Name: תצפית של תנועת ריסי תאי אפיתל דמית העין מקלעת Ex Vivo (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: למד ניתוח תנועת ריסי תאי אפיתל מקלעת העין אקס ויו באמצעות מיקרוסקופיית DIC. השיטה מאפשרת מעקב ידני אחר קצות הריסים וכימות דפוסי התנועה לחקירת בקרת התנועה בהתפתחות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט לאוניברסיטאות פרטיות: סבסוד קרן תואמת ממשרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה (MEXT) של יפן (T.I.) ומענקי סיוע למחקר מדעי (C) מ-MEXT (S.T. ו-K.N).

הפרוטוקולים ושימוש בחיות ניסוי אושרו על ידי ועדות טיפול בבעלי החיים ושימוש המוסדיים באוניברסיטת של יאמאנאשי והאוניברסיטה ואסדה. טיפול בבעלי חיים בוצע בהתאם להנחיות מוסדיות. 1. הכנת CPEC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המנגנונים וחומרים הבאים: מיקרוסקופ סטריאו, מסוגל לשדר תאורה מלמטה רצוי; זוג המלקחיים שען (דומון # 3 או מס &#39;4), מעוקר להבה, מספריים הפעלה ישר, מעוקר להבה; שתי מנות 10 סנטימטרים פלסטיק סטרילית המכילות 20 בינוני ליבוביץ L-15 מיליליטר קר כקרח; זכוכית תחתונה מנות 35 מ&quot;מ המכילות 2 מיליליטר RT ליבוביץ בינונית L-15; כוס 100 מיליליטר המכילה 70% אתנול; גורי עכבר יילודים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה לטבול עכבר בילוד באתנול 70% ולהרדים במהירות על ידי עריפת ראש באמצעות המספריים ההפעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הראש מייד במדיום ליבוביץ L-15 קר כקרח בdi 10 סנטימטרים סטריליsh. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העור ממִכסֵה הַגוּלגוֹלֶת באמצעות זוג המלקחיים שען, לחתוך לפתוח את הגולגולת כדי לחשוף את המוח, ולאחר מכן לחתוך את עצבי גולגולת כדי לבודד את המוח כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את המוח למנה חדשה המכילה בינוני ליבוביץ L-15 קר כקרח ולהתבונן תחת מיקרוסקופ סטריאו, ולוודא כי המוח הוא שקוע לחלוטין במדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את היבט הגב של המוח פונה כלפי מעלה, ולכוון את המוח כך שנורות חוש הריח מתגוררות במיקום השעה שלוש (לאנשים בידיים הנכונים). החזק את המוח בעדינות עם המלקחיים ביד השמאל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים לנתיחה הקנס (דומון # 3 או מס &#39;4) ביד ימין, חתך את כפיס המוח ומתחת parenchyma חיבור אונות המוח, לאורך בקע האורך של המוח הגדול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחף בעדינות את אונות המוח משם לצדדים לרוחב ולחשוף את סדק המוח הרוחבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את ההמיספרות על ידי צובט את הparenchyma דואר בין חצי הכדור והתלמוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך בעדינות את מקלעת דמית העין חדרית הרוחב שמחוברת לצד לרוחב של ההיפוקמפוס ידי affixa lamina. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את מקלעת דמית העין המבודדת לצלחת הזכוכית תחתונה 35 מ&quot;מ המכילה בינוני ליבוביץ L-15 טריים, וכיסוי במשקל (חומרי רשימה) בעדינות להחזיק את הרקמות במקום. </li></ol> 2. הדמית חיה של CPEC צילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר אולטרה סגול נכון (UV) ומסנן לחתוך להסיק (IR) (ים) כדי לחסום אור קצר יותר מ -400 ננומטר ועוד מ 700 ננומטר, ושצפיפות ניטראלית (ND) מסננים (25% ו -6%) מוכנס בנתיב האור של מיקרוסקופ ההפוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את המיקוד של העדשה האובייקטיבית בערך לפי העין, ולאחר מכן להתאים את הקבל כך שהמרכז והמוקד כדי להתאים את תאורת קוהלר. פריזמה הכנס התערבות ההפרש לעומת זאת מתאימה (DIC), אלמנט דסק&quot;ש, כמו גם אלמנטי מנתח והמקטב בliדרך להילחם כדי להתאים אופטיקה דסק&quot;ש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את הניגודיות של תצוגה על ידי עמדת פריזמה דסק&quot;ש, כך שהמבנה של פני השטח הרקמה הוא מוכר ביותר. אם כל cilia של תאי המטרה הוא ניעתי, לא ניתן לקבל תצוגה ברורה של cilia ניע לפי העין בגלל התנועה שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את נתיב האור למצלמת וידאו, והסר את מסנני ND להגדיל את כוח האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במצלמה בהתמקדות מצב כדי להתאים את שדה הראייה והמיקוד. במהלך התמקדות, שבתמונות וידאו מוצגות בזמן אמת על המסך, תצוגה ברורה של cilia ניע אינה זמינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במצלמה ב 200 הרץ עם זמן חשיפה של 0.1 מילים-שני לתקופה הרצויה (שניות עד דקות). לאחר רכישת מחסנית התמונה, מסגרות בודדות יציגו מבני הריסים ברורים. אם קצות הריסים הם מטושטשים, להגדיל את מסגרת הדולר או להשתמש זמן חשיפה קצר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את התנועה של cilia CPEC בתוך 25-60 דק &#39;לאחר המתת חסד בליבוביץL-15 בינוני. </li></ol> 3. ניתוח של ריסי Motion <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידני לעקוב אחר להכות דפוסים של כל cilium על צג המחשב. עמדות קצה ריסי מארק בכל מסגרת עם סמן העכבר, אשר התאסף למידע מסלול של כל cilium. או לנתח את מידע המסלול תוך שימוש באותה תוכנה או לייצא ליישומים כלליים יותר אחרים לניתוח נוסף. היעילות של צעד ניתוח זה מתואר בדיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסווג את המסלולים לשני מצבים של תנועה, גב ו-ושוב או סיבובי, לפי העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את תדירות פעימות הריסים (CBF) באמצעות הנוסחא הבאה: [CBF = (מספר הפריימים לשניה) / (מספר הפריימים ממוצע לפעימה אחת)] 14, שניתן להשיג מתרשים תנועת קצה הריסים (איור 3 ). חזור על חישוב זה למחזורי מכות הריסים מרובים, כי cilia האחר באותו התא יכול להפריע לתנועה של כל ciliuמ &#39;, וכתוצאה מכך אי סדירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את האחידות הזוויתית של ריסי מכות צירים בתוך תא בודד, להגדיר את זווית θ מכות לכל מסלול (איור 4). למסלולי גב ו-ושוב, שיתאים לעמדות של קצה הריסים לקו ישר, ולהגדיר θ כזווית הקו עושה עם x -axis. למסלולים סיבוביים, שיתאים לעמדות לאליפסה, ולהגדיר θ כמו זווית הציר המרכזי של האליפסה עושה עם x -axis. פרטים של ההולם מתוארים בסעיף נציגי תוצאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתיאור כמותי של כל מסלול, לחשב AR יחס היבט הכללי. בקצרה, לסובב את המסלול על ידי - θ ולהגדיר AR כיחס בין הרוחב של ההפצה לאורך x - ו-axes y (איור 4). פרטים מוצגים בסעיף נציג תוצאות, והפרשנות, משמעות, וההגבלה של הפרמטר מתוארות בדיון. </li></ol> לדוגמא הכנה 4. לSEM הערה: SEM הוא שיטה חשובה להעריך את המצב של cilia על CPECs באופן מקיף. כדי להכין דגימות לSEM, הליך סטנדרטי שדווח בעבר 15 מועסקים בשינויים קלים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני לנתח את הרקמה מהמוח, להכין מקבע בבקבוקון זכוכית 5 מיליליטר עם מכסה פוליאתילן. מקבע מורכב paraformaldehyde 2%, glutaraldehyde 2.5% (הפתרון של Karnovsky מחצית 16) במאגר M 0.1 פוספט, pH 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הרקמה מהמוח כמתואר בשלב 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה לשטוף את הרקמה המבודדת עם הפתרון של האנק המאוזן מלח (HBSS) בצלחת חדשה ולאחר מכן לתקן את הרקמות במקבעות בבקבוקון הזכוכית עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר. השתמש טפטפות העברה חד פעמית ולטפל דגימות GEntly. לאחר השטיפה בHBSS, הרקמה הופכת דביקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעביר את הדגימות לפתרון מקבע, לגרש לאט כמות קטנה של תמיסה המכילה רקמה מפיפטה ההעברה כטיפה ומוסיף למקבעים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קיבוע, לבטל את מקבע ולשטוף את הרקמה עם חיץ פוספט שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את הרקמה בתמיסת סוכרוז 10% לשטוף את אלדהידים שנותרו. כדי להבטיח חיסול אלדהידים מלא, לטבול את הדגימות בפתרון עבור 10 דקות ולאחר מכן לחזור פעמיים עם סוכרוז 10% טריים. שלב זה חשוב כדי להשיג פוסט קיבעון-נכון בשלבים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את הרקמה בתמיסה של 1% tetroxide אוסמיום בחיץ פוספט למשך 30 דקות ולאחר מכן למקם על קרח להודעה קיבעון. לשפוט את מידת osmification על ידי צבע המדגם: כאשר אלדהידים יוסרו לחלוטין, המדגם הוא שחור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את דגימות רקמה קבועות פוסט נרחב עם distille הכפולכמה פעמים מים ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש את הדגימות על ידי טבילה בריכוזים מדורגים של אתנול, בדרך כלל 65%, 75%, 85%, 95%, 99%, ו -100%, במשך 10 דקות כל אחד. להשיג אתנול נטול מים על ידי הצבת הנפות מולקולריות ל99.5% אתנול מבקבוק חדש שרכש. חזור על התייבשות עם שלוש פעמים אתנול נטול מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הדגימות המיובשים לתוך אצטט isoamyl, מגיב חילוף לייבוש נקודה קריטי, במשך 10 דקות. חזור על פעולה זו פעמיים. מגיב זה מתאדה במהירות והמדגם יכול להיות יבש, וכתוצאה מכך הרס על ידי מתח פנים. לכן, לא לייבש את המדגם לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חילופי הסופיים של אצטט isoamyl, להסיר את רוב הממס, מייד לעטוף את בקבוקון הזכוכית הפתוח בנייר אלומיניום, ומניח את הבקבוקון על קרח יבש. באמצעות מחט או מלקחיים בסדר, לעשות כמה חורים בנייר הכסף המכסה את הפה של הבקבוקון, כך שנוזל פחמן דו חמצני זורם בקלות לתוך הבקבוקון במייבש הנקודה הקריטי. להמשיך לשלב הבאמהר ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, למזער את שריד של אצטט isoamyl לתוך התא של מייבש, אבל אל תנתנו לי המדגם להתייבש לפני ייבוש נקודה קריטי לחלוטין. בנוסף, אל תשאיר את המדגם על קרח יבש לזמן ארוך שלא לצורך, כדי למנוע היווצרות של כפור על הבקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את בקבוקוני זכוכית עטוף בנייר האלומיניום המכילים דגימות הרקמה למייבש הנקודה הקריטית שמבטיח את המבנה של רקמות המשטח נותר בשלמותה בזמן שהכילו מים הסרת ברקמה. ניתן להשיג מידע מפורט על הפעלת מייבש הנקודה הקריטית מהוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידית הדגימות באמצעות זהירות קיסם כדי למזער את הנזק מכאני. דגימות רקמה מיובשות וכתוצאה מכך הן שבירות. הר הדגימות של ספחי מתכת ומעיל עם זהב-פלדיום באמצעות גמגום יון. </li></ol> 5. תצפית על ידי SEM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב על ידי SEM ולהקליט תמונות עם מצלמה דיגיטליתמצויד למיקרוסקופ אלקטרונים סורק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את נתוני תמונה דיגיטליים למחשב לניתוח. </li></ol>

<ol><li>Nonami, Y., Narita, K., Nakamura, H., Inoue, T., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+in+ciliary+motility+on+choroid+plexus+epithelial+cells+during+the+perinatal+period%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Developmental changes in ciliary motility on choroid plexus epithelial cells during the perinatal period.</a> Cytoskeleton. 70 (12), 797-803 (2013).</li>
<li>Bisgrove, B. W., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+cilia+in+developmental+disorders+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The roles of cilia in developmental disorders and disease.</a> Development. 133 (21), 4131-4143 (2006).</li>
<li>Fliegauf, M., Benzing, T., Omran, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+cilia+go+bad%3A+cilia+defects+and+ciliopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">When cilia go bad: cilia defects and ciliopathies.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (11), 880-893 (2007).</li>
<li>Oh, E. C., Katsanis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia+in+vertebrate+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cilia in vertebrate development and disease.</a> Development. 139 (3), 443-448 (2012).</li>
<li>Shah, A. S., Ben-Shahar, Y., Moninger, T. O., Kline, J. N., Welsh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motile+cilia+of+human+airway+epithelia+are+chemosensory%5BTitle%5D)+AND+%22Science%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Motile cilia of human airway epithelia are chemosensory.</a> Science(New York, N.Y). 325 (5944), 1131-1134 (2009).</li>
<li>Kiprilov, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+in+culture+possess+primary+cilia+with+hedgehog+signaling+machinery%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells in culture possess primary cilia with hedgehog signaling machinery).</a> The Journal of Cell Biology. 180 (5), 897-904 (2008).</li>
<li>Hirokawa, N., Tanaka, Y., Okada, Y., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+flow+and+the+generation+of+left-right+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nodal flow and the generation of left-right asymmetry.</a> Cell. 125 (1), 33-45 (2006).</li>
<li>Narita, K., Kozuka-Hata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+multiple+primary+cilia+reveals+a+novel+mode+of+ciliary+development+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of multiple primary cilia reveals a novel mode of ciliary development in mammals.</a> Biology Open. 1 (8), 815-825 (2012).</li>
<li>Takeda, S., Narita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+vertebrate+cilia%2C+towards+a+new+taxonomy%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%3B+Research+in+Biological+Diversity%22%5BJournal%5D)">Structure and function of vertebrate cilia, towards a new taxonomy.</a> Differentiation; Research in Biological Diversity. 83 (2), S4-S11 (2012).</li>
<li>Ikegami, K., Sato, S., Nakamura, K., Ostrowski, L. E., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+polyglutamylation+is+essential+for+airway+ciliary+function+through+the+regulation+of+beating+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tubulin polyglutamylation is essential for airway ciliary function through the regulation of beating asymmetry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (23), 10490-10495 (2010).</li>
<li>Foster, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+ciliary%2Fflagellar+beating+of+Chlamydomonas%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of the ciliary/flagellar beating of Chlamydomonas.</a> Methods in Cell Biology. 91, 173-239 (2009).</li>
<li>Lechtreck, K. -F., Sanderson, M. J., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+digital+imaging+of+ependymal+cilia+in+the+murine+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">High-speed digital imaging of ependymal cilia in the murine brain.</a> Methods in Cell Biology. 91, 255-264 (2009).</li>
<li>Okada, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+nodal+cilia+movement+and+measurement+of+nodal+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Observation of nodal cilia movement and measurement of nodal flow.</a> Methods in Cell Biology. 91, 265-285 (2009).</li>
<li>Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+beat+pattern+is+associated+with+specific+ultrastructural+defects+in+primary+ciliary+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).</li>
<li>Takeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left-right+asymmetry+and+kinesin+superfamily+protein+KIF3A%3A+new+insights+in+determination+of+laterality+and+mesoderm+induction+by+kif3A-%2F-+mice+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Left-right asymmetry and kinesin superfamily protein KIF3A: new insights in determination of laterality and mesoderm induction by kif3A-/- mice analysis.</a> The Journal of Cell Biology. 145 (4), 825-836 (1999).</li>
<li>Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+formaldehyde-glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolarity+for+use+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 27, 137-138A (1965).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים. מאמר זה נועד בדיווח מתודולוגיה מפורטת להתבונן תנועתיות של cilia ברקמות מקלעת דמית העין מבודדת. חידושים מדעיים דווחו במחקרים קודמים 1,8.

פרספקטיבות של שיטה זו למרות שהטכניקה המתוארת כאן אינה מספקת ניתוח מפורט יותר של ריסים מאשר שיטות שפורסמו בעבר, את המשמעות של טכניקה זו מתגוררת בפשטות של המערכת ועלות האפקטיביות, אשר ניתן ליישם בקלות להקרנה בכל סוג של תנועתיות ריסי vivo לשעבר. בפרט, TI Workbench מספק ממשק פשוט וידידותי למשתמש המאפשר לחוקרים לבחון ולנתח תנועתיות הריסים בקלות רבה יותר. שיטות מעקב יעילות אוטומטיות לא פותחו עבור אובייקטי ניגו...

ריסים הם בליטות דמויות שיער על פני השטח של רוב תאי בעלי החוליות, שמשכו את תשומת הלב של חוקרים רפואיים בגלל סוג של מחלות הנקראות ריסים 2-4. למרות הביטוי הנפוץ של האברון בכל מקום, דווח על מגוון רחב של תפקודים ריסניים, כולל תנועתיות וחישה ביולוגית. לדוגמא, ריסים תנועתיים על פני השטח הריריים מעבירים ריר5 ופסולת אפיתל ליציאת הדרך, ובכך מונעים מחלות על ידי ניקוי פני השטח של האפיתליה. יתר על כן, במהלך תקופות התפתחותיות מוקדמות ושלבי עובר, ריסים מווסתים את התפשטות תאי הגזע6, ומעורבים בקביעת אסימטריה שמאלה-ימין של גוף החולייתנים7. 
תאי אפיתל מקלעת כורואיד (CPECs) הם נגזרות של תאים נוירו-אפיתל המכסים את פני השטח של רקמת מקלעת הכורואיד במוח, הממלאים תפקידים חשובים בשמירה על הומאוסטזיס של הסביבה התוך גולגולתית על ידי ייצור נוזל מוחי שדרתי (CSF). הוכח בעבר כי ל-CPECs יש מספר ריסים לא תנועתיים המווסתים את ייצור ה-CSF באמצעות קולטנים מצומדים לחלבון G המרוכזים במיוחד בריסים8. למרות שריסים אלה נחשבו לריסים שקטים ולא תנועתיים, התגלה שחלק מהריסים של CPEC מציגים תנועתיות חולפת במהלך תקופת היילוד1. ממצא זה היה חשוב למדי מכיוון שהוא גילה כי מה שמכונה ריסים לא תנועתיים אינם בהכרח חסרי תנועה מתחילת ההתפתחות ועשויים להפגין תנועתיות חולפת במהלך חלונות זמן ספציפיים, אולי בתגובה לדרישות ותפקודים פיזיולוגיים ספציפיים9. כדי לתאר במדויק את האופי התנועה של ריסי CPEC, יש צורך לפתח מערכת תצפית ex vivo הכוללת ניתוח של הפרופילים הקינטיים הייחודיים לריסים של CPEC. 
בכל הנוגע לתנועתיות, למרות שמספר דוחות טכניים תיארו תצפיות על הריסים הנעים של אפיתל קנה הנשימה5,10, דגל חד-תאי נע11, מה שנקרא ריסים נעותיים קונבנציונליים12 וריסים צמתים13, שיטות אנליטיות מפורטות החלות על מבנים גליים יחסית כגון מקלעת הכורואיד לא תועדו היטב עד כה. יתר על כן, נדרשת רזולוציית זמן גבוהה כדי לנתח את התנועה הרירית של CPECs, שבהם מצלמות מהירות יקרות הן הכרחיות. כדי לעקוף את הצורך הזה ולפשט את ניטור התנועתיות הרירית של סוגי תאים שונים, הוצגה מצלמה בעלות נמוכה ומהירה,ופותחה שיטה נגישה ונוחה לתיעוד התנועתיות של ריסים תנועתיים, במיוחד כדי לתאר את המהירות ואת דפוס התנועה של כל ריסים. יתר על כן, תוכנת ניתוח התמונות המקורית "TI Workbench" שימשה כאן כדי להקל על ניתוח מפורט של תנועתיות. באופן קולקטיבי, שיטה זו מספקת אסטרטגיה תמציתית חדשה לניתוח תנועה ריסנית יחד עם מיקרוסקופ אלקטרונים סורק מתאם (SEM), שניתן לאמץ במגוון רחב של מחקר סיליום.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><חזק>ריאגנטים נדרשים</חזק><</td></tr><tr>td colspan="4"><חזק>להדמיית תאים חיים</חזק></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Wako Chemicals</td><td>057-00456</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 medium</td><td>Life Technologies</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">להכנת SEM</חזק></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Wako Chemicals</td><td>057-00456</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת המלח המאוזנת של האנק</td><td>Life Technologies</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>glutaraldehyde&nbsp;</td><td>מסננת</td><td>17003-05</td><td></td></tr><tr><td>איזואמיל אצטט</td><td>נקלאי טסק</td><td>02710-95</td><td></td></tr><tr><td>מסננות מולקולריות 4A 1/8&nbsp;</td><td>Wako Chemicals</td><td>130-08655</td> להכנת מאגר <td>אתנול פוספט נטול מים</td></tr><tr><td>(PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>מאגר פוספט, 0.1 מ'</td><td></td><td></td><td>להכנת 100 מ"ל, מערבבים 19.0 מ"ל של 0.1&nbsp; M NaH2PO4 ו-81.0 מ"ל של 0.1&nbsp; M Na2HPO4</td></tr><tr><td>monosodium phosphate (dihydrate)</td><td>Nacalai tesque</td><td>31718-15</td><td></td></tr><tr><td>דיסודיום פוספט (נטול מים)</td><td>Nacalai tesque</td><td>31801-05</td><td></td></tr><tr><td>suclose</td><td>Nacalai tesque</td><td>30406-25</td><td></td></tr><tr><td>אוסמיום טטרוקסיד</td><td>Nisshin EM</td><td>300</td><td></td></tr><tr><td>קרח</td><td></td><td></td><td></td> יבש</tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">כלים וחומרים לדיסקציה</חזק></td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>הן להדמיה חיה והן להכנת SEM</מיקרוסקופ סטריאו חזק></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>מגבת</td><td></td><td></td><td></td> נייר שטוחה</tr><tr><td>&Phi; צלחת</td><td></td><td></td><td></td>פלסטיק 10 ס"</tr><tr><td>מ 100 מ"ל</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מספריים הפעלה ישרה</td><td>Sansyo</td><td>S-2B</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים שענים</td><td>Dumont</td><td>No.DU-3 או -4, INOX</td><td></td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>להדמיית תאים חיים</צלחת</td></tr> <tr><td>תחתונה</td> חזקה>זכוכית <td>Matsunami Glass</td><td>D110300</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>להכנת SEM</רדיד</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td>חזק><td>אלמינום</td></tr><tr><td>בקבוקון זכוכית 5 מ"ל עם מכסה פוליאתילן</td><td>Nichiden Rika-Glass</td><td>PS-5A</td><td></td></tr><tr><td>פיפטת העברה</td><td>Samco Scientific</td><td>SM251-1S</td><td>לקיסם</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> העברת דגימה <td>להעברת דגימה</td></tr><tr><td>מקרטע יונים עם זהב-פלדיום</td><td>היטאצ'י</td><td>E-1030</td><td></td></tr><tr><td>מייבש נקודה קריטית</td><td>Hitachi</td><td>HCP-2</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">ציוד וחומרים מיקרוסקופיים</td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>להדמיית תאים חיים</מיקרוסקופ חזק></td></tr>הפוך <tr><td></td><td>אולימפוס</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>100 W בית גוש כספית וספק כוח</td><td>אולימפוס</td><td>ניתן להשתמש במנורת כספית U-ULH ו-BH2-RFL-T3</td><td></td></tr><tr><td>100 W</td><td>מעבה Ushio</td><td>USH103D</td><td></td></tr><tr><td>DIC, n.a. 0.55</td><td>Olympus</td><td>IX-LWUCD</td><td></td></tr><tr><td>ניתן להשתמש בתריס ידני</td><td></td> <td>Vincent Associates</td><td>VS35S22M1R3-24 ו-VMM-D1</td>.</tr><tr><td>מסנן פס פס (400-700&nbsp; nm, &Phi; 45&nbsp; מ"מ)</td> <td>מסנן Koshin Kagaku</td><td>C10-110621-1</td><td></td></tr><tr><td>ND (&Phi; 45 מ"מ)</td> <td>אולימפוס</td><td>45ND6, 45ND25</td><td>שילוב של 25% ו-6% מסנני ND משמשים</td></tr><tr><td>עדשה אובייקטיבית (טבילה במים) עם אלמנט DIC</td><td>Olympus</td><td>UApo 40XW/340, n.a., 1.15 עם מצלמת וידאו מהירה IX-DPAO40</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Allied Vision Technologies</td><td>GE680</td><td>&#8805; קצב מסגרות של 200 הרץ וזמן חשיפה של 1 msec</td></tr><tr><td>תוכנה לרכישה/ניתוח תמונות</td><td>בתוכנת</td><td>TI Workbench</td><td>המסוגלת לרכוש בקצבי פריימים גבוהים.</td></tr><tr><td>מחשב לשליטה / ניתוח מצלמה</td><td>Apple</td><td>Mac Pro</td><td></td></tr><tr><td>שולחן בידוד רטט</td><td>Meiritsu Seiki</td><td>AD0806</td><td></td></tr><tr><td>משקל לרקמות</td><td>ערכות עיגון פרוסות</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>ניתן להכין אותו עם רשת ניילון מודבקת למעוך בצורת U &Phi; 0.5&nbsp; חוט פלטינה מ"מ.</td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי (משקל חלופי לרקמה)</td> <td>מטסונאמי</td><td>עשוי לפי הזמנה</td><td>זכוכית כיסוי יכולה לשמש כמשקל רקמה.</td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>עבור SEM</חזק></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>אולימפוס</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אלקטרונים סורק</td><td>JEOL</td><td>JSM-6510</td><td></td></tr></tbody></table>

תצפית של תנועת ריסי תאי אפיתל דמית העין מקלעת<em&gt; ex vivo</em

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

מקלעת הכורואיד ממוקמת בדופן החדר של המוח, שתפקידו העיקרי הוא ייצור נוזל מוחי שדרתי. תאי אפיתל מקלעת כורואיד (CPECs) המכסים את פני השטח של רקמת מקלעת הכורואיד מכילים מספר ריסים ייחודיים, אך רוב הפונקציות של ריסים אלה נותרו למחקר. כדי לחשוף את תפקודם של ריסי CPEC תוך התייחסות מיוחדת לתנועתיותם, פותחה מערכת תצפית ex vivo לניטור תנועתיות הריסים במהלך תקופות עובריות, סביב הלידה ואחרי הלידה. מקלעת הכורואיד נותחה מחדר המוח ונצפתה תחת מיקרוסקופ ניגודיות משופר וידאו המצויד באופטיקה של ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות. בתנאי זה, פותחה שיטה פשוטה וכמותית לניתוח הפרופילים הנעים של ריסי CPEC במשך מספר שעות ex vivo. לאחר מכן, השינויים המורפולוגיים של ריסים במהלך ההתפתחות נצפו על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים סורק כדי להבהיר את הקשר בין הבשלות המורפולוגית של הריסים לתנועתיות. מעניין לציין ששיטה זו יכולה לתאר שינויים במספר ואורך הריסים, שהגיעו לשיא ביום שלאחר הלידה (P) 2, בעוד שתדירות הפעימות הגיעה למקסימום ב-P10, ואחריה הפסקה פתאומית ב-P14. טכניקות אלו יאפשרו הבהרת תפקודי הריסים ברקמות השונות. בעוד שטכניקות קשורות פורסמו בדוח קודם1, המחקר הנוכחי מתמקד בטכניקות מפורטות להתבוננות בתנועתיות ובמורפולוגיה של CPEC cilia ex vivo.

סקירה של העבודה מוצגת באיור 1, כולל תמונות של המכשירים. תצפיות תנועה חיים של CPECs סרט 1 מציג סרט של CPECs מבודד מעכבר סביב הלידה, וסרט 2 מראה תצוגה מורחבת של התמונות בסרט 1. יש לציין כי טיפים הריסים בודדים הם פחות ברורים בתמונות סטילס בהשוואה לאלו בסרטים. איור 2</strong...

במחקר זה, טכניקה מיקרוסקופית מפורטת של אור עברה אופטימיזציה לתצפית וניתוח בזמן אמת של התנועה של CPEC cilia ex vivo יחד עם שיטה מיקרוסקופית אלקטרונית לניתוח אולטרה-מבני.

תצפית של תנועת ריסי תאי אפיתל דמית העין מקלעת<em&gt; Ex Vivo</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לנתח את תנועת הריסונים (cilia) של תאי אפיתל בפלקסוס כוראידאליס (choroid plexus) ex vivo. זאת מושג תחילה על ידי הוצאת המוח מעובר עכבר או מגור עכבר כדי לבודד את רקמת הפלקסוס כוראידאליס. התנועה הריסונית מוצגה באמצעות מיקרוסקופיית ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית, או DIC, ולאחר מכן מוקלט סרטון דיגיטלי של קצות הריסונים לצורך מעקב ידני אחר מיקומי קצות הריסונים.בסופו של דבר, תנועות הקצה המשוחזרות של הריסון (Cilia) מסווגות ונמדות על סמך דפוסי התנועה שלהן. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בביולוגיה של התא, כגון כיצד נשלטת תמותת ריסונים במהלך ההתפתחות, וכיצד משתנה דפוס הניידות לאורך זמן. ההשלכות של טכניקות אלו הן בניתוח פתופיזיולוגי ובאבחון.מחלות הקשורות לסוריה, שכן הבנתנו הבסיסית לגבי קינטיקה של סוריה עדיין מוגבלת. התחל בהנחת ראש של עכבר ניאונטלי ששטפו ב-70% ethanol, בתוך מצע Liebovitz L 15 קר מאוד בצלחת סטרילית של 10 סנטימטר, מיד לאחר עקיפת הראש. לאחר מכן, השתמש בפינצטה של שעונים כדי להסיר את הקרקפת מהגולגולת.לאחר מכן, פתחו את הגולגולת באמצעות חיתוך חציוני לאורך התפר האורכי כדי לחשוף את המוח, ולאחר מכן חתכו את העצבים הגולגולתיים כדי להוציא את האיבר השלם. העבירו את המוח המבודד לצלחת חדשה מלאה במדיום קר על קרח, כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה, והניחו את הצלחת

observation-ciliary-movement-choroid-plexus-epithelial-cells-ex

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים את הפיתוח של מודל ex vivo של הנבטה כורואידית לחקר אנגיוגנזה מיקרו-וסקולרית עינית. הבדיקה כוללת תרבית של צמחי עין עכבר המכילים את רקמת הכורואיד המחוברת ללובן העין ולאפיתל פיגמנט הרשתית בתנאים ספציפיים המקדמים הנבטה מיקרו-וסקולרית כורואידית.

בדיקת הנבטת כורואיד לחקר התפשטות כלי דם עיניים Ex Vivo

סרטון זה מדגים את הליך בידוד תאי מערכת החיסון מקלעת כורואידים של עכברים. הליך זה משמש במחקר נוירואימונולוגיה כדי להבין כיצד תאי מערכת החיסון במקלעת הכורואידים משפיעים על בריאות המוח ומחלות נוירולוגיות שונות.

בידוד תאי מערכת החיסון מקלעת כורואידים של עכבר

מקור: Al Omran, A. J.,  et al. הדמיה חיה של הריסים האפנדימליים בחדרים הצדדיים של מוח העכבר. {{}}J. Vis. exp. (2015).  }סרטון זה מדגים טכניקת הדמיה חיה באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) כדי לצפות בפעימות של ריסים אפנדימליים במקטעי מוח של עכבר סגיטלי. ריסים אפנדימליים מניעים נוזל מוחי שדרתי (CSF), ופעילותם נרשמת בחלקי מוח הנשמרים בתווך עשיר בחומרים מזינים ומצולמים בתא מבוקר אקלים. סרטונים בעלי ניגודיות גבוהה מאפשרים לזהות ריסים פונקציונליים ולכמת את תדירות הפעימות שלהם.

הדמיה חיה של פעילות הריסים של תאים אפנדימליים בקטע מוח של עכבר

מקור: Van Wonterghem, E., et al. מיקרודיסקציה ומיקרוסקופ אלקטרונים סריקה שלמה הדמיה של מקלעת כורואיד עכבר. J. Vis. Exp. (2022)סרטון זה מדגים את ההכנה וההדמיה של רקמת מקלעת כורואיד ממוח עכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM). התהליך כולל קיבוע רקמות, התייבשות וציפוי בשכבת פלטינה מוליכה לייצוב והכנת הדגימה להדמיה. SEM מצלם תמונות מפורטות של תאי אפיתל עם מיקרוווילי ומספק תובנות לגבי המאפיינים המבניים של הרקמה.

הדמיה של מקלעת כורואיד במוח עכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק

באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC), תצפית vivo לשעבר של המכות של cilia ependymal ניע ממוקם בתוך החדרים במוח העכבר באה לידי ביטוי בחי הדמיה. הטכניקה מאפשרת הקלטה של ​​תדר מכות הריסים הייחודי וזווית מכות וכן נכסי צעדה תנודת סידן תוך תאי שלהם.

הדמיה חיה של צילה Ependymal בחדרים לרוחב של מוח העכבר

תאי האפיתל של מקלעת הכורואיד (CP) יוצרים את מחסום נוזל הדם-מוח (BCSFB). מודל חוץ גופי של BCSFB משתמש בתאי פפילומה מקלעת כורואיד אנושיים (HIBCPP). מאמר זה מתאר תרבית וזיהום בסיסי של תאי HIBCPP באמצעות מערכת הכנסת מסנן תרבית תאים.

מודל אפיתל דמה מקלעת מבוססת תאים של הגדר ודם-השדרתי נוזל לחקר זיהום חיידקים מצד basolateral

המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים את culturing תאי (RPE) אפיתל הפיגמנט ברשתית, על הממברנה של גיל ו/או חולה אנוש ברוך. שיטה זו מתאימה ללמוד RPE בהתנהגות התא על מטריצה חוץ-תאית פרוץ.

Culturing תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית על מודל לשעבר Vivo של הממברנה של ברוך בן אנוש

פרוטוקול זה מציג בדיקה נבטי choroid, מודל vivo לשעבר של התפשטות מיקרוווסקולרית. בדיקה זו יכולה לשמש כדי להעריך מסלולים המעורבים בהתרבות כלי מיקרו choroidal ולהעריך טיפולים תרופתיים באמצעות סוג פראי רקמת עכבר מהונדסים גנטית.

אקס ויוו צ'רויד נבט א-סאי של אנגיוגנזה מיקרו-וסקולרית עינית

מטרת פרוטוקול זה היא לאפיין מודל חדשני של ניוון עצבי גלאוקומטי המבוסס על צריבה תרמית של 360° של מקלעת כלי הדם הלימבלית, הגורמת ליתר לחץ דם עיני תת-חריף.

צריבה במעגל מלא של מקלעת כלי הדם הלימבלית לגלאוקומה הנגרמת בניתוח במכרסמים

מקלעת הכורואיד (CP), רקמה שלא נחקרה מספיק במדעי המוח, ממלאת תפקיד מפתח בבריאות ובמחלות של מערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה מתאר טכניקת מיקרודיסקציה לבידוד CP ושימוש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק כדי לקבל מבט כולל על המבנה התאי שלו.

מיקרודיסקציה ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק הר שלם הדמיה של מקלעת כורואיד עכבר

למד ניתוח תנועת ריסי תאי אפיתל מקלעת העין אקס ויו באמצעות מיקרוסקופיית DIC. השיטה מאפשרת מעקב ידני אחר קצות הריסים וכימות דפוסי התנועה לחקירת בקרת התנועה בהתפתחות.

תצפית של תנועת ריסי תאי אפיתל דמית העין מקלעת

גלה סרטונים נוספים