מכרסמים מוח Microinjection לחקר מולקולריים מצעים של התנהגות מוטיבציה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר במדויק צינורית ומזרקי מיקרו וכן לבצע כראוי מיקרו-הזרקה. זה מושג על ידי ייצור תחילה של צינורית לאורך מתאים. השלב השני הוא חיתוך והרכבה של מזרקי מיקרו.

לאחר מכן, הכינו מזרקי מיקרו, צינורות ומשאבה למיקרו-הזרקה. השלב האחרון הוא השלמת מיקרו-הזרקה ולאפשר לתקופת דיפוזיה לעבור. בסופו של דבר, מיקרו-הזרקה משמשת להזרקה מדויקת של ריאגנטים לאזור המוח הרצוי המדגים טיפול נכון.

במהלך המיקרו-הזרקה יהיה ריאן פולנד, סטודנט במעבדה שלי. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שיש לנקוט בזהירות מיוחדת וכל הצעדים דורשים תשומת לב רבה על מנת להבטיח מיקום נכון של צינורית ומיקום מיקרו-הזרקה. כדי להכין תחילה את הצינורית, צייר קו ייחוס של 15 מילימטר על הקלטת בעזרת עט עדין.

לאחר מכן השתמש בו כמדריך לסימון קטעי 15 מילימטר ברצף על הצינור עם טוש קבוע חד. לאחר מכן, חריץ את צינור הצינורית על ידי נגיעה בו בדיסק הניתוק המסתובב האיטי של הכלי הסיבובי. בנקודות המסומנות, סובב את הצינורית 180 מעלות וחרץ את הצד הנגדי של הצינור.

אין לחתוך את הצינור לחלוטין מכיוון שהוא עלול להוביל לחסימה. לאחר מכן, כופפו בחדות את הצינור על מנת לשבור אותו לחלקים של 15 מילימטר. לאחר מכן החזק כל קצה של הצינורית בניצב לדיסק החתוך בין האגודל לאצבע.

סובב את צינור הצינורית תוך נגיעה בקצהו לפני השטח של דיסק הניתוק כדי ליצור קצה קהה. לאחר מכן, חבטו את שני קצוות הצינורית עם מחט משופעת בגודל 26 כדי להבטיח שכל הקוצים הוסרו ושהצינורית אינה חסומה. כדי להכין את האובטורטור clamp צינורית אחת באורך של כחצי עם המוסטטים ישרים במשקל בינוני, הנח את המוסטט הנעול על הספסל כך שהצינורית תהיה בניצב לספסל.

לאחר מכן הזינו קצה אחד של חוט הטור לתוך הצינורית עד שהוא מגיע לספסל. כופפו את החוט על ידי צביטה באצבעות עד להשגת זווית של 30 מעלות תוך שמירה על מגע בין האובטורטור לספסל. לאחר מכן, הסר את החוט מהצינורית וחתך את החלק העודף במרחק של 2.5 מילימטרים מהעיקול בעזרת חותכים אלכסוניים קטנים.

בהליך זה, החזק קצה אחד של צינור מזרק המיקרו בניצב עם המוסטט ישר נעול. סובב המוסטט תוך שמירה על מתח על הצינור וסובב אותו בחוזקה סביב המוסטט לפחות פעם אחת. לאחר מכן, מדוד 32 מילימטרים מהקצה הרופף הנגדי של צינור מזרק המיקרו ותפס נקודה זו בניצב עם המוסטט שני.

כופפו את הצינור קדימה ואחורה תוך שמירה על המתח עד שהוא נשבר. לאחר מכן בדוק את צינור מזרק המיקרו כדי לוודא ששני הקצוות ישרים ושהקוטר הפנימי אינו חסום. צייר קו ייחוס של חמישה מילימטר על סרט המדידה וסמן קטעי חמישה מילימטר של צינורות צינורית ברצף באמצעות טוש קבוע.

לאחר מכן, גע בצינור הצינורית בדיסק הניתוק המסתובב האיטי בנקודות מסומנות על מנת לחרוץ את הצינור. לאחר מכן כופפו בחדות את צינור צווארון המזרק המיקרו על מנת לשבור אותו לחלקים של חמישה מילימטרים. החלק צווארון אחד על כל צינור מזרק מיקרו במרחק של כשני סנטימטרים מהקצה.

מרחו כמות קטנה של דבק סופר על צינור מזרק המיקרו בגובה חמישה מילימטרים מקצה אחד. לאחר מכן, החלק את הצווארון מעל חרוז הדבק הסופר כך שיהיה מילימטר אחד מקצה צינור המיקרו-הזרקה. לאחר מכן מכסים את שני קצוות הצווארון בדבק.

לאחר מכן חבר מחט בגודל 26 למזרק מיליליטר מלא במים סטריליים. והחלק את חתיכת שמונה הסנטימטרים של צינורות פלסטיק מיקרו מזרק על המחט, הקפד לא לנקב את הצינור לאחר מכן החלק את הקצה השני של צינור הפלסטיק מעל קצה הצווארון של מזרק המיקרו המיובש. דחוף את בוכנת המזרק המלאה במים כדי לבדוק פטנט C.In שלב זה, כופפו את מזרק המיקרו שהושלם במרחק של 15 מילימטרים מהקצה הנגדי לצווארון ב-95 מעלות.

לאחר מכן, חתוך את צינור הפלסטיק ל -70 סנטימטרים והחלק אותו מעל צווארון מזרק המיקרו. כדי להכין את המשאבה למיקרו-הזרקה, הגדר את קוטר קצב העירוי הרצוי של מחט המיקרו-הזרקה ואת נפח הזרקת היעד על הצינור. לאחר מכן הגדר את מצב המשאבה לעוצמת הקול כך שנפח מדויק יועבר אוטומטית.

לאחר מכן, כוונן את מעצור המשאבה כדי לאפשר מילוי המזרק לנפח ההזרקה בתוספת 0.2 מיקרוליטר נוספים. כעת הכניסו את קצה המזרק האטום למים הסטריליים הכלולים בסירת מי גבינה קטנה ורפרוף בעדינות את הבוכנה כדי לשמן את החוט הפנימי באופן שווה. משוך את הבוכנה למעצור האחורי במשאבה כדי למלא את מחט המיקרו-הזרקה במים.

השקופית הבאה. צינור PE 20 המחובר למזרק המיקרו על מחט בגודל 26 המחוברת למזרק מלא מים סטרילי של מיליליטר אחד. רססו מים סטריליים דרך מזרק המיקרו ובדקו את דפוס הריסוס והמרחק.

לאחר מכן הנח מזרק מיקרו מעוקר על שדה סטרילי. החלק את הצינור מהמחט, חתוך את הצינור מתחת לאזור שנפגע מהמחט תוך שמירה עליו זקוף כדי למנוע טפטוף מים החוצה. לאחר מכן, דחוף את בוכנת מזרק המיקרו מעט קדימה כדי ליצור טיפה בקצה המחט והחלק את צינור PE 20 המלא במים על המחט.

לאחר מכן, דחוף את הבוכנה לחלוטין קדימה כדי להתכונן להעמסת הדגימה ולהבטיח שלא יישאר עקבות אתנול במזרק המיקרו. בדוק את ההגדרה לאיתור נזילות על ידי נגיעה בטיפת המים שנוצרת בקצה מזרק המיקרו עם מגבון מעבדה נקי מספר פעמים. לאחר מכן משוך את בוכנת המזרק לאחור 0.2 מיקרוליטר כדי ליצור בועה בין המים הסטריליים לצינור PE 20 והתמיסה שיש להזריק.

לאחר מכן, הנח את מזרק המיקרו לתוך המגיב להזרקה ומשוך לאט את בוכנת המזרק אל הגב. כדי להכין את החיה להזרקה, החזיקו את החזה של החולדה כנגד החזה של הנסיין. נקו את האזור סביב הצינורית בעזרת מוליך כותנה ספוג בבטאדין.

ספוג את מכסה הראש שלוש פעמים עם בטדין ולאחר מכן ספוג עם אתנול פעמיים. לאחר מכן הנח את מזרק המיקרו המלא לתוך הצינורית. לחץ על התחל במשאבת הזרקת המיקרו ופקח על תנועת הבועה.

בסיום ההזרקה, הסר את מזרק המיקרו מהצינורית והחלף באובטורטור. איור זה מראה את הטרנספקציה של אזור האסטרוציטים של גרעין האקומבנס על ידי נגיף מוזרק, ואיור זה מראה את הפחתת המוטיבציה של חולדות לתת אתנול בעצמן על ידי הפעלת טרנסגן שהתבטא יתר על המידה בגרעין האקומבנס. הפעלת אתרי אסטרוציטים מרכזיים של אימה על ידי מתן מערכתי של CNO הפחיתה משמעותית את המוטיבציה של חולדות לתת אתנול בעצמן לאחר התנזרות בהשוואה ל-CNO של הרכב, שלא הייתה לו השפעה בקבוצה מאומנת באותה מידה שביטאה GFP במקום האימה ששלטה בה לאחר ששלטה.

טכניקה זו יכולה לאפשר כלי מיקרו-הזרקה מותאמים אישית למוח, וגמישות נוספת של הליכי ניסוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שמיקום מדויק של מיקרו-הזרקה הוא הכרחי כדי להשיג את האפקט הרצוי.