Photopatterning חלבונים ותאים בסביבה מימית שימוש Tio

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבצע מודיפיקציה של פני השטח של פיגום לתרבית תאים באמצעות הפעילות הפוטוקטליטית של טיטניום דיאוקסיד. מטרה זו מושגת על ידי השקעת שכבה דקה של טיטניום דיאוקסיד על גבי כיסוי זכוכית (cover slip), ולאחר מכן ציפיו באוקטדסלין כדי להפוך את כל פני השטח להידרופוביים. כשלב שני, התשתית נחסמת על ידי טבילה בתמיסת תרבית תאים המכילה סרום אלבמין.

האלבומין נספח לפני השטח והופך אותם לבלתי מאפשרים להיצמדות תאים. לאחר מכן, הדגימה מועברת לתמיסה מימית המכילה קולגן, ואור UV ממוקד משמש להקרנת הפני השטח. פעולה זו מאפשרת למולקולות קולגן להיספח באופן סלקטיבי לאזור שהוקרן, ובכך הופכת אזור זה למאפשר להיצמדות תאים.

ניתן לחזור על תהליך זה על מנת ליצור תבניות של חלבונים או סוגי תאים מרובים. בסרטון זה אנו מראים כיצד ניתן לשנות באופן סלקטיבי את האזור הדביק של תאי PC 12 באמצעות הקרנת UV. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר הבנו שפוטוקטליזה של טיטניום דו-חמצמתי מיושמת מסחרית בחלונות זכוכית לניקוי עצמי המסירים מזהמים אורגניים מהפני השטח בעקבות קרינת אור, מה שמוכיח כי הפרוצדורה תהיה יעילה; חיפוש אחר סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי.

התחילו במספור של זכוכית הכסייה באמצעות שרטטן יהלום, באופן שיסייע בהבטחה שהצד הנכון של הדגימה פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, נקו את זכוכית הכסייה תחילה תחת זרימה של מים מזוקקים פעמיים, ולאחר מכן על ידי טבילה בתמיסת פיראנה למשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, שטפו את זכוכית הכסייה שמונה פעמים במים מזוקקים פעמיים ויבשו אותן תחת זרימת חנקן.

בשלב הבא, מקמו מטרת טיטניום תחמוצה במערכת התספיריות בתדר רדיו (RF sputtering), ולאחר מכן הצמידו את כיסויי הזכוכית הנקיים למחזיק הדגימה באמצעות סרט פוליאמיד. הניחו את מחזיק הדגימה בתא ההספיריות והוואקיעו את התא עד שהלחץ יגיע ל-2.0 times 10⁻⁴ pascals. לאחר מכן, הכניסו גז ארגון לתא וקבעו את לחץ השקיעה ל-4.0 mTorr תוך השארת התריס סגור. הגבירו בהדרגה את הספק ה-RF ל-70 watts.

לאחר מכן, פתחו את התריס ובצעו התזה (sputter) למשך 15 דקות כדי לקבל שכבה בעובי של 120 עד 150 nanometers. התחילו בייבוש כוס כימית מזכוכית ופינצטה בתנור בטמפרטורה של 120 °C למשך 30 דקות. לאחר מכן, הניחו את לוחות הכיסוי במגיב פלזמה וטיפלו במשטח הטיטניום הדי-אוקסיד בפלזמה של חמצן למשך חמש דקות בהספק של 200 watts ובזרימת חמצן של 100 standard cubic centimeters per minute כדי ליצור משטח הידרופילי יותר.

לאחר מכן, הוציאו את הדגימות ושקיעו אותן במים מזוקקים פעמיים כדי לוודא שהמשטח הוא סופר-הידרופילי, ויבשו את המשטח ביסודיות תחת זרימת חנקן. לאחר מכן, העבירו את הדגימות, את הכלי היבש ואת הפינצטה לתוך שקית כפפות מלאה בחנקן, והכינו תמיסה של 1 mM של Octadecyltrichlorosilane המומס בטולואן. השקיעו את הדגימה בתמיסה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי ליצור שכבה מוניתית המרכיבה את עצמה (self-assembled monolayer) על גבי תחמוצת הטיטניום.

לאחר מכן, הסירו שאריות של מולקולות פאזור על ידי שטיפה של הדגימה בטולואן, אצטון ואתנול, ולבסוף במים מזוקקים פעמיים למשך חמש דקות כל אחד. לאחר מכן, שטפו את הדגימה ארבע פעמים במים מזוקקים פעמיים טריים וייבשו את הפני השטח תחת זרימת חנקן.

יש לעקר את כיסורי הזריקה המצופים על ידי טבילת הדגימות ב-70% ethanol למשך חמש דקות. לאחר מכן, יש לשטוף את הדגימות פעמיים במים מזוקקים כפולה (double distilled water) סטריליים. לאחר מכן, יש להניח את הדגימה בצלחת בקוטר 35 מילימטר ולהוסיף שני מיליליטר של מצע גידול PC 12.

דגרו את הדגימות למשך שלוש שעות לפחות באינקובטור עם באפר CO2 בטמפרטורה של 37 °C, בזמן שאלבמין הסרום במצע נספח לפני השטח של כיסויי הזכוכית (cover slips). הכינו את מיקרוסקופ הפלואורסצנציה ההפוך על ידי הדלקת מנורת הקשת. לאחר מכן, הכניסו את קוביית מסנן ה-UV וסובבו את העדשה לאובייקטיב בעלת הגדלה של 20x.

מדוד את עוצמת האור באמצעות מד עוצמת UV וחשב את זמן ההקרנה עבור מינון של 200 joules per square centimeter. לאחר מכן, השתמש במיקרומטר של השולחן וכוון את קוטר האזור להקרנה ל-200 microns באמצעות כיוון דיאפרגמת השדה. לאחר דגירה של שלוש שעות, הוסף למצע המכסה את לבישי הזכוכית (cover slips) כ-200 µL של 3.0 mg/mL Type four collagen.

לאחר מכן, העבירו את הפיתה בקוטר 35 מילימטר למסבב של המיקרוסקופ ומקדו את המיקרוסקופ על פני השטח של הדגימה באמצעות סימני השריטה. הקרינו אזור של זכוכית הכיסוי באור UV במינון של 200 joules per square centimeter. לאחר מכן, החליפו את המצע בשני מיליליטר של מצע גידול טרי עם NGF וללא Type four collagen והחזירו את הדגימה לאינקובטור.

קצרו תאי PC 12 מובחנים באמצעות NGF שגודלו בתרבית אל תוך מבחנה קונית של 15 מיליליטר, וסובבו את המבחנה בצנטריפוגה במהירות של 150 ×g למשך ארבע דקות. לאחר מכן, שאבו את העילוי והוסיפו מיליליטר אחד של מצע גידול. השעיקו מחדש את התאים על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה באמצעות המוציא.

ספרו את צפיפות התאים והוסיפו 3.0 כפול 10 בחזקת 5 תאים לצלחית של 35 מילימטר המכילה את הלוחיות המכסוות המעובדות. דגרו את הצלחית למשך יום עד יומיים באינקובטור עם 5%CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, לאחר יום עד יומיים של תרבית על פני השטח המעובד של XC two. השתמשו במיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים נצמדים וגדלים אך ורק באזור שהוקרן ב-UV של הלוחיות המכסוות.

לאחר מכן, הוסף 67 microliters של קולגן מסוג ארבע לצלחית עם התאים המטופחים, כך שריכוז הקולגן הסופי יהיה 100 micrograms per milliliter, כאשר המיקרוסקופ מוגדר לתבנית פני השטח. הנח את הצלחית על במה המיקרוסקופ ומקם את אזור ההקרנה סמוך למיקום התאים הנוכחי. הקר את הזכוכית המכסה באור UV במינון של 200 joules per square centimeter.

לאחר ההקרנה, החליפו את המצע במצע נטול קולגן והחזירו את הדגימה לאנקובטור, תוך ניסיון להשלים את עיבוד הדגימה הבודדת בתוך 30 דקות. זוהי תמונת מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת בחתך רוחב של שכבת טיטניום דו-חמצני שהופקדה בשיטת התזה (sputter deposition). מהתבונית נאמד עובי השכבה לכ-150 ננומטרים.

ניתן להבחין כאן גם במישוריות של שכבת הטיטניום דאוקסיד שהטרספה. ניתוח נוסף באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי חשף כי השורש הריבועי הממוצע (RMS) של חספוס הפני השטח היה רק 0.2 ננומטרים. קולגן מסוג 4 והתמיסה נספחים באופן מועדף לאזור שהוקרן ב-UV, שם האלבומין מודחק על ידי הלייזר.

כדי להדגים את הרב-גוניות של גישה זו, חלבונים אחרים כגון פיברין דוגמו גם הם באמצעות אותה טכניקה. כאן תאים גדלים על האזור המודפס XC שני של כיסוי הזכוכית ובסמוך להם באזור המוגדר על ידי הקו המקווקו. כיסוי הזכוכית הוקרן לאחרונה בקרינת UV במקום שני וצופה בקולגן מסוג 4.

במהלך חמשת הימים הבאים, התאים מתרבים ונדודים כדי לכסות את האזור שקודד מחדש. ניתן להשתמש בנוהל המוצג כאן כדי לתמרן תאים בתרבית באופן שרירותי, וייתכן שניתן להשתמש בו כדי ליצור דפוסים של סוגי תאים מרובים לצורך בניית מערכות מורכבות של תרביות משולבות (co-culture).