Microelectrodes כפולה קנה וקונצנטריים עבור אותות המדידה של תאי יון ברקמת המוח

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לזהות ולנתח דינמיקה של יונים בחלל החוץ-תאי של רקמת המוח. מדידה של תהליכים יוניים חולפים (ion transients) מבוצעת באמצעות מיקרו-אלקטרודות סלקטיביות ליונים, אשר ניתן להכין על בסיס תכנון של כפול-חבית (double barreled) או תכנון קונצנטרי. כשלב ראשון, המיקרו-אלקטרודות מכויילות באמבט הניסויי.

לאחר מכן, האלקטרודות מוחדרות לפרוסות אקוטיות של היפוקמפוס של עכבר לצורך הקלטה; כדי לעורר תזוזות יונים חוץ-תאיות, מספקים גלוטמט (transmitter glutamate) או אגוניסט של גלוטמט. הגלוטמט נקשר ופותח קולטנים יוניוטרופיים בקוצים פוסט-סינפטיים, מה שמאפשר זרימה של נתרן לתוך התאים וזרימה של אשלגן מחוץ לתאים. בסופו של דבר, הדבר מוביל לירידה ברמת הנתרן החוץ-תאי וכן לעלייה ברמת האשלגן החוץ-תאי, אשר מזוהים על ידי המיקרו-אלקטרודות הסלקטיביות ליונים.

שיטה זו משמשת לחקר ויסות יונים חוץ-תאיים ושינויים רגעיים (transients) של ברזל המושרים על ידי פעילות במוח. כאן אנו מתארים את ההכנה והכיול של שני סוגים של מיקרו-אלקטרודות סלקטיביות ליונים. אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בהן בחתכים של רקמת מוח חיה (acute) כדי למדוד שינויים בריכוזי אשלגן או נתרן חוץ-תאיים בתגובה למתן מוליכים עצביים.

הפרוצדורה תודגם על ידי Nicole Hark ו-Simon עבור המעבדה שלי. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, הכינו קפילרת זכוכית בורוסיליקט עם פילמנט לשימוש עבור גליל הרגישות ליונים, וקפילרה נוספת עבור גליל הייחוס המאוחר יותר. לאחר מכן, השתמשו בדבק דו-רכיבי או ברצועה קטנה של נייר אלומיניום כדי לקבע את הקפילרה הארוכה והקצרה יחד בשני הקצוות.

חממו את הקפילריה הכפולה בתנור בטמפרטורה של 60 °C למשך שעה אחת כדי להסיר לחות שארית. לאחר מכן, אחסנו את האלקטרודות במייבש עד לשימוש. מרכזו את הקפילריה הכפולה במותח אנכי עם תפס סיבובי. השתמשו בתפס כדי למנוע התארכות של הקפילריה.

יש להחזיק את הסליל בעדינות עד שהזכוכית תהיה רכה מספיק כדי לאפשר סיבוב אופקי של הריבולבר. לאחר הקירור, יש לסובב ב-180 מעלות ולהסיר את השבירה המכנית. החילו פרוטוקול חימום שני כדי למתוח את הנימירה, כך שיתקבלו שתי נימירות בעלות לוע כפול וחד.

קוטר הקצה של הנימי הכפול צריך להיות קרוב למיקרון אחד. כעת מלאו את בורר הייחוס עד לקצהו במים מזוקקים כדי למנוע התנחלות של מיקרואורגניזמים. בהמשך הפרוטוקול, הניחו נימי כפול-בורר כאשר קצהו פונה כלפי מעלה על גבי מעמד בהתאמה אישית.

לאחר מכן, הנח את התפסון על בקבוק בעל פיה רחבה המכיל HMDS שחומם מראש והדגר למשך 70 דקות. לאחר מכן, העבר את הקפילרה למעמד מתכת. בהמשך, הנח אותה בתנור שחומם מראש למשך שעתיים כדי לייבש את שני הגלילים לאחר הקולוניזציה, ושמור את הקפילרה יבשה בכלי ייבוש עד לשימוש.

ביום הניסוי, הכין את האלקטרודה הסלקטיבית ליונים על ידי מילוי קצה הגליל הסיליקוני בשני עד שלושה µL של החיישן הסלקטיבי ליונים. לאחר מכן, מלא את הגליל מהחלק האחורי ב-100 mM sodium chloride עבור מיקרו-אלקטרודה רגישה לנתרן, או ב-100 mM potassium chloride saline עבור מיקרו-אלקטרודה רגישה לאסודיום. הקפד לא להחדיר בועות אוויר נוספות במהלך הליך זה.

אם התהליך הצליח והחיישן התמלא כראוי, פני השטח של החיישן צריכים להיראות כמשטח קעור הנראה בבירור לעומת החומר הממלא (backfill). לאחר מכן, מלאו את תעלת הייחוס, הכניסו את חוטי הכסף המכלורים לשתי הקניות ואטמו כל קניה באמצעות שעוות דנטלית. בהליך זה, משכו קפילרה של 2 mm במשיכה האופקית כדי להשיג היטרוניקה (taper) קצרה וקוטר קצה של 4 µm.

ממש לפני השימוש, מלאו את הנימי הסיליקוני ב-0.2 µL של החיישן. כדי להכין את הנימה הפנימית, משכו נימה בעלת קוטר קטן כך שיתקבלו שתי נימות עם קונוסים ארוכים וקצוות חדים. לאחר מכן, מלאו אותן בתמיסת מלח של 100 mM sodium chloride או 100 mM potassium chloride.

הניחו את הקפילריה המלאה בחיישן ואת הקפילריה המלאה בתמיסת מלח בקו אחד זו לזו על פקק שהוקמה במיוחד מלוחיות כיסוי. הכניסו את הקפילריה הקטנה יותר באופן חלקי לתוך הקפילריה הגדולה יותר. לאחר מכן, קבעו את הקפילריות על לוחית כיסוי נוספת.

בעזרת חימר למידול, העבירו את הקפילריות לבמה של מיקרוסקופ והדמיאנהן באמצעות הגדלה של 100x. בעזרת מוט זכוכית המורכב על מיקרו-מניפולטור, הניחו את הקפילריה החיצונית להתקדם לאט מעל הקפילריה הפנימית עד שהמרחק בין הקצוות שלהן יהיה כחמישה מיקרון. קבעו את הקצה הפתוח של הקפילריה החיצונית אל הקפילריה הפנימית באמצעות שעווה דנטלית והחדירו חוט כסף.

להכנת אלקטרודת הייחוס, משוך קפילרית עם פילמנט במותח אנכי, השלך את הפ pipette העליונה, לאחר מכן פתח את תפסן המבט (chuck) התחתון והרם את הפ pipette התחתונה בכ-5 מילימטרים. סגור שוב את התפסן והרם אותו עד שקצה האלקטרודה התחתונה ימוקם בכ-5 מילימטרים מעל סליל החימום. לאחר מכן, חמם את הסליל והשתמש בפינצטה כדי לכופף את הקצה בזווית של כ-45 מעלות הצידה.

כופפו אותו שוב בערך במינוס 45 מעלות כדי לכוון את הקצה חזרה במקביל לציר הראשי. לאחר מכן, מלאו את חבית הייחוס בתמיסת HEBS (heaps buffered saline). הכניסו לתוכה תיל כסוף מכלור (chlorinated silver wire) ואטמו את החבית באמצעות שעווה דנטלית.

בשלב זה, חברו הן את האלקטרודה הרגישה ליונים והן את אלקטרודת הייחוס למיקרו-מניפולטורים והורידו אותן לתוך תא ניסוי המרוה עם A CSF. תחת מיקרוסקופ סטריאו, חברו את חוטי הכסף המכלורים לכניסות המתאימות בראש של המגבר הדיפרנציאלי. לאחר מכן, קבעו את התנגדויות האלקטרודות.

לאחר מכן, כוון את אותות המתח לאפס והתחל בהקלטה לצורך כיול. לאחר קבלת קו בסיס יציב, עבור לתמיסת סלין המכילה ריכוזים מוגדרים של היון למדידה. כעת, העבר פרוסת היפוקמפוס בעובי 250 micron אל תוך תא הניסוי וקבע אותה באמצעות רשת.

הורד את המיקרו-אלקטרודה הסלקטיבית ליונים שעברה כיול אל פני הפרוסה. לאחר מכן, הורד את האלקטרודה עוד כ-50 microns אל תוך ה-stratum radiatum של אזור CA1. כדי להחיל אגוניסט של מוליך עצבי, מלא את פיפטת ההחלה ב-0.5 millimolar glutamate.

חברו את הפיפטה למיקרו-מניפולטור וחברו אותה למכשיר להפעלת לחץ. לאחר מכן, הורידו את פיפטת ההגשה אל תוך הרקמה והניחו אותה בזהירות בקרבת קצה המיקרו-אלקטרודה הסלקטיבית ליונים. התחילו את הפעלת הלחץ ב-40 millibars.

מוצג כאן השינוי במתח של צינורות הייחוס של אלקטרודה כפולה (double barreled electrode) ואלקטרודה קונצנטרית בתגובה לשינויים בריכוז הנתרן באמבט. ואלו הם השינויים במתח של פוטנציאל הנתרן של אלקטרודה כפולה ואלקטרודה קונצנטרית בתגובה לשינויים בריכוז הנתרן באמבט. איור זה מציג גרף חצי-לוגריתמי של ריכוז הנתרן באמבט לעומת מתח פוטנציאל הנתרן של שתי האלקטרודות.

הגרפים הליניאריים חושפים שיפוע של כ-48 millivolts עבור שתי האלקטרודות. להלן התגובה של אלקטרודה בעלת שתי קנים (double barreled) ואלקטרודה קונצנטרית לשינוי מהיר באמבט: ריכוז נתרן מ-152 millimolar ל-70 millimolar.

שימו לב כי זמן התגובה של האלקטרודה הקונצנטרית מהיר משמעותית. איור זה מציג את התגובה החולפת של נתרן חוץ-תאי כפי שזוהתה על ידי אלקטרודות בעלות קנה כפול ואלקטרודות קונצנטריות; שינויים חולפים במתח של קני הייחוס ובריכוז הנתרן החוץ-תאי הושרו על ידי פרפוזיה של האמבט ב-10 millimolar אספרטט למשך 120 שניות, כפי שמסומן על ידי הפס. ובאיור זה, שינויים חולפים במתח של קני הייחוס ובריכוז הנתרן החוץ-תאי הושרו על ידי יישום לחץ מקומי של 10 millimolar גלוטמט למשך 0.2 שניות.

שימו לב כי זמן התגובה של האלקטרודה הקונית מהיר משמעותית בתנאי זה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי השחזה נכונה היא השלב המכריע בייצור מוצלח של מיקרו-אלקטרודות סלקטיביות לברזל. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן ההכנה והשימוש באלקטרודות אלו לזיהוי ברזל חוץ-תאי חולף ברקמת מוח.