Microdilution שיטת ההפניה מרק לDalbavancin במבחנה בדיקה של רגישות חיידקים שגדלות אירובי

המטרה הכוללת של ההליך הבא היא לקבוע את הריכוז המעכב המינימלי עבור dalbavancin. שימוש בשיטת דילול מיקרו מרק עם התמקדות בשלבים העיקריים הייחודיים ל-Dalbavancin כדי לעשות זאת. ציר ודילול ביניים של dalbavancin מיוצרים ב-DMSO והדילול הסופי נעשה בקטיון על מרק מולר הינטון מותאם בתוספת פוליסורבט.

הדילול מחולק לצלחת של 96 בארות ומחוסן בתרחיף סטנדרטי של חיידקים. לאחר מכן מודגרת הצלחת למשך 16 עד 24 שעות ונבדקת כדי לקבוע את הכמות המינימלית של דלבנצין הנדרשת לעיכוב צמיחת חיידקים. הקפדה על שיטה סטנדרטית זו תבטיח תוצאות עקביות הן עם מבודדים קליניים והן כפי שמוצג כאן, בקרת איכות מבודדת Dalbavancin הוא חומר אנטי-מיקרוביאלי ליפו-גליקופפטיד חצי סינתטי שאושר במאי 2014 על ידי ה-FDA לטיפול בזיהומים חריפים בעור ובמבנה העור הנגרמים על ידי אורגניזמים גראם חיוביים.

שיטה זו מתארת את המרק הסטנדרטי, שיטת רגישות למיקרו דילול לדאסין, הכוללת שימוש ב-DMSO להכנת תמיסות מלאי בפוליסורבט 80 כדי להקל על היצמדות הסוכן לפלסטיק הדגמה חזותית של שיטה זו מועילה. מכיוון ששלבי הכנת תמיסת המלאי וצלחת המיקרופון אינם אופייניים בהשוואה לרוב החומרים האנטי-מיקרוביאליים. שלבים אלה ייחודיים לתרופות ליפו-גליקופפטיד וחשוב לעקוב אחריהם על מנת להשיג תוצאות MIC הניתנות לשחזור ומדויקות.

מי שתדגים את ההליך תהיה ג'ינה פישר, מדענית חוקרת מהמעבדה שלי. שימו לב כי יש לנקוט באמצעי זהירות מתאימים התואמים את רמת הבטיחות הביולוגית השנייה בעת ביצוע ההליך הבא. התחל בשקילת הכמות המתאימה של dalbavancin להכנת תמיסת מלאי של 800 מיקרוגרם למיליליטר.

הוסף את הכמות המתאימה של NEAT DMSO לצינור זכוכית או פלסטיק סטרילי, ולאחר מכן העביר את האבקה לצינור ומערבל אותה. הבא. באמצעות תמיסת המלאי של 800 מיקרוגרם למיליליטר DALBAVANCIN, הכן 100 x ריכוזי צלחת MIC סופיים כפי שמוצג בעמודות 1 עד 4. אלה מכונים ריכוזי הביניים.

הנפח הכולל שהוכן יהיה תלוי במספר לוחות המיקרופון. לבסוף, יש לדלל את ריכוזי הביניים באחד עד 100 במרק מולר הינטן לא מותאם, הידוע גם בשם C-A-M-H-B, בתוספת 0.004%P 80. ריכוז העבודה המתקבל של DALBAVANCIN ו-P 80 הוא כפול מהריכוז הסופי.

מכיוון שתוספת החיסון תביא לדילול אחד עד שניים באמצעות פיפטה רב-ערוצית עם קצות סטריליים, יש להוציא 50 מיקרוליטר מכל דילול של dalbavancin לבארות המתאימות של פאנל המיקרו דילול סטרילי של 96 בארות. פורמט לוחית ה-MIC מאפשר לבדוק שמונה מעקנים לכל צלחת. אם לא ישתמשו בלוחות באופן מיידי, יש למרוח סרט פלסטיק כדי לאטום אותם, ואז להניח אותם בשקיות ניילון ולאחסן אותם במקפיא שאינו מפשיר לפחות מינוס 60 מעלות צלזיוס עד שהם נחוצים.

בהדגמה זו תחוסן צלחת טרייה אחת. להכנת החיסון, בחר מספר מושבות מבודדות היטב ממקדחת דם של 18 עד 24 שעות או צלחת מקדחה לא סלקטיבית אחרת. כאן משתמשים בזנים קשים של בקרת איכות ו- EPHI.

געו בחלק העליון של כל מושבה עם ספוגית סטרילית והעבירו חלק ממנה לצינור המכיל 1 עד 5 מיליליטר C-A-M-H-B או מי מלח. המשיכו להעביר עד שהעכירות תתאים לתקן של 0.5 מקפרלנד תוך 15 עד 30 דקות מההכנה, דללו את החיסון 1 ל-100 ב-C-A-M-H-B כדי להגיע לריכוז סופי של חמש פעמים 10 ל-CFU החמישי למיליליטר. הטווח המקובל הוא שתיים עד שמונה פעמים 10 עד החמישי CFU למיליליטר.

מיד בעזרת פיפטה רב ערוצית עם קצות סטריליים, העבירו 50 מיקרוליטר מהחיסון הסופי לכל באר מתאימה של לוחית לוח ה- MIC כאן. ארבע שורות מחוסנות בכל אחד משני המבודדים בסך הכל ארבעה שכפולים לכל מבודד. לאחר מכן, כדי לבצע בדיקת טוהר, השתמש בפיפטה כדי להעביר 1 עד 10 מיקרוליטר מהתמיסה בבקרת הצמיחה החיובית לאגר לא סלקטיבי, כגון נסה את אגר הסויה של ריקבון עם 5% דם כבשים.

השתמש בלולאה סטרילית כדי לפזר את התמיסה על פני הצלחת. סובב את הצלחת 90 מעלות ופס שוב כדי להבטיח שהחיסון יתפזר באופן שווה. מכסים את הצלחת ומניחים בצד.

כהכנה לספירת מושבות, השתמש בפיפטה חד-ערוצית כדי להעביר 10 מיקרוליטר מהתמיסה בבאר בקרת הגידול ל-10 מיליליטר של תערובת מלח, ולאחר מכן להעביר 100 מיקרוליטר למדיום חקלאי לא סלקטיבי מתאים, כגון נסה אגר סויה עם 5% דם כבשים באמצעות לולאה סטרילית, לפזר את התמיסה על פני כל פני השטח החקלאי. חזור על תהליך זה פעמיים בכיוונים שונים כדי להבטיח פיזור אחיד של החיסון. לאחר מכן, ערמו עד ארבעה לוחות מיקרופון במיכל פלסטיק וודא שהפאנל העליון אטום היטב עם מכסה.

לאחר מכן הניחו מגבת נייר לחה בתוך מיכל הפלסטיק וסגרו אותה היטב עם המכסה תוך 30 דקות מרגע החיסון. דגרו את לוחות המיקרופון, לוחית ספירת המושבה ולוחית בדיקת הטוהר בחממת אוויר סביבתית בטמפרטורה של 35 פלוס מינוס שתי מעלות צלזיוס למשך 16 עד 20 שעות. למחרת, קרא את ריכוז המעכב המינימלי כריכוז הנמוך ביותר המעכב לחלוטין את צמיחת החיידקים בבארות כפי שזוהה על ידי עין בלתי.

קבע את מספר המושבות בלוחית ספירת המושבות. הכפל את המספר שנספר במקדם הדילול. לדוגמה, 50 מושבות כפול מקדם דילול של 10, 000 שווה חמש כפול 10 ל-CFU החמישי למיליליטר.

טווח מקובל הוא 20 עד 80 מושבות, השווה לשתיים עד שמונה פעמים 10 למושבה החמישית היוצרת יחידות למ"ל. ריכוז החיסון הוא משתנה חשוב לשליטה בבדיקת הרגישות על מנת להשיג תוצאות מדויקות. לבסוף, בדוק את לוחית הטוהר.

אם כל המושבות דומות למושבות המשמשות כחיסון, אז זה יכול להיחשב טהור. אם קיימות מושבות אחרות, אז יש פוטנציאל לנוכחות מזהם בפאנל ה-MIC ויש לחזור על הבדיקה. תוצאות DAL bevans, MIC הושוו לאלו שהתקבלו בשיטת הדילול החקלאי כפי שמוצג כאן.

תוצאות ה-Agri MIC עבור Dal bevans בדרך כלל גבוהות פי שניים עד שמונה ממרק. מיקרו דילול, תוצאות MIC. ניגוד זה נובע מתוצאות ונקומיצין, שהן בשיטות מרק וחקלאות.

לכן, דילול חקלאי אינו מומלץ לבדיקת מרק dalbavancin dalbavancin. מיקרו דילול MIC, התוצאות לבקרת איכות צריכות להיות בטווחים הצפויים כפי שמוצג כאן. אורגניזם בקרת האיכות SS, TCC 2 9 2 1 3 עם מיקרופון מודאלי ברור מאוד של 0.06 מיקרוגרם למיליליטר היה אינדיקטור טוב לשונות השיטה.

אם התוצאות המתקבלות הן מחוץ לטווחים הצפויים עבור אורגניזמי בקרת האיכות או במגמה לקצה הנמוך או הגבוה של הטווח, יש צורך באימות נוסף של השיטה. בנוסף לאימות השיטה באמצעות אורגניזמים לבקרת איכות, נתוני dalbavancin, MIC מתוכניות מעקב אנטי-מיקרוביאליות אזוריות יכולים לספק בסיס לתוצאות MIC הצפויות במסגרת המעבדה הקלינית כפי שמוצג כאן, Dal b Anson MIC, תוצאות עבור מבודדים שנאספו באירופה ובארה"ב בשנים 2011 עד 2013 היו פחות מ-0.25 מיקרוגרם למיליליטר עבור 99.9% מיחידות ה-SIU ו-100% מהסטרפטוקוקים. בהתבסס על נתוני מעקב אלה, ברור כי תוצאות ה-MIC של דלבנצין עבור סטפילוקוקים וסטרפטוקוק הגדולים מ-0.12 מיקרוגרם למיליליטר הן נדירות.

אם נראים מספרים גבוהים יותר, יש לחזור על הבדיקה או לשלוח אותה למעבדת ייחוס לצורך אימות. הכנת דילול המלאי ב-DMSO והוספת P 80 לדילול המרק בריכוז של 0.002% בבאר ה-MIC הסופית הם השלבים הקריטיים להשגת תוצאות MIC מדויקות וניתנות לשחזור של dalbavancin כמו תמיד, אך במיוחד בתחום זה של התפתחות עמידות חיידקית, תוצאות רגישות אנטי-מיקרוביאליות מדויקות הן קריטיות לבחירת הטיפול המתאים על ידי הרופא.