דור וניתוח כמותי של תדר נמוך פעמו אולטראסאונד כדי לקבוע את הרגישות של סוניק שלא טופלו ותאים שטופלו neoplastic

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעריך את היעילות והשחזוריות של אולטרסאונד פולסי בתדר נמוך בפגיעה באוכלוסיות של תאי לוקמיה אנושיים, בנוכחות או בהיעדר חומר להפחתת כולסטרול. מטרה זו מושגת על ידי ניקוי מערכת הסוניקציה והערכת היציבות שלה. לאחר מכן, תאי הלוקמיה האנושיים עוברים סוניקציה בהיעדר ובנוכחות של methyl beta cyclodextrin.

בשלב הבא, נעשה שימוש בסופרי תאים אוטומטיים כדי להעריך את חיוניות התאים ואת ההשפעות של הסוניקציה והדלת כולסטרול. הפעילות המיטוכונדריאלית של תאי לוקמיה מוערכת באמצעותבדיקת XTT. בסופו של דבר, הנתונים מצביעים על כך שניתן להשתמש באולטרסאונד בתדר נמוך כדי לפגוע בתאים ממאירים, תהליך שמתחזק באמצעות שימוש בחומר להדלת כולסטרול.

המעבדה שלנו מתעניינת בטיפול ב-sonar namp, מודליות טיפולית חדשנית המשלבת את ההשפעות האנטי-נאופלסטיות של אולטרה-סאונד עם חומרים ייעודיים להגברת השפעות ה-son. הפרוטוקול שלנו מעריך את הרגישות הסונית של תאים נאופלסטיים ותאים נורמליים כדי לקבוע גישות כימותרפויטיות פוטנציאליות המצדיקות חקירה פרה-קלינית נוספת. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו עשויים להתקשות בשימוש בציוד המשמש להערכת יציבות מערכת ה-so, שכן למידת היישום האופטימלי של מכשירים אלה עשויה לדרוש זמן.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן נהלי הניקוי והייצוב המשמשים להערכת מערכת הסוניקציה הם חיוניים להשגת תוצאות הניתנות לשחזור. לפני תחילת הניסוי, השתמשו בכלורופורם ובמקלון צמר גפן כדי לנקות את החיבור שבין הקרן לממיר. לאחר מכן, מרחו שמן קל על ההברגות של הקרן והממיר.

כדי להסיר באופן יסודי שאריות מתכת, חלודה או הצטברות של תחמוצות, הסר את השמן וכל מזהם אחר מהחיבור באמצעות כלורופורם נוסף, ולאחר מכן חבר מחדש את הקרן (horn) לממיר. כדי להדק את המערכת במומנט נכון, משוך את הקרן מחלקו התחתון של הכוס והכנס מפתח חריץ (slot wrench) לאחד משלושת החורים הקטנים הנמצאים ליד החלק העליון של הממיר. כעת, מקם מפתח מומנט המצויד בראש מסוג רגל עורב (crow's foot) של חצי אינץ' על החלק החרוץ של הקרן והדק בכיוון השעון הסטנדרטי עד שמד המומנט יראה 39.99 foot pounds.

לאחר ההידוק, החזיר את המתמר ואת הקרן אל התחתית והצמד את החלקים למעמד טבעות במצב אנכי, חבר מחדש את המתמר לספק הכוח, ולאחר מכן הגדר את המערכת למתן מנות בפולסים. השתמש בשנייה אחת של סוניקציה עם שנייה אחת בין הפולסים, ולאחר מכן כוון את המערכת לאמפליטודות הרצויות כדי להעריך את העוצמה והתפקוד של מערכת ה-sauna Fire. התחל בהחזקת מד הקוויטציה במרחק של 1.5 סנטימטרים, תוך הקפדה שאין בועות על פני השטח של גשש המד.

קראו את המסך של מד הקוויטציה כדי לוודא שהמערכת פועלת בעוצמה המתאימה. לאחר מכן, טבלו לחלוטין את חיישן ההידרופון בתוך מבחנה המכילה 12.5 milliliters של מים, והשתמשו במעמד הטבעות כדי לתלות את ההידרופון. כדי לוודא את יציבות מאפייני גל הצורה, חברו את ההידרופון לכניסה של האוסילוסקופ ואשרו את נוכחותו של גל סינוס ברור, שכן גלים חריגים עלולים לשנות את ה-Frequency של המערכת.

כדי להכין את התאים לסוניקציה, ראשית, זרע אותם בריכוז של 4 × 10⁴ תאים למילילטר בבקבוקון של 25 סמ"ר באמצעות מצע טרי. לאחר קביעת מספר התאים החיים בשיטת הדירה של Trypan blue, דגרי את התרבית בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO₂ עד שהתרבית תגיע לריכוז הרצוי. כאשר התאים מוכנים לסוניקציה, השתמשי בוואקום ובבקבוקון בוכנר כדי לנכש גזים מנפח של מים מזוקקים ודה-יוניים.

לאחר מכן, השתמשו במים כדי למלא את קרן הכוס עד לגובה של 15 מילימטרים מעל קצה הקרן. הפעילו את המערכת עם מי ה-Degas למשך כשבע דקות. לאחר מכן, העבירו שלושה מיליליטרים של תאים לבקבוק ניצנוץ (scintillation vial) מזכוכית בנפח 20 מיליליטר, וחברו את הבקבוק למתקן ההחזקה.

בשלב הבא, הצמידו את התקן ההחזקה לחלק העליון של קרן הסוניקציה והשתמשו במנגנון ההחלקה כדי לקבוע את גובה התקן ההחזקה ל-15 מילימטרים מקצה הקרן בקו פני המים. כעת בצעו סוניקציה לתאים באמצעות שלושה פולסי אולטרסאונד של שנייה אחת, במרווח של שנייה אחת בין פולס לפולס, בעוצמה של 33% ו-50%, והעריכו את חיוניות התאים לאחר הסוניקציה באמצעות בדיקת הדירה של Tripan blue. כדי להעריך את הנזק לתאים, שטפו את פתח המדידה של אנלייזר חלקיקים מדגם Z2 לפחות פעמיים עם תמיסת סליין איזוטונית.

בשלב הבא, הוסיפו 100 µl של התאים שעברו סוניקציה ל-20 mL של תמיסת סלין איזוטונית, והעבירו את דגימת התאים למחזיק הספירה. לאחר מכן, העלו את הפלטפורמה עד לפתח ונתחו את נזקי התאים, החיוניות והפסוליות בהתאם להוראות היצרן. כדי להעריך את חיוניות התאים שעברו סוניקציה באמצעותבדיקת XTT, בצעו סוניקציה לתאים בטווח של אחת עד שלוש.

פולסים של שנייה אחת במרווחים של שנייה אחת כדי ליצור טווח של נזקים להערכה באמצעות ערכת XTT, לאחר מכן סבב תרחיף התאים (spin down) ותליה מחדש של המשקעים בריכוז של 10⁵ תאים למיליליטר במצע גידול שהוכן טרי. לאחר מכן, זריעה של 100 µL תאים לכל באר בלוחות מיקרוטיטר בעלי 96 באערים וקרקע שטוחה, בחוזרים threefold, כולל שלוש באערי בקרה המכילים 100 µL של מצע גידול מלא בלבד עבור קריאות ספיגה של דגימות ריק (blank).

דגרו את התאים למשך 24 שעות בבוקר הבדיקה, ערבבו בעדינות בסיבובים אליקוואות של XTT ושל ריאגנט ההפעלה שחוממו ל-37 °C עד שהתמיסות יהיו צלולות. לאחר מכן, הוסיפו 0.1 milliliters של ריאגנט ההפעלה ל-5 milliliters של ריאגנט XTT. לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של תמיסת XTT מופעלת לכל באר בלוחות המוחדרים ב-U 9 37 וב-THP one, והחזירו את התאים לאנקובטור לתרביות תאים.

לאחר שעתיים, נערו את הפלטות בעדינות כדי להפיץ באופן שווה את הצבע הכתום בבארים החיוביות ומדדו את הבליעה באמצעות קורא פלטות מיקרוטיטר בין 450 ל-500 ננומטר. לבסוף, מדדו שוב את הבליעה של כל בארי הבדיקה, בין 630 ל-690 ננומטר. כפי שצפוי, נצפה נזק תאי נרחב יותר באוכלוסיית התאים שעברה סוניקציה באמפליטודה של 50% מאשר זו שעברה סוניקציה באמפליטודה של 33%.

עם זאת, אמפליטודה של 33% מאפשרת זיהוי של נזקים נוספים בעת יישום של חומרים. כך גם בניסוי זה, שבו נבחנו ההשפעות התלויות במינון של החומר המדלל כולסטרול methyl beta cyclodextrin, על הגברת הרגישות האולטרסאונית של תאי U 9 37.

אף על פי שהתאים שעובדו במתיל בטא ציקלודקסטרין היו דומים בחיוניותם לתאים שלא עובדו, החיוניות ירדה באופן ניכר לאחר הפעלת שלושה פולסים של אולטרסאונד ב-40 kilohertz למשך שנייה אחת. יתרה מכך, נראה כי הירידה בחיוניות לאחר הסוניקציה הייתה תלוית מינון, שכן ריכוז של five millimolar של חומר המדלל את הכולסטרול גרם לירידה הגדולה ביותר במספר התאים, ואחריו טיפולים בריכוזים של one millimolar ו-0.5 millimolar של מתיל בטא ציקלודקסטרין, כפי שנמדד ב-XTT assay. למרות שנראה כי תאי THP one היו עמידים יותר לסוניקציה מאשר תאי U 9 37, שני קווי תאי הלוקמיה האנושיים ניזוקו באופן תלוי מינון.

בנוסף, השילוב של ריכוזים גבוהים יותר של methyl beta cyclodextrin עם מספר רב יותר של פולסי אולטרסאונד הניב את ההפחתה הנמוכה ביותר של XTT לנגזרת כתומה בהירה מסיסה הן בתאי U 9 37 והן בתאי THP one, מה שמעיד על חיות תא ופעילות מיטוכונדריאלית נמוכות יותר עבור שניים מקווי התאים. לאחר הליך זה, ניתן להעריך חומרי רגישות סוניים אחרים, כגון חומרים המכוונים לשלד התא או חומרים המייצרים מיני חמצן רבטיביים (ROS), לצורך בחינת הגברת הרגישות הסונית, ובכך לבסס גישות טיפוליות חדשניות שניתן לחקור את יעילותן הפרה-קלינית. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לארגן כראוי את נתוני ה-SON שנרכשו ממנייני ה-TC וה-Z two, שכן הם מספקים מידע מפורט על יעילות פרוטוקול הטיפול שעלול ללכת לאיבוד.

אם לא נעשה שימוש בתכנית לוגיסטית, לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשתמש באולטרסאונד בתדר נמוך בשילוב עם מחדירי תרופות (sensitizers) פוטנציאליים במודלים פרה-קליניים in vitro, כדי להעריך את התועלת הטיפולית הפוטנציאלית שלהם.