תפקוד חלבון לימוד ותפקיד ביטוי חלבון לשנות על ידי הפרעת נוגדן שחזור תלת ממדי

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לחקור את תפקודי החלבון ואת התפקיד של ביטוי חלבון משתנה בצורה יעילה ומבוקרת היטב. זה מושג על ידי הפעלת נוגדנים כדי להפחית את כמות החלבון הפונקציונלי הזמין לתא. כדי להשיג זאת, נוגדנים מחוברים לפפטיד בשם מרכבה, המתווך מעבר על פני ממברנות התאים.

לאחר מכן, מבנים תאיים מעניינים מצולמים ומשוחזרים בתלת מימד על מנת להעריך את השפעות הטיפול. התוצאות מגלות כי פפטידי מרכבה מתאימים במיוחד לפגוע בחלבונים גרעיניים על ידי הפרעות נוגדנים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו הפרעות RNA הם שהנוגדנים המועברים לתא יעילים באופן מיידי, וכי החוקר עשוי לשלוט בקפדנות במידת ההפרעה על ידי התאמת מינוני הנוגדנים.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תפקודי חלבונים בסוגי תאים רבים, היא מעניינת במיוחד עבור התמקדות בחלבונים בתרביות עצביות ראשוניות, הרגישות מאוד לטיפולים אך סובלות את המרכבה היטב. בהכנה, השעו מחדש אבקת פפטיד מרכבה ליופילית במים סטריליים בשני מיקרוגרם למיקרוליטר. הקש בזהירות על הצינור כדי לערבב את האבקה לתמיסה.

לאחר מכן הכינו אליקוטים קטנים לעבודה, יש צורך בשני מיקרוליטר בלבד לכל תגובה, ואחסנו את האליקוטים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הכינו תאי יונקים לטרנספקציה על ידי זריעתם לצלחת של 24 בארות עם חצי מיליליטר של מדיום המכיל אנטיביוטיקה. כאשר משתמשים בנוירונים, זרעו את התאים רק בשתי השורות המרכזיות ובצפיפות נמוכה.

הבארות הריקות שימושיות מאוחר יותר. היו מהירים. נוירונים מתורבתים לא צריכים להיות מחוץ לחממה יותר מכמה דקות.

עד שהנוירונים נמצאים בשלב ההתפתחותי הרצוי, החליפו כרבע עד מחצית מהמדיום שלהם פעמיים בשבוע. יש להשתמש בתרביות לא עצביות כאשר התאים נמצאים במפגש של 50%. ההליך הבא מוצג עבור שש בדיקות ושש דגימות בקרה.

עבור כל מטען, הכינו דילול של 0.1 עד 2 מיקרוגרם ב-50 מיקרוליטר של 1X PBS לדגימה. קומפלקסים מקרומולקולריים של נוגדנים ראשוניים ומשניים קשורים מראש יכולים לשמש גם כמטען. מערבבים את התמיסה עם מערבולת עדינה, ואחריה צנטריפוגה קצרה.

לאחר מכן יש לדלל שני מיקרוליטר של תמיסת מלאי מרכבה ב-50 מיקרוליטר PBS לכל תגובה. השתמש בשפופרות נפרדות לכל דגימה על מנת למנוע אסוציאציה עצמית של המרכבה. כעת, שלבו את החלבונים המוכנים בדילול המרכבה.

מערבבים ומסובבים את החלבונים המשולבים. דגרו את הדגימה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר היווצרות מתחמי מטען מרכבות. כמות פפטיד החלבון האופטימלית תלויה במטען ובסוג התא בו נעשה שימוש.

לכן, יש לקבוע סכום זה באופן אמפירי. מראש, יש לחמם מראש מצע גידול כלשהו ללא תוספים וכן 1X PBS המכיל 0.5 מילי-מולרי מגנזיום כלוריד וסידן כלורי עד 37 מעלות צלזיוס. כעת, כדי להתחיל, יש לדלל את מתחמי המרכבות המוכנים ב -100 מיקרוליטר מדיום.

הסר את המדיום מהתאים המצופים והעביר לבארות הריקות לשימוש חוזר. לאחר מכן שטפו את התאים בעדינות עם 500 מיקרוליטר של תמיסת PBS 1X מחוממת מראש, סידן, מגנזיום כלוריד. מרחו את המדיום הנושא את קומפלקסי המרכבות על התאים ונדנדו את הצלחת בעדינות כדי להבטיח פיזור אחיד של התמיסה.

החזירו במהירות את התאים לחממה והמתינו שעה לפני הקודם. עבור נוירונים, לאחר שעה של דגירה, העבירו את המדיה שנשמרה לבארות. עבור כל התאים האחרים, הוסף סרום לריכוז סופי של 10%נוירונים מתורבתים רגישים מאוד, כגון לשינויים בטמפרטורת המדיה וב-pH.

לכן, יש לשטוף את התאים הללו ולהעביר אותם בעדינות עם תמיסות מחוממות מראש ולהחזירם לחממה בהקדם האפשרי. המשך בדגירה כל עוד יש צורך, תלוי במטען המועבר ובסוג התא. לאחר הדגירה, עבד את התאים לניתוחים הבאים כרגיל.

פרוטוקולי קיבוע, כמו גם הדמיה חיה, תואמים שניהם לטכניקה זו. באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר עם עדשת 63X, צלם תמונות במרחק של כ-0.25 עד 0.5 מיקרון על מנת להשיג ערימות Z בפירוט מספיק תוך הימנעות מהלבנה. מרחק השכבה המדויק תלוי בגודל המבנה שיש לשחזר ויש לקבוע אותו בנפרד.

לשחזור תמונה, פתח את קבצי ה-LSM ב-Imaris. עם תוכנה זו, כפתור ה-Escape משמש למעבר בין בחירה לניווט. כמו כן, ניתן לבחור אובייקטים מרובים על-ידי לחיצה ממושכת על מקש Control.

באמצעות התאמת התצוגה, היכנס לכל ערוץ והתאם את הניגודיות עד שהמבנים הבהירים ביותר יגיעו לרוויה. התאמה זו אינה משפיעה על בניית פני השטח אך היא מסייעת בסף התמונה. אם האובייקט שברצונך לשחזר כלול בקבצים שונים, השתמש בפונקציה Edit ו-Add Slices כדי לשלב את הקבצים המתאימים.

לאחר מכן, לחץ על הסמל הוסף משטחים חדשים ובחר פלח רק אזור עניין. כעת, התאם את השוליים של תיבת הבחירה כך שיתאימו למושא העניין. התאם את הצורה וההטיה של הצורה המלבנית עד שכל המבנים הנדרשים נמצאים בתוך הקופסה.

יש להתאים את הבחירה בכל תמונה לאורך כל מישור Z. חפצים לא רצויים עשויים להיות מוסרים מאוחר יותר. לאחר מכן, בחר ערוץ מתאים.

כדי להמשיך, השתמש בכלי הסף כדי לשחזר את מבנה העניין. יש להגדיר את רמת פירוט שטח הפנים, או קוטר הכדור, כך שיתאימו למבנים הנבנים מחדש. בהתאם למאפייני האות, ניתן להשתמש בעוצמה מוחלטת או בניגודיות מקומית.

בדרך כלל, ניגודיות מקומית עובדת טוב יותר עבור אותות מפוזרים. בשל המאפיינים של אות זה, ניגודיות מקומית משמשת לשחזור החלבון בתוך הגרעין. בכל מקרה, יש להתאים את ההגדרות בנפרד עבור כל אות או מבנה מעניין.

השלם את השחזור על ידי לחיצה על החץ הירוק בתחתית המסך. לאחר מכן התאם את האובייקט עוד יותר באמצעות הכלי Pencil. השוו בזהירות את השחזורים לאות המקורי, וחתכו והסירו משטחים על ידי הטיית התמונות לפי הצורך כדי שהכלי Cut יוכל לשרת את מטרתו במדויק.

כעת, מדוד את הנפח, השטח והעוצמות של כל משטח על-ידי בחירת סטטיסטיקה, סטטיסטיקה מפורטת וערכים ממוצעים. אם תרצה, ניתן להפיק סטטיסטיקה מקודדת צבע על ידי בחירת הכרטיסייה צבע של המשטח המתאים ושינוי האפשרות שנבחרה מבסיס לסטטיסטיקה מקודדת. באמצעות הכלי Take Snapshot, ניתן לצלם תמונות לפרסום.

אם יש לשחזר מספר אובייקטים באותו אזור, ניתן להשתמש בפונקציה פרמטרים של מאגר כדי לשמור את המידע. סימיאט המתבטא בתאי HEK293 זוהה במיוחד על ידי נוגדנים של סימיאט שהועברו לתאים על ידי פפטידים של מרכבה. מכלולי נוגדנים סימיאטים נכנסים לסומה כמו גם לגרעין, לאחר היישום, שם הם מתמקמים באופן ספציפי עם FLAG-Simiate כפי שמסומן על ידי החצים הצהובים.

באופן תלוי מינון, נוגדני סימיאט גרמו לאפופטוזיס מסיבי בתאי HEK293 בעוד שלנוגדני ביקורת לא הייתה השפעה. בהתחשב בכך שתאי עצב רגישים מאוד להשפעות רעילות, הטכניקה יושמה על תרביות היפוקמפוס ראשוניות בהן לא הייתה השפעה על הכדאיות של נוירונים כאשר השוו תאים מדומים, או לא מטופלים, לתאים שטופלו במרכבה. בעקבות אותה תוכנית יישום, מכלולי נוגדנים של עזים נגד שרקנים Alexa568 נצפו בכ-83% מהתאים שבהם הם הופיעו בסומטה כמו גם בגרעינים בהיקפים משתנים.

תצפיות אלה נתמכו עוד יותר על ידי ניתוח תלת מימדי, שהיה עקבי עם התוצאות מתאי HEK293. לפיכך, ניתן להשתמש בטכניקת המרכבה בהצלחה כדי להעביר נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס מנותקים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש עד שש שעות אם היא מבוצעת כראוי.

ההיווצרות המורכבת של המרכבה והחלבון המעניין אורכת כ-40 דקות. כדי להעביר את התאים עם קומפלקסים אלה, ייקח 70 דקות ושעה עד ארבע שעות נוספות, תלוי בגודל ובתכונות המטען. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות על מנת לנתח את תפקודו של חלבון ביתר פירוט, כגון הדמיה חיה ובדיקות תנועתיות, ניתוח ורישומים אלקטרופיזיולוגיים.