הזרקת גישת subretinal Limbal של ויראלי וקטורים לטיפול גנטי בעכברים הרשתית פיגמנט האפיתל

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעביר גן מטרה לאפיתל הפיגמנט ברשתית בעכבר חי. זה מושג על ידי פתיחת העפעף תחילה והבלטת גלגל העין כדי לחשוף את קו המשווה. השלבים הבאים הם ליצור חור קטן אחורי ללימבוס.

הזרקו את הווקטורים הוויראליים לחלל התת-רשתית ממחט קהה והתבוננו בהיווצרות בלבוב תת-רשתית. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית משמשת להצגת הביטוי של סמני פלואורסצנציה המועברים על ידי הנגיף המוזרק באפיתל הפיגמנט של הרשתית. זוהי EEG וטכניקה נוחה להזרקה תת-רשתית של וקטור ויראלי לפיגמנט רשתית.

אפיתל הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שבדיקת ההזרקה התת-רשתית קשה לריאות. למתחילים. ראשית, הכינו מזרק מיקרוליטר עם מחט קהה בגודל 33 לעקר באמצעות גז תחמוצת אתילן.

לאחר מכן, הכינו דילול של הווקטורים הוויראליים ב-PBS בצינור מיקרו-פוגה בכמיליון יחידות טיטר למיקרוליטר. כעת, בעת טעינת המזרק, יש לשטוף אותו מספר פעמים בתמיסה כדי להסיר שטח מת במזרק. קבל 1.5 עד שני מיקרוליטר מוכנים להזרקה עם הזרקת הווקטור הנגיפי.

עכבר בוגר מרדים מוכן עם זריקה תוך צפקית של לנטה דיאזפם וסליין אישר כי החיה הורדמה בהיעדר רפלקסים. לאחר אישור ההרדמה, הרחב את האישונים עם טיפה של 0.5% פנילפרין ו-0.5% ide כעת תחת מיקרוסקופ ניתוח, פתח את העפעף והבליט את העין. לחשוף את קו המשווה.

החזק את העין במצב זה על ידי הנחת האצבעות מחוץ לשפת המסלול. לאחר מכן, מרחו תמיסה ויסקו-אלסטית עיניים על משטח הקרנית והניחו שקופית כיסוי עגולה קטנה מעל הקרנית. כך ניתן לראות את הרשתית כעת מעט אחורית ללימבוס ונחותה בעין ימין או עליונה בעין שמאל.

השתמש בחצי מחט סטרילית בגודל 30 כדי ליצור חור קטן הממוקם זמנית או מונח באף. חורים הם לא בחירות טובות מכיוון שקשה לכסות אותם. בזמן הניקוב, אל תפגע בכלי הדם הלימבלי או בעדשה ואל תכניס את כל הקרב של המחט לזריקות התת-רשתית.

הכנס את מחט ההזרקה הווקטורית דרך החור בזווית של 45 מעלות למישור הקשתית. דחוף את המחט לאחור לכיוון האזור ההיקפיאלי. עוקבים אחר השביל המסומן כדי לחצות את חלל הזגוגית.

התקרב למחט לתוך החלל התת-רשתית עד שתורגש התנגדות קלה, מה שמעיד על כך ששכבת ה-RPE הושגה כדי לא לחדור לרקמת הסקלר בלחץ מוגזם מכיוון שיש למקם את המחט בחלל התת-רשתית הפוטנציאלי. אם המחט מנקבת את רקמת הקלאל בעוצמה מוגזמת, היא נכנסת לחלל המסלול החוץ-עיני ללא התנגדות. כעת הזריק בעדינות את הווקטור הנגיפי לחלל התת-רשתית.

שמור על המחט דוממת מאוד כדי למנוע נזק לרקמות, וזה חשוב מאוד. לאחר מכן משוך את המחט באותה עדינות. עכשיו ניתן לשחרר את גלגל העין.

בלבינג תת-רשתית המעיד על הצטברות וקטור צריך להיות גלוי. לבסוף, סגור בעדינות את העפעף כדי לכסות את מקום ההזרקה. איטום עצמי של החור יתרחש.

כדי להעריך את העברת הגנים, יש להקריב את העכברים באמצעות חנק פחמן דו חמצני, ולאחר אישור המתת חסד. גרעין את העיניים באמצעות מספריים. קבעו את העיניים ב-4% PFA בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות, אך רצוי כמה ימים לאחר מכן.

אחזו וניקבו את הקרנית בעזרת מלקחיים ומספריים מיקרו. לאחר מכן cu לאורך הלימבוס כדי להסיר את הקרנית לאחר הסרת הקרנית. השתמש במלקחיים כדי להסיר את העדשה.

לאחר מכן, חתוך את הגוף הריסי. לאחר מכן משוך את כל הרשתית מקומפלקס RPE Choroid Sclera לאחר הסרת הרשתית. חותכים את הקומפלקס באופן רדיאלי מהפריפריה למרכז ליד עצב הראייה כדי ליצור ארבע עד שמונה צורות דמויות דוושה ולהפוך את המבנה לשטוח להרכבה.

כעת, הפוך את הקומפלקס על צד RPE כלפי מטה וחתוך את כל הרקמות שנותרו בצד הסקלרלי, כולל שרירים, לחמית ועצב הראייה. זה הופך את קומפלקס RPE Cort השטוח לשטוח שטוח על מגלשת זכוכית. סופגים את עודפי ה- PBS בעזרת ספוג סופג.

מרחו כ -30 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה וכסו את המתחם. אחסן את השקופית בארבע מעלות צלזיוס כאשר אינך מוצג. באמצעות הפרוטוקול המתואר הוזרקו וקטור LV זמין מסחרית עם מקדמי CMV המבטאים הן GFP והן RFP.

העיניים הוסרו לאחר 10 שבועות והוכנו מגלשות RPE שטוחות. עוצמות האותות של GFP ו-RFP השתנו בין תאי ה-RPE באתר ההזרקה, וההתמרה הוגבלה לאזור שבו נוצר הדם בהזרקה. הגדלת ההגדלה מארבעה DX ל-400 x אפשרה להעריך את הפתולוגיה של ה-I ברזולוציה רבה עוד יותר.

למרות שלא מוצג כאן, התאים המומרים ביטאו וקטור גם 36 שבועות לאחר ההזרקה. אחד שולט בהם. טכניקה זו יכולה להיעשות תוך חמש דקות אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור למקם את המחט או באופן יצירתי ועמוק לתוך החלל התת-רשתית לאחר התפתחותה. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום רפואת העיניים לחקור ריפוי גנטי לטיפול בלידה, פתיה תורשתית מונוגנית וניוון מקולרי הקשור לגיל.