שילוב הסעות-Box הדרכה עם אלקטרו Cortex הקלטה וגירוי ככלי לחקר תפיסה ולמידה

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להעריך ולבצע מניפולציה של פעולת מסה עצבית (neural mass action) ונוירודינמיקה במהלך למידה. דבר זה מושג תחילה על ידי השתלת מערכי אלקטרודות מרובות (multi electrode arrays), המאפשרים גרייה והקלטה סימולטנית של פעילות נוירונלית באתרים ספציפיים בקליפת המוח השמיעתית. כשלב שני, בעלי החיים המושתלים מאומנים בתיבת מעבר (shuttle box) בעלת שני תאים בפרדיגמת go no-go, תוך הקלטה של הפעילות הנוירונלית השוטפת בקליפת המוח השמיעתית ושימוש בגרייה מיקרו-קורטיקלית (intracortical micro stimulation) לצורך התניה.

בשלב הבא, מבוצע ניתוח של התנהגות הלמידה ושל דפוסי הפעילות המרחבית-זמנית הקשורה ללמידה על בסיס כל ניסוי בנפרד באופן לא מקוון (offline). התוצאות מראות כי ניתן להשתמש בגירוי מיקרו-קורטיקלי ספציפי לאתר כדי לעורר דפוסי פעילות מרחביים-זמניים המאפשרים לאפיין מצבים קוגניטיביים סובייקטיביים פנימיים. בכך, שיטה זו מבססת קשרים בין דפוסי פעילות של מעגלים קורטיקליים לבין מצבים התנהגותיים נצפים של למידה ותפיסה.

הטכניקות המתוארות כאן מדגימות כי לא רק שניתן לקשור דפוסי פעילות קורטיקלית אינדיבידואליים למצבים התנהגותיים וקוגניטיביים מוגדרים, אלא שניתן גם לעורר באמצעות סימולציה חשמלית תפיסות מוגדרות שניתן לקשור להתנהגויות שונות. הרחבת ממצאים אלו מכוונת לפיתוח תחליף נוירופרוסתטי לתפקוד חושי אובדן. ניתן ליישם שיטה זו גם במינים אחרים של מכרסמים, כגון חולדות ועכברים.

באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו עלולים להיתקל בקשיים, שכן נדרש ניסיון וסטנדרטים מפותחים לטיפול ואימון של בעלי חיים כדי להשיג תוצאות טובות מניסויי למידה אלו. ראשית, מוכנים מערכי אלקטרודות רב-ערוציים מעוררים, ואז הם מושתלים באופן כירורגי בקליפת המוח השמיעתית. בהתאם להוראות בחלק הכתוב של הפרוטוקול, שאר ההליך מתחיל רק לאחר שבעלי החיים התאוששו לחלוטין מהניתוח.

מערכי פני שטח אפידוראליים עשויים מחוטי פלדת אל-חלד המסודרים במטריצה של שלושה על שישה, עם מרחק בין אלקטרודות של כ-600 מיקרון. חברו את מגבר שלב הראש לכבל ההקלטה. השתמשו ברתמה של כבלים גמישים ודקים העטופים ברשת מתכת כדי להגן על החיבור מפני נזקים שנגרמים על ידי נשכיו של בעל החיים.

השתמש במגבר מקדמי בתוך תיבה ממוגנת כדי להגביר את יחס אות לרעש ואת רוחב הפס. סנן את האות בטווח התדרים הרצוי עבור הקלטות של פוטנציאל שדה מקומי (LFP). דגום את הנתונים בתדר דגימה של יותר מ-1 kHz עם פילטר של 2 עד 300 Hz. עבור הקלטות של פוטנציאל פעולה, השתמש בתדר דגימה של לפחות 40 kHz ובפילטר של 300 עד 4,000 Hz.

כדי להתחיל את הבדיקה ההתנהגותית, השתמשו בתיבת מעבר (shuttle box) בתוך תא מוגן אקוסטית וחשמלית. התיבה כוללת שני תאים המופרדים על ידי מכשול. השתמשו בגובה מכשול המתאים למינים ספציפיים, שכן גובה המכשול משפיע על ההטיה ההתנהגותית של התגובה.

לאחר חיבור החיה הנבדקת לכבל ההקלטה והגירוי, מקם בעדינות את החיה בתא האימון והמתן שלוש דקות להתרגלות לפני תחילת הסשן; רשום את כל שינויי התאים בשלב ההתרגלות. בדוק בקפידה את איכות ההקלטה לפני תחילת האימון. החל פילטר fast Fourier transform מקוון על האות כדי לקבוע את האמפליטודה של רעש ב-50 hertz.

לבסוף, בדקו שוב את כל החיבורים בין מחבר הראש, המתאמים, שלבי הראש, צמת הצמה והמגברים. השתמשו בגרפן (stimulator) רב-ערוצי כדי להעביר גירוי מיקרו-קורטיקלי פנימי לאלקטרודות הגירוי עבור גירוי מותנה. העבירו את הגירוי המותנה ולאחר מכן העבירו את גירוי השוק ברגליים שאינו מותנה דרך רצפת הסבב, וודאו שעוצמת השוק המועברת היא דוחה, אך לא מכאיבה.

כפי שניתן לראות כאן. הצג ניסיונות ריקים ללא גירוי לא מותנה וגירוי מותנה שמשובצים בין הניסיונות כדי לבצע תיקון באמצעות התנהגות עדינה. סווג שינוי במדור לאחר הופעת הגירויים המותנים בתוך חלון זמן קריטי של ארבע שניות כתגובת פגיעה (hit response).

אם תגובה מותנית אינה מתרחשת בתגובה לגירוי המותנה בתוך חלון הזמן הקריטי, יש להעניק מיד הלם רגלי קל למשך שש עד 10 שניות. כגירוי לא מותנה, סווג זאת כפספוס (miss) עבור ניסויים שליליים של גירוי מותנה; שינוי תא בתוך חלון הזמן הקריטי יסווג כתגובת התרעה שגויה (false alarm). יש להחיל את הגירוי הלא מותנה למשך עד 10 שניות מיד לאחר תגובה מותנית בלתי הולמת זו.

אין להפעיל את גירוי השוק החשמלי הבלתי מותנה לאחר ניסיונות שליליים של הגירוי המותנה כאשר בעל החיים נשאר בתא במהלך חלון הזמן הקריטי. סווגו זאת כדחייה נכונה לאחר סיום כל הניסוי. כדי להבטיח מיקום יציב של מערך אלקטרודות הגירוי, הגישו הרדמה כירורגית ולאחר מכן הפעילו זרם קתודי מונופולרי דרך כל ערוצי הגירוי כדי להשיג משקעי ברזל ברקמה במיקום ההשתלה. קבעו בזהירות את זמני השהייה עד למילוט (escape latencies) בזמן אמת; העלו את עוצמת השוק החשמלי אם זמני השהייה עד למילוט עולים על שתי שניות.

לאחר 20 הניסיונות הראשונים לניתוח נתוני האימון, חשבו את קצבי התגובה המותנים עבור ניסיונות של גירוי מותנה חיובי וגירוי מותנה שלילי כפי שמוצג על המסך; שרטטו את קצבי התגובה המותנים כפונקציה של המפגש או של בלוק הניסיונות כדי להעריך את התקדמות האימון ואת דינמיקת הלמידה. לבסוף, בצעו ניתוח d' (deep prime) בהתאם להוראות בחלק הכתוב של הפרוטוקול. מדד רגישות עם ערך d' הגבוה מ-1 יכול לשמש כקריטריון סף לתגובת הבחנה מוצלחת. זמני השהיה של תגובה במהלך ניסיונות של גירויים מותנים חיוביים משורטטים כאן עבור ניסיונות בודדים. לאורך כל מפגשי האימון, כל התגובות עם זמני השהיה נמוכים מ-seconds תואמות לתגובות פגיעה (hit) מוצלחות.

היסטוגרמות של השהיות תגובה הן דו-שיאיות, התואמות לתגובות HIIT בפחות משש שניות ולתגובות מילוט בין שש לשמונה שניות. זוהי דוגמה טיפית לפוטנציאל שעורר חשמלית או EEP מבעל חיים בודד, ממוצע על פני ניסיונות חיוביים של גירוי התנייה במפגש אימון בודד; ה-EEP מוצג בצבע שחור לפני הסרת ארטיפקטים של גירוי פולס בודד, ובצבע אדום לאחר הסרת הארטיפקטים. ניתן לראות את השיא השלילי הבולט המוקדם, המכונה N two zero, בהשהיה של 20 milliseconds.

איור זה מציג ניתוח נוסף של ההתפלגויות המרחביות של אמפליטודת ה-N20 בתגובה לגירוי במצב חיובי באלקטרודת הגירוי הרוסטרלית בפנל העליון, ולגירוי במצב שלילי באלקטרודת הגירוי הקודאלית. בפנל התחתון, הדבר חושף את הרזולוציה המרחבית של מצבים מעוררים לאורך קליפת המוח השמיעתית. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שההארקה של רצפת הרשת היא קריטית להשגת הקלטה אלקטרופיזיולוגית באיכות גבוהה, כמו גם להגעה נאותה של הגירוי החשמלי בעקבות הליך זה.

ניתן לכלול בפרוטוקול שיטות אחרות, כגון מניפולציות אופטוגנטיות ופארמקולוגיות, כדי לחקור סוגי תאים ספציפיים ומערכות מוליכים עצביים במעגלים קורטיקליים במהלך תפיסה ולמידה. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום לעבור מתיאור קורלטיבי בלבד לתיאור סיבתי יותר של תפקיד הדינמיקה הנוירונלית בתפקודי למידה וזיכרון.