ותפסו את המוח בעדינות בעזרת מלקחיים של השען.

ביד השנייה, השתמש במלקחיים דקים כדי לחתוך את הפונים המוחיים המחברים את חצאי המוח לגזע המוח. צבטו החוצה את ה-Dion Cephalon כדי להפריד עוד יותר בין ההמיספרות והניחו את המשטח החתוך כלפי מעלה, ולאחר מכן משכו את הלמינה אפיה כדי להסיר את מקלעת הכורואיד החדרית הצדדית המחוברת לצד הצדדי של ההיפוקמפוס. לאחר בידוד מקלעת הכורואיד, העבירו את הרקמה לצלחת זכוכית תחתונה של 35 מילימטר המכילה מדיום טרי, והניחו משקל על הרקמה כדי להחזיק אותה בעדינות במקומה תוך 25 עד 60 דקות מהמתת החסד, התחילו בהדמיה חיה של תא האפיתל של מקלעת הכורואיד סיליה, על ידי התאמת המיקוד של עדשת האובייקט בעין.

כוונן את המעבה כך שהמרכז והמיקוד יתאימו לתאורת Kula. לאחר מכן הכנס את האלמנטים האופטיים המתאימים לנתיב האור כדי להתאים לאופטיקה של DIC. הזז את מנסרת ה-DIC כדי להתאים את הניגודיות של התמונות למצב שבו מבנה פני השטח של הרקמה יזוהה בבירור.

לאחר מכן העבר את נתיב האור למצלמת הווידיאו והגדל את עוצמת האור. עם הסרת מסנני הצפיפות הנייטרלית, התאם שדה תצפית ומיקוד, הגדר את הרזולוציה הזמנית של מצלמת הווידיאו ל-200 הרץ ואת זמן החשיפה ל-0.1 אלפיות השנייה לתקופת ההדמיה הרצויה. לאחר מכן רכוש את התמונות לאחר קבלת ערימת התמונות, כל פריים בודד יציג תמונה ברורה של סיליה כדי לעקוב ידנית אחר דפוסי הפעימות של כל ריס.

השתמש במצביע העכבר כדי לסמן את מיקום קצות הריסים בכל מסגרת. לאחר מכן באמצעות התוכנה המתאימה, נתח את נתוני המסלול וסווג את המסלולים לאחד משני מצבי תנועה קדימה ואחורה או סיבוב בעין. בעזרת הנוסחה, חשב את תדירות הפעימות הריריות עבור מחזורי פעימה ריסניים מרובים.

כמו צליה אחרת באותו תא יכולה להפריע לתנועה של כל ריס. לאחר מכן, לנתח את האחידות הזוויתית של צירי הפעימות הריסיים בתוך תא בודד. עבור המסלולים קדימה ואחורה מתאימים את מיקומי קצות הסיליה לקו ישר המגדיר תטה כזווית שהקו יוצר עם ציר ה-X.

שכן מסלולי הסיבוב מתאימים את המיקומים לאליפסה המגדירה תטה כזווית שהציר הראשי של האליפסה יוצר עם ציר ה-x. לבסוף, לתיאור כמותי של כל מסלול, סובב את המסלולים על ידי תטה המגדיר את יחסי הגובה-רוחב שלהם כיחסים בין רוחבי ההתפלגות שלהם לאורך ציר x ו-y. בסרטון ראשון זה, מבט עליון של תאי האפיתל של מקלעת הכורואיד עם סיליה מגור עכבר שני לאחר הלידה שצולם על ידי מיקרוסקופ וידאו במהירות גבוהה מוצג פני השטח הלא סדירים של רקמת מקלעת הכורואיד הופכים אותו לגלוי הן במישור המיקוד והן במישור שאינו ממוקד.

בסרטון השני מוצגת תצוגה מוגדלת של האזור הקופסא מהסרט הקודם, המאפשרת התבוננות מקרוב בתנועות הסיבוב והקדימה ואחורה המוצגות על ידי הריסים הבודדים. כאן מוצגים המסלולים של תנועות קצה הריסים המייצגות ששוחזרו מרשומות סרטים על פני מספר מחזורים עם מסלולי הזמן של קואורדינטות x ו-y של מיקומי הקצה המשורטטים בגרפים. כדי להדגים שינוי פאזה בין שתי הקואורדינטות בגרפים אלה, קואורדינטות x ו-Y נורמלו ושכבו.

בעוד ש-CLIA נייד מזוהה בקלות על ידי הדמיה חיה, לא קל לזהות את ה-CLIA הלא נייד בשיטה זו. כדי להתגבר על קושי זה, מיקרוסקופ אלקטרונים סורק יכול להיות הכרחי להשגת תמונות שלמות של הקליאה ללא קשר לתנועתיותן. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבצע את הנתיחה במהירות מספקת כדי לשמור על טריות הדגימה ולשמור על התנועתיות של סוריה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין דגימות רקמה עם דגני בוקר ויראליים, כמו גם כיצד לנטר ולכמת את התמותה של CX vivo.